Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ở lào

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN -------------------- Keo Phommavong NGHIÊN CƢ́U ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦ A MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN ------------------ Keo Phommavong NGHIÊN CƢ́U ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦ A MỘT SỐ CHỦ NG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO Chuyên ngành: Sinh ho ̣c thƣc̣ nghiêm ̣ Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầ u tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t tới Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Quang Huy . Thầ y đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n tố t nhấ t , giúp em có thêm nhiều kỹ năng và kiến thức quý báu trong quá trình thực hiê ̣n đề tài luâ ̣n văn. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các Thầ y, Cô trong khoa Sinh ho ̣c , Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐHQGHN đã giảng da ̣y , truyề n đa ̣t cho em những kiế n thức bổ ích trong suố t hai năm ho ̣c qua. Em xin chân thành cảm ơn tới TS. Lê Hồng Điệp, Bộ môn Sinh lý thực vâ ̣t và Hóa sinh , Khoa Sinh ho ̣c cùng các thầy , cô, anh chi ̣và ba ̣n bè trong Khoa, Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã giúp đỡ em trong quá trin ̀ h thực hiê ̣n luâ ̣n văn này. Cuố i cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và ba ̣n bè đã luôn ở bên đô ̣ng viên, tạo động lực giúp em trưởng thành hơn trong suố t thời gian ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu khoa ho ̣c. Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2016 Học viên Keo Phommavong DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Chấ t kháng sinh đươ ̣c phát hiê ̣n [8, 38] ....................................................16 Bảng 2.1. Các địa điểm lấy mẫu đất .........................................................................25 Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định ..............................................................26 Bảng 3.1. Sự phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n .........................................................36 Bảng 3.2. Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được .....................................37 Bảng 3.3. Số lươ ̣ng sự phân bố của xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu .................................39 Bảng 3.4. Họat tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn..........................................41 Bảng 3.5. HTKS của xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu ........................................................42 Bảng 3.6. Khả năng hoạt tính của các chủng XK với nhóm vi khuẩn ......................43 Bảng 3.7. HTKS của các chủng XK trên môi trường tha ̣ch .....................................44 Bảng 3.8. HTKS của dich ̣ lên men của chủng XK trên môi trường dich ̣ thể ...........46 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng.. ...................................................................................................................................49 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng ......52 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng .............53 Bảng 3.12. Hoạt tính enzyme của 3 chủng xạ khuẩn ................................................55 Bảng 3.13. Hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ khác nhau của chủng L 4 ...................56 DANH MỤC CÁC HÌ NH VẼ , ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n [71] .............................................................................6 Hình 1.2. Khuẩ n ty xạ khuẩn [73] ...............................................................................7 Hình 1.3. Bào tử xạ khuẩn [70] ...................................................................................8 Hình 1.4. Hình thái vi khuẩ n S. aureus [72] ...............................................................9 Hình 1.5. Hình thái vi khuẩ n E. coli [72] ..................................................................11 Hình 1.6. Hình thái vi khuẩ n B. subtilis [72] ............................................................12 Hình 1.7. Hình thái vi khuẩ n B. cereus [73] .............................................................14 Hình 1.8. Mô ̣t số thuố c kháng sinh du ̣ng trong y ho ̣c nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [73]..20 Hình 1.9. Mô ̣t số kháng sinh du ̣ng bảo vê ̣ thực vâ ̣t nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [74].....21 Hình 1.10. Mô ̣t số thuố c kháng sinh du ̣ng trong chăn nuôi nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [75] ............................................................................................................................21 Hình 1.11. Mô ̣t số thuố c k háng sinh dụng trong bảo vệ thực phẩm nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [75] .................................................................................................................21 Hình 2.1. Hình mẫu đất thu thâ ̣p ta ̣i Lào ...................................................................25 Hình 3.1. Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n mo ̣c trên điã môi trường SCA và GI ........................38 Hình 3.2. Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu .........................................................40 Hình 3.3. Mô ̣t số chủng xa ̣ khuẩ n thuầ n khiế t ..........................................................40 Hình 3.4. HTKS của chủng XK trên môi trường tha ̣ch ............................................45 Hình 3.5. HTKS chủng XK trên môi trường dich ̣ thể ...............................................47 Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kin ́ h hiể n vi của chủng L4 .............................................................................................................47 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kí nh hiể n vi của chủng C3 .............................................................................................................48 Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kính hiể n vi của chủng T9 .............................................................................................................49 Hình 3.9. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng C3 ..............................................................................................................................50 Hình 3.10. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng L4....................................................................................................................51 Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng T9 ....................................................................................................................51 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng XK53 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng ..............54 Hình 3.14. Hoạt tính enzyme của 3 chủng XK .........................................................55 Hình 3.15. Hoạt tính chịu nhiệt enzyme của chủng L 4............................................56 Hình 3.16. Vị trí phân loại của chủng T9 dựa vào trình tự gen rARN 16S với các loài có quan hệ họ hàng gần......................................................................................58 NHƢ̃ NG CHƢ̃ VIẾT TẮT Chƣ̃ viế t tắ t: Chƣ̃ viế t đầ y đủ CFU Colony Forming Unit GI Môi trường Gause I SCA Starch Casein Agar LB Môi trường Luria Betarni CMC Carboxyl Methyl Cellulose VSVKĐ Vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ HTKS Hoạt tính kháng sinh MT Môi trường MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................................1 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài..............................................................2 3. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................2 4. Nô ̣i dung nghiên cứu ............................................................................................2 CHƢƠNG 1-TỔNG QUAN TÀ I LIỆU ...................................................................3 1. Giới thiê ̣u về xa ̣ khuẩ n ............................................................................................3 1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên...............................3 1.2. Đặc điểm sinh học-hình thái của xạ khuẩn.........................................................4 1.2.1. Cấ u ta ̣o tế bào của xa ̣ khuẩ n ......................................................................4 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn ..................................................5 1.2.3. Khuẩ n la ̣c của xa ̣ khuẩ n .............................................................................6 1.2.4. Khuẩ n ty của xa ̣ khuẩ n ..............................................................................7 1.2.5. Sự hình thành bào tử của xa ̣ khuẩ n ............................................................8 1.3. Sơ lươ ̣c về vi khuẩ n kiểm định ...........................................................................9 1.3.1. Vi khuẩ n Staphylococcus aureus ...............................................................9 1.3.2. Vi khuẩ n Escherichia coli ........................................................................10 1.3.3. Vi khuẩ n Bacillus subtilis ........................................................................12 1.3.4. Vi khuẩ n Bacillus cereus .........................................................................13 1.4. Đa ̣i cương về chấ t kháng sinh ..........................................................................14 1.4.1. Chấ t kháng sinh .......................................................................................14 1.4.2. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn. .....................................15 1.4.3. Sự hình thành chấ t kháng sinh ở xa ̣ khuẩ n ..............................................16 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ...............................18 1.5.1. Điề u kiê ̣n nuôi cấ y ...................................................................................18 1.5.2. Thành phần muôi trường nuôi cấy ...........................................................18 1.6. Sự ứng du ̣ng chấ t kháng sinh từ xa ̣ khuẩ n .......................................................19 1.6.1. Ứng dụng trong y học ..............................................................................19 1.6.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật ..............................................................20 1.6.3. Ứng dụng trong chăn nuôi .......................................................................21 1.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ thực phẩm ..........................................................22 1.7. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn ..............................................................22 1.7.1. Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n theo phương pháp truyền thố ng .........22 1.7.2. Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n theo phương pháp hiê ̣n đa ̣i .................23 1.8. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật .................................................23 1.8.1. Ứu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme .....................................23 1.8.2. Mô ̣t số enzyme có nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n ..............................................24 CHƢƠNG 2-NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U ...............25 2. Vâ ̣t liê ̣u nghiên cứu ...............................................................................................25 2.1. Mẫu đấ t .............................................................................................................25 2.2. Vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ ........................................................................................26 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ............................................................................26 2.3.1. Hóa chất ...................................................................................................26 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................26 2.4. Các môi trường dùng nghiên cứu .....................................................................27 2.4.1. Môi trường phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n .................................................................27 2.4.2. Môi trường xác đinh ̣ hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh .....................28 2.4.3. Môi trường kiể m tra khả năng sinh enzyme ngoa ̣i bào ...........................28 2.5. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu ....................................................28 2.5.1. Phương pháp lấ y mẫu đấ t ........................................................................28 2.5.2. Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n ..............................................................29 2.5.2.1. Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n theo Vinogradski ...............................29 2.5.3. Phương pháp thuầ n khiế t và bảo quản giố ng ...........................................30 2.5.4. Phương pháp quan sát hin ̀ h thái hê ̣ sơ ̣i xa ̣ khuẩ n ....................................30 2.5.5. Phương pháp lên men xa ̣ khuẩ n ...............................................................30 2.5.6. Phương pháp xác đinh ̣ hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh ..................30 2.5.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh .........................................30 2.5.6.2. Phương pháp đu ̣c lỗ ...............................................................................31 2.5.7. Phương pháp xác đinh ̣ khả năng tiế t enzyme ngoa ̣i bào .........................32 2.5.8. Phương pháp xác đinh ̣ khả năng chiụ nhiê ̣t của enzyme .........................33 2.5.9. Phương pháp tố i ưu mô ̣t số điề u kiê ̣n ảnh hưởng tới sự sinh tổ ng hơ ̣p ...34 chấ t kháng vi sinh vâ ̣t gâ ̣y bê ̣nh của các chủng xa ̣ khuẩ n ..................................34 2.5.10. Phương pháp đinh ̣ danh các chủng xa ̣ khuẩ n .........................................34 2.5.11. Phương pháp xử lý số liê ̣u ......................................................................35 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................36 3. Kế t quả phân lâ ̣p và tuyể n cho ̣n các chủng xa ̣ khuẩ n từ mẫu đấ t .........................36 3.1. Phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n ......................................................................36 3.2. Phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu ............................................39 3.3. Kế t qủa nghiên cứu các chủng tuyể n cho ̣n .......................................................41 3.3.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xa khuẩn.........................................41 3.3.2. Hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định .......................................43 3.3.3. Tuyể n cho ̣n các chủng xa ̣ khuẩ n có hoa ̣t tin ́ h kháng sinh .......................44 3.4. Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng xạ khuẩn ...........................................47 3.4.1. Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng L4.............................................47 3.4.2. Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng C3 ............................................48 3.4.3. Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng T9.............................................48 3.5. Ảnh hưởng các yếu tố của môi trường với chủng xạ khuẩn ............................49 3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl .................................................................49 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ...........................................................................52 3.5.3. Ảnh hưởng của pH ...................................................................................53 3.6. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn .....................................55 3.6.1. Khả năng hoạt tính enzyme của chủng xạ khuẩn ....................................55 3.6.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme chủng L4 .............................................56 3.7. Kế t quả đinh ̣ danh loa ̣i của chủng xa ̣ khuẩ n .....................................................57 3.7.1. Chủng T9 .................................................................................................57 A. Tài liệu tham khảo ................................................................................................61 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Xạ khuẩn là nhóm sinh vật nhân sơ (prokaryote) với số lươ ̣ng loài lớn và phân bố ở nhiề u vùng sinh thái khá c nhau trên thế giới và là đối tượng nghiên cứu quan trọng của ngành vi sinh vật. Nhóm vi sinh v ật đươ ̣c biế t đế n với nhiề u ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổ i thứ cấ p có giá tri ̣sử du ̣ng cao như các hợp chấ t y dươ ̣c , các chất kháng sinh và enzyme thủy phân hợp chất cao của phân tử . Các chất kháng sinh do xạ khuẩ n sinh ra đư ợc sử dụng rất nhiều trong y học, sinh học, trong công tác bảo vệ thực vật và trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người [6]. Sự ra đời của chấ t kháng sinh (CKS) do xạ khuẩ n có vai trò quan tro ̣ng trong nhiề u liñ h vực sản xuấ t và đời số ng . Trong y ho ̣c, CKS đươ ̣c sử du ̣ng để phòng và chữa bê ̣nh cho người . Trong chăn nuôi, CKS đươ ̣c sử du ̣ng để chữa bê ̣nh và tăng trọng cho vật nuôi . Trong nông nghiê ̣p , CKS đươ ̣c sử du ̣ng để thay thế thuố c hóa học và dùng làm chất kích thích sinh trưởng . Ngoài ra, chấ t CKS còn đươ ̣c sử du ̣ng để bảo quản th ực phẩ m,... [2]. Hiê ̣n nay, các loài chấ t kháng sinh rấ t phổ biế n trên thị trường nhưng công nghệ sản xuất chất kháng sinh lại chủ yếu tập trung vào một số nườc như Mỹ , Đức, Nhâ ̣t, Anh,...và là được bảo hộ chặt chẽ dưới dạng các sáng chế đô ̣c quyề n và lưu giữ trong từng cơ sở sản xuất công nghiê ̣p [20]. Trong xu hướng nghiên cứu để điề u chỉnh sinh tổ ng hơ ̣p chấ t kháng sinh của xạ khuẩn là tuyển chọn tạo ra các chủng xạ khuẩn công nghiệp mà có khá năng siêu tổ ng hơ ̣p chấ t kháng sinh và tố i ưu hóa các thành phầ n môi trường , thiế t bi ̣và điề u kiê ̣n lên men. Cứ công viê ̣c sử du ̣ng mô ̣t số chấ t đă ̣c hiê ̣u và các CKS không hơ ̣p lý để chữa bệnh đã làm cho hiện tượng kháng sinh xuấ t hiê ̣n , phát hiện , lan rô ̣ng và ngày càng gia tăng . Do vâ ̣y, viê ̣c tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học . Đến này, con người đã phát hiê ̣n khoảng 19.000 CKS có nguồn gốc từ vi sinh vật , hơn 3500 CKS bán tổ ng hơ ̣p và mỗi năm còn có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện , trong đó chủ yế u thuô ̣c chi Streptomyces 1 [10, 32]. Kháng thuố c là mố i lo nga ̣i và thách thức đố i với nề n y ho ̣c hiê ̣n đa ̣i . Trên thế giới, 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loài kháng sinh thường dùng trong điều trị . Vi khuẩ n E.coli, A. Baumannii, K.pneumoniae và P .aeruginosa đã kháng la ̣i tấ t cả các loa ̣i kháng sinh gồ m cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như carbapenem và cephalosporin [56]. Hiê ̣n nay, hiê ̣n tươ ̣ng kháng thuố c kháng sinh ngày càng trở nên phổ biể n và có xu hướng tăng nhanh . Do đó , trong viê ̣c nghiên cứu để tim ̀ ra các hơ ̣p chấ t mới từ tự nhiên có hoa ̣t tiń h kháng khuẩ n là vai trò quan tro ̣ng , cầ n thiế t trong những hướng nghiên cứu tro ̣ng tâm là xa ̣ khuẩ n . 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đối với Lào , sự nghiên cứu trong các ngành khoa ho ̣c sinh ho ̣c như vi sinh vâ ̣t học, sinh hóa ho ̣c, sinh ho ̣c phân tử , di tryuề n ho ̣c,... còn thiếu các loại thông tin cấ p cơ sở và tài liệu cầ n thiế t trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. Do đó , nghiên cứu này mong muố n sẽ góp phầ n vào trong công viê ̣c nghiên cứu khoa ho ̣c của Lào . Lào nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới với phong phú đa dạng sinh học của các nguồn tài nghiên thiên nhiên thực vật di truyền, đa dạng rộng lớn của các vi sinh vật và tiề m năng về lâm nghiê ̣p, nông nghiê ̣p và hê ̣ VSV mà khá phong phú , trong số đó có không nhiề u cũng ít loài xạ khuẩn sinh chất kháng sinh mà chưa được nghiên cứu và khám phá. Xuấ t phát từ nhu cầ u thực tế đó , chúng tôi đã tiế n hành thực hiện đề tài : Nghiên cứu đă ̣c điể m sinh ho ̣c của mô ̣t số chủng xạ khuẩn phân lâ ̣p từ đấ t ở Lào. 3. Mục tiêu nghiên cƣ́u  Phân lâ ̣p, tuyể n cho ̣n và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn từ đất ở Lào. 4. Nô ̣i dung nghiên cƣ́u  Phân lâ ̣p và tuyể n cho ̣n chủng xa ̣ khuẩ n có hoa ̣t tính kháng sinh vi sinh vâ ̣t kiể m đinh. ̣  Đánh giá thử hoa ̣t tiń h khán g sinh chủng xa ̣ khuẩ n với vi sinh vâ ̣t kiể m đinh. ̣ 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1. Giới thiêụ về xa ̣ khuẩ n 1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (XK) là mô ̣t nhóm vi khuẩ n Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. XK thuô ̣c ngành Tenericutes, thuô ̣c giới vi khuẩ n thâ ̣t (Eubateria), siêu giới nhân sơ (Prokaryota) và thuô ̣c lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bô ̣ Actinomycetales . Bộ bao gồ m 10 phân bô ,̣ 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm XK hiếm [11]. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hin ̀ h thành chất kháng sinh , 60 đến 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất mà có kh ả năng sinh chấ t kháng sinh [16]. Phân lớn các chấ t kháng sinh đươ ̣c sử du ̣ng hiê ̣u quả trong điề u tri ̣có nguồ n gố c từ các loài Streptomyces. Các chất kháng sinh đươ ̣c biế t đến nhất là streptomycin , erythromycin, tetracyclin,... Điề u đáng chú ý là các xa ̣ khuẩ n hiế m đã cung cấ p nhiề u chấ t kháng sinh có giá tri ̣đang dùng trong y ho ̣c như gentamixin, vancommixin, tobramixin,...[56]. Xạ khuẩn rấ t đa da ̣ng và phân bố rộng rãi trong tự nhiên có thể tìm thấ y trong hầ u hế t các môi tường như : đấ t, nước và xác thực vâ ̣t . Sự phân bố của xa ̣ khuẩ n còn ph ụ thuô ̣c nhiề u yếu tố như nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ pH môi trường , nồ ng đô ̣ NaCl . Xạ khuẩn có nhiều trong đất trung tính và ki ềm yế u hoă ̣c axit yế u với pH từ 6,8-7,5. Phầ n lớn xa ̣ khuẩ n thić h hơ ̣p phát tr iển trong khoảng nhiệt độ 25-30°C, mô ̣t số loài xạ khuẩn ưa nhiệt có nhiệt độ phát trển tối ưu từ 45-50°C. Xạ khuẩn phân bố nhiề u nhấ t ở trong đấ t và đóng vai trò quan tro ̣ng trong chu trình về mă ̣t sinh thái trong vòng tuần hoàn vâ ̣t chấ t trong tự nhiên [62]. Xạ khuẩn đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩ n ty phân nhánh tương tự như nấ m . Mô ̣t trong những đă ̣c điể m để phân loa ̣i xạ khuẩn là m ạng lưới phân nhánh của thể sơ ̣i , chúng thường phát triển ở cả bề mặt cơ chấ t rắ n (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hê ̣ sơ ̣i cơ chấ t ) [29]. 3 Theo Waksman thì trong mô ̣t gam đấ t có khoảng 29.000-2.400.000 mầ m xa ̣ khuẩ n, chiế m 9-45% tổ ng số vi sinh vâ ̣t [69]. Xạ khuẩn đóng vai trò quan tro ̣ng về mă ̣t sinh thái trong vòng tuầ n hoàn tự nhiên , chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong đấ t . Mô ̣t số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, đô ̣ng vâ ̣t nhưng có thể dùng để sản xuất enzyme như proteaza , cellulaza, amylaza,... mô ̣t số axit amin và axit hữu cơ [12]. 1.2. Đặc điểm sinh học-hình thái của xạ khuẩn 1.2.1. Cấ u ta ̣o tế bào của xa ̣ khuẩ n Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G (+), toàn bô ̣ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phàn chính như : thành tế bào , màng sinh chất , nguyên sinh chấ t , chấ t nhân và các thể ẩn nhập . Thành tế bào của xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiề u enzyme tham gia vào quá trin ̀ h trao đổ i chấ t và quá triǹ h vâ ̣n chuyể n vâ ̣t chấ t qua màng tế bào . Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới , dày 10-20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của k huẩ n ty và bảo vệ tế bào . Thành tế bào bao gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60Ao, lớp giữa và lớp trong dày khoảng 50Ao. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glycopeptide bao gồ m các gố c N -acetyl glucozamin liên kế t với N -acetyl muramic bởi các liên kế t 1,4-β glucozit [7]. Xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm [50] gồm: 1. Nhóm I: Xạ khuẩn không đươ ̣c t ạo ra những sợi nấm "mycelium". Ví dụ : Actinomyces (trong ho ̣ Actinomycetaceae). 2. Nhóm II: Mycobacteria, trong ho ̣ Mycobacteriaceae. Đại diện là chủng gây bệnh lao Mycobacterium tuberculosis. 3. Nhóm III: Xạ khuẩn cố định ni tơ. Ví d ụ Frankia, các chủng xạ khuẩn trong nhóm này tạo ra sợi giống nấm 4. Nhóm IV: Actinoplanes, chủng trong nhóm này t ạo ra sợi nấm và bào tử bên trong các túi bào tử "sporangia". Ví dụ Actinoplanes (họ Micromonosporaceae), Streptospora-ngium (họ Streptosporangiaceae). 5. Nhóm V: Dermatophilus, nhóm này t ạo ra sợi nấm sợi "mycelia filament", nhưng không tạo ra sợi nấm trên không "aerial mycelium". Ví dụ như 4 Dermatophilus (thuộc họ Dermatophilaceae), Geodermatophilus (thuộc họ Geodermatophilaceae). 6. Nhóm VI: Nocardias. Ví dụ như Nocardiaceae, gồm các chủng trong c hi Nocardia. 7. Nhóm VII: Streptomycetes, gồm các chủng tạo ra rất nhiều sợi nấm và bào tử thường gồm các chi Streptomyces, Streptoverticillium và Kitasatospora (họ Streptomycetaceae) và Sporichthya (họ Sporichthyaceae). 8. Nhóm VIII: Micromonosparas, nhóm này tạo ra sợi nấm và thường xuyên tạo ra bào tử đơn. Ví dụ Micromonospora (họ Micromonosporaceae), Microbispora (họ Streptosporangiaceae), Thermmoonospora (họ Thermomonosporaceae). 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzyme và các chất kháng sinh nên đươ ̣c ứng dụng vào nhiề u liñ h vực của đời số ng . Để phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n người ta sử du ̣ng các đặc điểm sinh lý , sinh hóa khác như khả nă ng đồ ng hóa các nguồ n cac bon, ni tơ, axit amin và nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng hay khả năng biến đổi các chấ t khác nhau nhờ hê ̣ thố ng enzyme . Nhu cầ u về oxy, giới ha ̣n pH, nhiê ̣t đô ̣ tố i ưu, khả năng chịu NaCl và các yếu tố khác của môi trường , mố i quan hê ̣ với chấ t kim ̀ hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau cũng là các đặc điểm của xạ khuẩn. Xạ khuẩn sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiề u hơ ̣p chấ t hữu cơ khác để làm nguồ n cacborn , amino axit, peptone, muố i nitrat để làm nguồ n nitơ. Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiế u khí , ưa ẩ m , mô ̣t số it́ ưa nhiê ̣t . Nhiê ̣t đô ̣ thić h hơ ̣p cho sự sinh trưởng là 25-30°C. Tuy nhiên, nhiê ̣t đô ̣ tố i ưu cho sinh trưởng hơ ̣p chấ t kháng sinh thường chỉ nằ m trong khoảng thích hợp đ ối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 18-30°C. Độ ẩm 40-50%, giớp ha ̣n pH trong khảng 6,8-7,5 [39]. Tuy nhiên trong nghiên cứu của Hopwood cho thấy rằ ng phầ n lớn các đ ặc điể m sinh lý- sinh hóa cũng đă ̣c điể m nuôi cấ y xạ khuẩn dễ biế n đô ̣ng và ít giá trị về mă ̣t phân loa ̣i [40]. 5 1.2.3. Khuẩ n la ̣c của xạ khuẩn Khuẩ n la ̣c của xạ khuẩn thường tròn, xù xì, rắ n chắ c, có dạng da , dạng vôi, dạng nhung tơ hay da ̣ng màng dẻo và có màu sắc rất đa dạng : hồ ng, da cam, vàng, nâu, trắ ng, xám,... tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh (hình 1). Khuẩ n la ̣c xạ khuẩn có kích th ước và khối lượng không ổ n đinh ̣ và phu ̣ thuô ̣c vào điề u kiê ̣n sinh lý và các điều kiện nuôi cấ y [12]. Khuẩ n la ̣c của xa ̣ khuẩ n khác so với nấ m mố c bởi hê ̣ sơ ̣i của nấ m mố c có đường kin ́ h lớn (từ 5-50 µm) và quan sắt được bằ ng mắ t thường. Đường kính của khuẩ n la ̣c chỉ chừng 0,5-4 mm nhưng cũng có khuẩ n la ̣c đa ̣t tới đường kiń h 1 cm hoă ̣c lớn hơn. Điể m nổ i bâ ̣t của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n là có hê ̣ sơ ̣i phát triển , phân nhánh ma ̣nh và không có vách ngăn . Hê ̣ sơ ̣i xa ̣ khuẩ n mảnh hơn nấ m mố c với đường kiń h thay đố i trong khoảng từ 0,2-1µm đế n 2-3 µm, chiề u dài có thể đạt tới mô ̣t vài cm [14]. Khuẩ n la ̣c có 3 lớp như: lớp vỏ ngoài có da ̣ng sơ ̣i bê ̣n chă ̣t , lớp trong tương đố i xố p và lớp giữa có cấ u trúc tổ ong . Khuẩ n la ̣c trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau , các sản phẩm trong quá trình trao đối chất như : chấ t kháng sinh , vitamin, đô ̣c tố , axit hữu cơ, enzyme,...có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường. Hê ̣ sơ ̣i cơ chấ t có thể tiế t vào môi trường các loại sắc tố , thường có máu xanh , nâu, đen, tím, hồ ng,... và có sắc tố chỉ tan trong nước, hoặc trong dung môi hữu cơ (hình 1.1). Hình 1.1. Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n [71] 6 1.2.4. Khuẩ n ty của xạ khuẩn Khuẩ n ty bắ t màu tương tự như vi khuẩn Gram dương , hoại sinh , hiế u khí không hình thành nha bào , không có lông và giáp mô , dạng phân nhánh hay dạng sơ ̣i dài , đa hình thái như da ̣ng hình chùy , dạng phân nhánh thành chùm , thành bó gọi là khuẩn ty . Khi nuôi cấ y trên môi t rường đă ̣c khuẩ n ty của xa ̣ khu ẩn phát triển thành 2 loại như: mô ̣t loa ̣i cắ m sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩ n ty cơ chấ t -subtrate mycelium ) với chức năng chủ yế u là dinh dưỡng và mô ̣t loa ̣i phát triể n trên bề mă ̣t tha ̣ch go ̣i là hê ̣ sơ ̣i khí sinh (khuẩ n ty khí sinh-aerial mycelium) với chức năng chủ yế u là sinh sản [39]. Hê ̣ sơ ̣i khuẩ n ty xa ̣ khuẩ n có màu sắ c rấ t đ a da ̣ng như: trắng, vàng, xám, đỏ... và có đường kính từ 0,2-1µm đến 2-3 µm, phát triển theo kiểu mọc chồi , đô ̣ dài khuẩ n ty xa ̣ khuẩ n trong giai đoa ̣n phát triể n là 11µm [67]. Khuẩ n ty thường có kích thước và khố i lươ ̣ng không ổ n đinh ̣ và phu ̣ thuô ̣c vào từng loa ̣i điề u kiê ̣n môi trường nuôi cấ y . Các loài xạ khuẩn khác nhau đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi , chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳ ng hay làn sóng hoă ̣c it́ . Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử, một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất, bào tử không có khả năng di động. Mô ̣t số xa ̣ khuẩ n không có sơ ̣i khí sinh mà chỉ có sơ ̣i cơ chấ t, làm cho bề mă ̣t xa ̣ khuẩ n nhẵn và khó tách ra khi cấ y tryuề n ; loại chỉ có sợi k hí sinh thì ngươ ̣c la ̣i, rấ t dễ tách ra toàn bô ̣ khuẩ n ty khỏi môi trường [28]. Hình 1.2. Khuẩ n ty xa ̣ khuẩ n [73] 7 1.2.5. Sƣ ̣ hin ̀ h thành bào tƣ̉ của xa ̣ khuẩ n Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩ n ty khí sinh, gọi là cuố ng sinh bào tử . Đây là cơ quan sinh sản đă ̣c trung cho xa ̣ khuẩ n . cuố ng bào tử của xa ̣ khuẩ n có da ̣ng thẳ ng hoă ̣c lươ ̣n sóng , dạng xoắn lò xo , chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu . Trên mỗi cuố ng sinh bào tử mang 30-100 bào tử, có thể mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuố ng sinh bào tử và bào tử là đă ̣c điể m quan tro ̣ng trong phân loại xạ khuẩ n [9]. Sự hiǹ h thành của bào tử của xa ̣ khuẩ n có 2 kiể u: kiể u kế t đoa ̣n (fragmentation) và kiểu cắt khúc (segmentation). Bào tử xạ khuẩn có nhiều hình thái dạng khác nhau , thường có hin ̀ h đơn, kép, trụ, ovan, hình que với kić h thước trung bình khoảng 0,7-0,9 × 0,7-1,9 µm. Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thâ ̣m chí ngay trên cùng mô ̣t chuỗi bào từ . Bề mă ̣t bào tử xa ̣ khuẩ n có thể nhẵn , có gai, khố i u, nế p nhăn hay da ̣ng tóc [13]. Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với đô ̣ dày khoảng 300-400 A°, chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác đô ̣ng bấ t lơ ̣i của điề u kiê ̣n ngoại cảnh như : nhiê ̣t đô ,̣ pH,... Hình dạng , kích thược chuỗi bào từ và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn đinh ̣ và là đă ̣c điể m quan tro ̣ng dùng trong phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n [15]. Hình 1.3. Bào tử xạ khuẩn [70] 8 1.3. Sơ lƣơ ̣c về vi khuẩ n kiểm định 1.3.1. Vi khuẩ n Staphylococcus aureus 1.3.1.1. Đặc điểm hình thái Staphylococcus aureus (S. aureus) thuộc giống Staphylococcus, họ: Micrococceae, lớp: Firmibacteria, giới: Prokaryote. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, Gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho , từng đôi, từng chuỗi ngắ n, không di động và không sinh bào tử . Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu [64]. Hình 1.4. Hình thái vi khuẩn S. aureus [72] 1.3.1.2. Đặc điểm nuôi cấ y, sinh hóa S. aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước. Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), còn trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc có hình dạng tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [52]. 9