Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng baccillus thuringiensis sinh protein t...

Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng baccillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trung bộ cánh cứng

.PDF
63
144
106

Mô tả:

§¹I HäC TH¸I NGUY£N TR¦êNG §¹I HäC KHOA HäC PHïNG HUY TRäNG NGHI£N CøU §ÆC §IÓM SINH HäC MéT Sè CHñNG Baccillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THÓ DIÖT C¤N TRïNG Bé C¸NH CøNG LUËN V¡N TH¹C SÜ C¤NG NGHÖ SINH HäC TH¸I NGUY£N - 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong công trình nghiên cứu khác. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Tác giả Phùng Huy Trọng ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trƣớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ngô Đình Bính, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các giảng viên cùng các thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian học tập tại trƣờng và hoàn thành tốt luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những ngƣời đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Học viên Phùng Huy Trọng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN ................................. v MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3 1.1. Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis ............................................................. 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis ....................... 3 1.1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái ....................................................... 5 1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus .................. 6 1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa..................................................................... 7 1.1.5. Đặc điểm phân loại ................................................................................ 8 1.1.6. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng ............................ 13 1.1.7. Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis ....................................................................................................................... 14 1.1.8. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis .......................................... 15 1.1.9. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng ...................... 17 1.1.10. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc ....................................................................................................................... 19 1.2. Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dƣới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis ......................................................................................................... 20 1.2.1. Một số đặc điểm về gen cry3 ............................................................... 20 1.2.2. Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis .......................................................................................... 21 1.3. Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) .................................. 22 1.4. Tách dòng gen............................................................................................. 26 1.4.1. Khái niệm............................................................................................ 26 1.4.2. Vectơ tách dòng ................................................................................... 26 iv PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 28 2.1. Vật liệu........................................................................................................ 28 2.1.1. Sinh phẩm ............................................................................................ 28 2.1.2. Hoá chất và thiết bị .............................................................................. 28 2.1.3. Môi trƣờng ........................................................................................... 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 31 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập ......................................................................... 31 2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh ...................... 31 2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học .................................................... 32 2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt ................................ 33 2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A..................................... 34 2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A ...................................................... 34 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 38 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng. ............................................... 38 3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis ............................... 38 3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis ................... 39 3.2. Kết quả phân loại dƣới loài bằng phƣơng pháp huyết thanh...................... 40 3.3. Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ .......................................................................... 41 3.3.1. Xác định nồng độ bào tử...................................................................... 41 3.3.2. Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt phân lập .......................................................................................................... 41 3.4. Sàng lọc gen cry3A ở các chủng Bt bằng phƣơng pháp PCR..................... 43 3.5. Kết quả tách dòng gen và đọc trình tự gen cry3A ..................................... 44 3.5.1. Kết quả tách dòng gen cry3A............................................................... 44 3.5.2. Xác định trình tự đoạn gen cry3A........................................................ 47 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 51 v BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 Bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bt.t Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 E. coli Escherichia coli 7 EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid 8 LB Môi trƣờng Lauria Betani 9 PCR Polymerase chain reaction 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TAE Tris - Acetate - EDTA 13 X- gal 5 - Bromo - 4 Cloro - 3 indolyl ß - d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH2O Deion water vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H........................................................................................................................... 9 Bảng 1.2. Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng ...... 14 Bảng 1.3. Các điểm trình tự tham khảo của vectơ pGEM - T easy................... 27 Bảng 3.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất .............. 39 Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập ................................... 40 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt âú trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm. ................................................................ 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis ............................................... 5 Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ...................................... 6 Hình 1.3. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ......................... 18 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein Cry3A ............................................ 21 Hình 1.5. Một số hình ảnh về côn trùng bộ cánh cứng ..................................... 22 Hình 1.6. Ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành .............................................. 23 Hình 1.7. Chu kỳ sống và phát triển của mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) . 25 Hình 1.8. Vectơ tách dòng pGEM - T easy ....................................................... 27 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 280C sau 3 ngày .......................... 38 Hình 3.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập đƣợc khi nhuộm fushin và soi dƣới kính hiển vi điện tử. ........................................................................ 39 Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần ......................... 41 Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt phân lập…………………………………………………………43 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% ....................... 43 Hình 3.6. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi cấy qua đêm. ...................................................................................................... 44 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 trên agarose 1%. ................................................................................. 46 Hình 3.8. Kết quả PCR DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5 đã biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A ................................................. 47 Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1 ............................................................ 49 1 MỞ ĐẦU Côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) là bộ đƣợc biết đến với số lƣợng loài lớn nhất và đã có trên 250.000 loài đã đƣợc mô tả. Trong đó, rất nhiều loài thuộc bộ cánh cứng là những côn trùng gây hại nhƣ: Anomala, Tenebrio molitar… Chúng phá hoại mùa màng, nông sản, làm giảm chất lƣợng nông sản phẩm, và đặc biệt là lƣơng thực sau thu hoạch. Bên cạnh đó có nhiều loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng phá hại lâm sản làm thiệt hại rất lớn cho ngành công nghiệp sản xuất gỗ: Anobiidae (họ mọt gỗ), Cerambycidae (họ xén tóc), Bostrychidae (họ mọt dài)… Theo các báo cáo thống kê của nhiều nƣớc trên thế giới thì côn trùng thuộc bộ cánh cứng đƣợc xếp vào một trong những loài gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất. Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học đƣợc áp dụng để khắc phục tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thƣờng gây ra tính kháng thuốc trên côn trùng, đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng, góp phần làm mất cân bằng sinh thái và ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO), tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Môi trƣờng thế giới đã khuyến cáo hạn chế đến mức tối đa việc sử dụng các hoá chất và tăng cƣờng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học. Trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học đã và đang đƣợc sử dụng thì loại thuốc có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là có hiệu quả diệt sâu cao nhất. Hiện nay thuốc trừ sâu sinh học Bt chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới, và ngày càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi. Thuốc trừ sâu sinh học Bt có rất nhiều ƣu điểm tuy nhiên nhƣợc điểm vẫn chƣa khắc phục đƣợc của chế phẩm Bt là có phổ tác dụng hẹp - chỉ đặc hiệu với một vài loài côn trùng. Bản chất của sự đặc hiệu này là do các gen mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào của vi khuẩn quyết định. Trong số 70 nhóm gen cry đã đƣợc phát hiện thì gen cry3 là một trong số gen có thể mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng, một loài côn trùng rất khó 2 tiêu diệt hiện nay. Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết sức cần thiết. Xuất phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng”. Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành (Tribolium castaneum) cao. - Xác định đƣợc trình tự gen cry3A từ các chủng Bt subsp. tenebrionis đã tuyển chọn. Nhiệm vụ của đề tài: - Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang và Quảng Nam. - Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành. - Phát hiện gen cry3A bằng phƣơng pháp PCR. - Tách dòng gen cry3A mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng. - Xác định trình tự đoạn gen cry3A và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế. 3 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.1.1.1. Trên thế giới Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đƣợc coi là vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng. Năm 1870, Louis Pasteur đã phát hiện thấy một loại vi khuẩn gây bệnh ở tằm và đặt tên là Bacillus bombycos. Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa tiếp tục nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto. Năm 1911, Berliner (ngƣời Đức) đã phân lập đƣợc một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bƣớm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915. Ngay từ những năm 20 của thế kỉ 20, Bt đã đƣợc đƣa vào thử nghiệm trên đồng ruộng ở Châu Âu: Năm 1920, lần đầu tiên Bt đƣợc sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu ở Đức. Ở Pháp, năm 1938 Bt đƣợc sử dụng để diệt sâu hại lúa mỳ. Ở Mỹ, Bt đƣợc sử dụng vào năm 1950. Năm 1970, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc rằng Bt có khả năng diệt đƣợc côn trùng thuộc bộ cánh vảy là do nội độc tố . Cũng chính thời điểm này, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao. Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dƣới loài Bt subsp. israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera). 4 Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại đƣợc nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dƣới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera). Chủng này đƣợc phân lập từ bộ cánh cứng Tenebrio molitar. Năm 1985, gen cry của Bt đƣợc chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm 1995 các cây chuyển gen đầu tiên đã đƣợc đƣa vào sản xuất và ứng dụng. Từ năm 1987-1992, ngƣời ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất, từ đó mở ra một chƣơng mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp, cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen [1]. Năm 2003, Sakai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào ung thƣ. Năm 2005, Ohba M và Binh, N.D. đã phát hiện protein của 4 dƣới loài Bt phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thƣ cổ tử cung của ngƣời [45]. Trên thế giới từ lúc phát hiện ra vi khuẩn Bt mang gen mã hóa tinh thể protein diệt côn trùng, đã có rất nhiều nghiên cứu và ngày càng phát hiện ra nhiều gen cry mới góp phần vào sự đa dạng của ngân hàng gen Bt thế giới. 1.1.1.2. Ở Việt Nam Việt nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringensis (Bt) các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp. Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt đƣợc ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ thực vật năm 1971. Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp lên men trên mấy lắc và có chế phẩm diệt sâu rất tốt. 5 Năm 1973-1976, Bt đƣợc sản xuất chủ yếu trên môi trƣờng đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác nhƣ: Bã khô lạc, bột đậu tƣơng, bột cá,... Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc. Các chế phẩm này đã đƣợc sử dụng cho vùng trồng rau ở ngoại thành Hà Nội và đã thu đƣợc các kết quả tốt đẹp. Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phƣơng pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5 m3. Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lƣợng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt đƣợc mở rộng hơn. Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt nhƣ: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm... Tuy vậy cho tới nay ở nƣớc ta vẫn chƣa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp. 1.1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái Bacillus thuringensis (Bt) là vi khuẩn đất, có khả năng diệt côn trùng, đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes. Tế bào có dạng hình que, có kích thƣớc 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, bắt màu Gram dƣơng, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào. Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6 Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đƣờng kính có thể đạt tới 8-10 m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn. Mỗi tế bào Bt khi trƣởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng. Bào tử có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thƣớc 1,6-2 m. Bào tử đƣợc hình thành trong điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ nhiệt độ cao, môi trƣờng nghèo chất dinh dƣỡng… Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dƣỡng. Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng đƣợc tổng hợp. Tinh thể có kích thƣớc 0,6-2 m, có hình dạng không cố định có thể là hình lập phƣơng, hình lƣỡng tháp hoặc hình cầu. Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lƣợng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt [1, 3, 4]. Bào tử Tinh thể Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus Các loài thuộc nhóm B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [19]. Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại 7 Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme +(a) + + + + + + + + + +/-(b) +/- -(c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/ + + -(d) Phân hủy tyrosine + + +/- -(d) +/- Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với lòng đỏ + + + + - Lên men glucose kị khí + + + + - Phản ứng V-P + + + + - Sinh Axít từ mannitol - - - - + Làm tan huyết + + + -(d) - Sinh protein tinh thể - + - - - Nhuộm Gram Phản ứng catalase Khả năng chuyển động trứng Chú thích: Bc: Bacillus cereus a +: 90-100% số chủng phản ứng dƣơng tính Bt: Bacillus thuringiensis b +/-: 50-50% số chủng phản ứng dƣơng tính Bmy: Bacillus mycoides c -: 90-100% số chủng phản ứng âm tính Ba: Bacillus anthracis d -: hầu hết các chủng phản ứng âm tính Bme: Bacillus megaterium 1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Bt không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinose, xylose, manitol, nhƣng tạo axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose. Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không có khả năng khử amin của phenylalamin, không sử dụng axit citric, không khử muối sulphate. 8 Bt có khả năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 450C. Nhiệt độ tối ƣu là 28 - 300C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ƣu cho sự phát triển của Bt là pH = 7. Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden - Meyerhoff - Panas [1]. 1.1.5. Đặc điểm phân loại Có rất nhiều phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau. - Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa - Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên - H. - Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau. - Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể. - Phân loại theo loại hình enzyme lipase. - Phân loại theo nguồn bệnh. Tuy nhiên, các phƣơng pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế. Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh, mô tả 27 type huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp,… Phƣơng pháp phân loại theo type huyết thanh H đƣợc sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phƣơng pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tƣơng ứng. Số lƣợng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập đƣợc. Cho đến năm 2003, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 69 type huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis. Dƣới đây là bảng phân loại theo type huyết thanh H đƣợc trung tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur ở Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [2]. 9 Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H Kháng Thứ huyết Code Ngƣời đầu tiên nghiên cứu nguyên H thanh 1 Thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958 2 Finitimus FIN Heimpel & Angus 1958 3a, 3c Alesti ALE Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus 1958 3a, 3b, 3c 3a, 3d Kurstaki KUR Sumiyoshiensis SUM de Barjac & Lemille 1970 Ohba & Aizawa 1989 3a, 3d, 3e Fukuokaensis FUK Ohba & Aizawa 1989 4a, 4b Sotto SOT Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958 4a, 4c Kenyae KEN Bonnefoi & de Barjac 1963 5a, 5b Galleriae GAL Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi 1962 5a, 5c Canadensis CAN de Barjac & Bonnefoi 1972 6 Entomocidus ENT Heimpel & Angus 1958 7 Aizawai AIZ Bonnefoi & de Barjac 1963 8a, 8b Morrisoni MOR Bonnefoi & de Barjac 1963 8a, 8c Ostriniae OST Ren et al. 1975 8b, 8d Nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon 1984 9 Tolworthi TOL Norris 1964; de Barjac & Bonnefoi 1968 10a, 10b 10a, 10c Darmstadiensis DAR Londrina LON Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968 Arantes et al. (Không công bố) 10 Kháng Thứ huyết Code Ngƣời đầu tiên nghiên cứu nguyên H thanh 11a, 11b Toumanoffi TOU Krieg 1969 11a, 11c Kyushuensis KYU Ohba & Aizawa 1979 12 Thompsoni THO de Barjac & Thompson 1970 13 Pakistani PAK de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik & Viviani 1977 14 Israelensis ISR de Barjac 1978 15 Dakota DAK De Lucca, Simonson & Larson 1979 16 Indiana IND De Lucca, Simonson & Larson 1979 17 Tohokuensis TOH Ohba, Aizawa & Shimizu 1981 18a, 18b kumamotoensis KUM Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981 18a, 18c Yosoo YOS Lee, H. H et al. 1995 19 Tochigiensis TOC Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981 20a, 20b Yunnanensis YUN Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei 1979 20a, 20c 21 22 pondicheriensis PON Colmeri COL shandongiensis SHA Rajagopalan et al. (Không công bố) De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984 Wang Ying et al. 1986 23 Japonensis JAP Ohba & Aizawa 1986 24a, 24b Neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al. 1988 24a, 24c Novosibirsk NOV Burtseva, Kalmikova et al. 1995 25 Coreanensis COR Lee H. H et al. 1994 11 Kháng Thứ huyết nguyên H thanh 26 Silo 27 Mexicanensis Code Ngƣời đầu tiên nghiên cứu SIL de Barjac and Lecadet (Không công bố) MEX Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không công bố) 28a, 28b Monterrey MON Rodriguez-Padilla et al. (Không công bố) 28a, 28c Jegathesan JEG Seleena, Lee, H. L. & Lecadet 1995 29 Amagiensis AMA Ohba (Không công bố) 30 Medellin MED Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac 1992 Hodirev (Không công bố) 31 Toguchini TOG 32 Cameroun CAM Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al. 1994 33 Leesis LEE Lee H. H et al. 1994 34 Konkukian KON Lee H. H et al. 1994 35 Seoulensis SEO Lee H. H et al. 1995 36 Malaysiensis MAL Ho (Không công bố) 37 andaluciensis AND Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996 38 Oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al. 1995 39 Brasiliensis BRA Rabinovitch et al. 1995 Huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al. 1996 40 41 Sooncheon SOO Lee H. H et al. 1995 42 Jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al. (in press) 12 Kháng Thứ huyết Code Ngƣời đầu tiên nghiên cứu nguyên H thanh 43 Guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al. (in press) 44 Higo HIG Ohba et al. 1995 45 Roskildiensis ROS Hinrinschen, Hansen and Daamgaard (Không công bố) 46 47 Chanpaisis CHA Wratislaviensis WRA Chanpaisaeng (Không công bố) Lonc et al. 1997 48 Balearica BAL Caballero et al. (Không công bố) 49 Muju MUJ Seung Hwan Park et al.(Không công bố) 50 Navarrensis NAV Caballero et al. (Không công bố) Xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (Không công bố) 51 52 Kim 53 Asturiensis KIM Kim et al. (Không công bố) AST Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996 54 55 Poloniensis POL palmanyolensis PAL Damgaard et al. (Không công bố) Santiago-Alvarez et al. (Không công bố ) 56 Rongseni RON Li Rong Sen (in press) 57 Pirenaica PIR Caballero et al. (Không công bố) 58 Argentinensis ARG Campos-Dias et al. (Không công bố) 59 Iberica IBE Caballero et al. (Không công bố) 60 Pingluonsis PIN Li Rong Sen (in press)
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan