Tài liệu Nghiên cứu đa dạng thành phần loài myxosporea (myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh quảng bình

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN NGỌC CHỈNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI MYXOSPOREA (MYXOZOA) KÝ SINH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH QUẢNG BÌNH Ngành: Công nghệ sinh học Mã: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Ngọc Doanh 2. TS. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Tất cả các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực. Tôi xin cam đoan các thông tin và số liệu được trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày 09 tháng 09 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Chỉnh i LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sỹ, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho chúng tôi trong khóa học 2015-2017. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Ngọc Doanh và thầy Nguyễn Hữu Đức đã tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Hà Duy Ngọ và TS. Nguyễn Văn Hà chủ nhiệm Dự án 47 (VAST.DA47.12/16-19) và đề tài Điều tra cơ bản đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn quỹ học bổng Nagao đã hỗ trợ một phần kinh phí trong 2 năm học để tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Christopher M. Whipps, người đã giúp đỡ tôi trong phân tích di truyền. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè trong lớp CNSH CH24C, các đồng nghiệp trong phòng Ký sinh trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này. Hà Nội, Ngày 09 tháng 09 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Chỉnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan .................................................................................................................... 1 Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... ii Danh mục bảng ................................................................................................................. v Danh mục hình ................................................................................................................. vi Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii Thesis abstract .................................................................................................................. ix Phần 1. Mở đầu .............................................................................................................. 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................ 3 2.1. Khái quát chung về myxozoa............................................................................. 3 2.1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu ................................................................................ 3 2.1.2. Đặc điểm sinh học và vòng đời của myxozoa ................................................... 4 2.2. Phân loại myxosporea ........................................................................................ 6 2.2.1. Phân loại hình thái học....................................................................................... 6 2.2.2. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa ...................................................... 8 2.3. Vai trò của myxosporea ................................................................................... 10 2.4. Tình hình nghiên cứu myxozoa ....................................................................... 11 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................................. 11 2.4.2. Tình hình nghiên cứu ở việt nam ..................................................................... 11 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................................... 13 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 13 3.2. Thời gian nghiên cứu ....................................................................................... 13 3.3. Đối tượng/vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 13 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 13 3.3.2. Các loài cá nghiên cứu ..................................................................................... 13 3.4. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 16 3.5.1. Thu mẫu vật chủ ngoài thực địa....................................................................... 16 iii 3.5.2. Phương pháp thu thập mẫu ký sinh trùng ........................................................ 17 3.5.3. Nhuộm hematoxylin - eosin............................................................................. 17 3.5.4. Phân tích hình thái học..................................................................................... 18 3.5.5. Phương pháp phân tích dna.............................................................................. 20 Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 22 4.1. Kết quả ............................................................................................................. 22 4.1.1. Thành phần loài trùng bào tử sợi myxosporea ở cá biển tại địa điểm nghiên cứu ................................................................................................................... 22 4.1.2. Mô tả các loài myxosporea ký sinh trên cá biển vùng biển ven bờ tỉnh quảng bình .................................................................................................................. 23 4.1.3. Tỷ lệ nhiễm và vị trí nhiễm các loài myxosporea ............................................ 57 4.1.4. Tình hình nhiễm myxosporea theo bộ vật chủ ................................................. 58 4.2. Thảo luận ......................................................................................................... 59 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ..................................................................................... 62 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 62 5.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 62 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 63 Danh sách công trình công bố liên quan đến nội dung nghiên cứu ................................ 70 Phụ lục ......................................................................................................................... 91 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thành phần các loài vật chủ nghiên cứu .................................................... 13 Bảng 3.2. Quy trình nhuộn Hematoxylin - Eosin ....................................................... 18 Bảng 4.1. Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa ........ 25 Bảng 4.2. Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa ........ 28 Bảng 4.3. Khoảng cách di truyền giữa các loài trong giống Sphaeromyxa ............... 29 Bảng 4.4. Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Myxidium .............. 31 Bảng 4.5. Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Myxidium ....... 32 Bảng 4.6. Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Auerbachia ........... 40 Bảng 4.7. Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Auerbachia .... 42 Bảng 4.8. Bảng so sánh đặc điểm của Unicapsula andersenae thu ở Úc và Việt Nam ................................................................................................................... 45 Bảng 4.9. Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Unicapsula .... 46 Bảng 4.10. Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa monodactyli .............................. 47 Bảng 4.11. So sánh kích thước của loài K. scomberomori và K. grammatorcyni ....... 50 Bảng 4.12. Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa megacapsula ............................. 52 Bảng 4.13. Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa kenti ở Việt Nam và Úc ............ 55 Bảng 4.14. Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Kudoa ............ 56 Bảng 4.15. Tỷ lệ nhiễm và vị trí nhiễm của các loài myxosporea ............................... 57 Bảng 4.16. Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng myxosporea theo bộ vật chủ ........................... 58 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Vòng đời của trùng bào tử sợi ....................................................................... 5 Hình 2.2. Quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa ...................................................... 10 Hình 3.1. Các số đo cần thiết để định loại ký sinh trùng myxosporea ........................ 19 Hình 4.1. Loài Sphaeromyxa n.sp.1 ............................................................................ 24 Hình 4.2. Loài Sphaeromyxa n.sp.2 ............................................................................ 26 Hình 4.3. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Sphaeromyxa .................................................................... 29 Hình 4.4. Loài Myxidium n.sp ..................................................................................... 30 Hình 4.5. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Sphaeromyxa .................................................................... 33 Hình 4.6. Loài Ceratomyxa sp.1 ................................................................................. 34 Hình 4.7. Loài Ceratomyxa sp.2 ................................................................................. 35 Hình 4.8. Loài Ceratomyxa sp.3 ................................................................................. 36 Hình 4.9. Loài Ceratomyxa sp.4 ................................................................................. 37 Hình 4.10. Loài Auerbachia chakravartyi Narasimhamurti, Kalavati, Anuradha, Padma, 1990 ................................................................................................ 39 Hình 4.11. Loài Auerbachia n.sp .................................................................................. 41 Hình 4.12. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Auerbachia ....................................................................... 42 Hình 4.13. Loài Unicapsula andersenae Miller and Adlard, 2013 ............................... 44 Hình 4.14. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Unicapsula ....................................................................... 45 Hình 4.15. Loài Kudoa monodactyli Gunter, Cribb, Whipps and Adlard, 2006........... 48 Hình 4.16. Loài Kudoa scomberomori Adlard et al., 2005 ........................................... 49 Hình 4.17. Loài Kudoa megacapsula Yokoyama and Itoh, 2005 ................................. 51 Hình 4.18. Loài Kudoa kenti Burger and Adlard, 2009 ................................................ 54 Hình 4.19. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Kudoa ............................................................................... 56 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt bp  Cặp bazơ nitơ (Base pair) DNA  Deoxyribonucleic Acid dNTP  Deoxy Nucleic Triphosphate GENBANK  Ngân hàng gen quốc tế ITS  Internal transcribed spacer LSU rDNA  Large subunit ribosomal DNA MEGA  Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử NCBI   Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National Center for Biotechnology Information) n.sp  Loài mới (New species) RNA  Ribonucleic Acid rDNA  Ribosome DNA SSU rDNA  Small subunit ribosomal DNA PCR  Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) sp  Mẫu, cá thể (specimen) spp  Các loài (species) QĐ-UBND  Quyết định - Ủy ban Nhân dân rpm  Số vòng quay trên phút (Revolutions Per Minute) SLMK  Số lượng mổ khám SLN  Số lượng nhiễm TAE  Tris-Acetate-EDTA UV  Tia tử ngoại (Ultraviolet) vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Ngọc Chỉnh Tên luận văn: Nghiên cứu thành phần loài myxosporea (Myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Hiểu biết được đa dạng thành phần loài myxosporea ký sinh trên các loài cá. Biết được một số đặc điểm khu hệ myxosporea ký sinh trên cá. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thu mẫu vật chủ bằng cách thu mua tại các cảng cá. Vật chủ sau đó được chụp ảnh, ghi lại các thông tin và định loại. Vật chủ được mổ khám tìm kiễm ký sinh trùng myxosporea trên mang, cơ. da. mật, ruột não. Mẫu ký sinh trùng myxosporea được định loại bằng phương pháp hình thái học theo khóa phân loại của Lom and Diková (1992) và của Fiala et al., (2015) kết hợp với phân tích di truyền. Kết quả chính và kết luận Trong số 740 cá thể thuộc 37 họ, 8 bộ cá tại Quảng Bình được nghiên cứu có 116 (15,6%) cá thể thuộc 14 loài bị nhiễm trùng bảo tử sợi myxosporea, tỷ lệ nhiễm ở các loài cá dao động từ 26,6-92,0% Kết hợp phương pháp định loại hình thái và phân tử đã định loại mô tả được 14 loài myxosporea. Trong đó có 4 loài được ghi nhận là loài mới cho khoa học, 5 loài là ghi nhận mới cho Việt Nam và có 4 loài thuộc giống Ceratomyxa mới xác định đến giống. Các loài trùng bào tử sợi có tính thích nghi vật chủ hẹp, mỗi loài myxosporea ký sinh trên các loài vật chủ cá khác nhau, riêng loài cá Bò Paramonacanthus japonicus bị nhiễm 2 loài ở hai vị trí khác nhau. Riêng loài U. andersenae được ghi nhận ký sinh trên 3 loài vật chủ: Cá Bò Paramonacanthus japonicus, Cá Móm gai ngắn Gerres limbatus, Cá Nạng bạc Otolithes ruber. Trong số 8 bộ cá nghiên cứu, chỉ có bộ cá Nhói Beloniformes chưa phát hiện nhiễm trùng bào tử sợi. viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Ngoc Chinh Thesis title: Study on the diversity of the composition of myxosporea (Myxozoa) from some coastal marine fishes in Quang Binh province. Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - Understanding the diversity of the composition of myxosporean infecting in some marine fishes. - Know the features of the Myxosporean parasites on fish. Materials and Methods - The fresh fishes were bought on the market port in the morning. Then, these fishes was taken photo and identified. It was opened by cut for collecting myxosporean in muscle, gallbladder, skin, kidney, gill, brain,… - The myxosporean was identified by the morphological and molecular methods. Main findings and conclusions - Out of 740 fishes in 37 families, 8 oder of marine fishes in Quang Binh were studied. One hundred and sixteen of fishes (15.6%) in 14 species was infected by myxosporean with the intensity of infection was from 26.6% to 92%. - The study described 14 species of myxosporean with 4 new species and 5 species were new records for Vietnam. - Each species of myxosporea parasitizes on different host species. However, the species Hairfinned leatherjacket (Paramonacanthus japonicus) was infected by 2 species of myxosporea in muscle and gallbladder. And the species U. andersenae was found in three species of fishes: Paramonacanthus japonicus, Gerres limbatus, Otolithes ruber - In this study, the myxosprea was not found on order of Beloniformes. ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong những năm gần đây, ngành thủy sản đã không ngừng phát triển, sản lượng thủy sản luôn đạt trên 4%/năm, mang lại nhiều sản phẩm, hàng hóa xuất khẩu có giá trị kinh tế cao. Kinh ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 7.836 triệu USD, tăng 16,74% so với năm 2013, bình quân tăng 14,27%/năm kể từ 1995 đến 2014 (Nguyễn Tiến Hưng, 2015). Sự phát triển trên đã góp phần quan trọng vào việc xóa đói giảm nghèo, cải thiện đời sống cho người dân vùng ven biển, an ninh lương thực được đảm bảo. Hải sản là nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghệ thực phẩm. Các loài thủy sản được chế biến thành nhiều món ăn và các dạng đồ hộp khác nhau. Ngoài ra, thủy sản còn được sử dụng để sản xuất một số loại thuốc chữa bệnh, thức ăn dùng trong chăn nuôi và các các sản phẩm dùng trong ngành công nghiệp khác như các loại keo, các chế phẩm enzyme, các hoạt chất chống oxy hóa (Nguyễn Thị Hoài, 2014). Trong những năm qua, việc sử dụng tràn lan các chất bảo quản, chất kháng sinh, chất tăng trưởng trong chăn nuôi động vật trên cạn đã làm cho xu hướng chuyển dịch cơ cấu sử dụng dinh dưỡng từ thức ăn động vật nuôi trên cạn sang các dạng thức ăn có nguồn gốc hải sản khai thác tự nhiên, đặc biệt là cá biển. Do vậy việc phát triển nuôi trồng và khai thác thủy sản đang được quan tâm phát triển phục vụ nhu cầu của thị trường. Quảng Bình là tỉnh thuộc vùng duyên hải miền Trung, đường bờ biển dài 116 km và có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho khai thác thủy sản. Theo thống kê của tổng cục thống kê thì năm 2014 sản lượng thủy sản khai thác của tỉnh đạt 53.323 tấn trong đó sản lượng cá biển khai thác đạt 42.400 tấn. Trong quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển ngành thủy sản đến năm 2020, Quảng Bình đã phấn đấu tốc độ tăng trưởng về giá trị sản xuất thủy sản bình quân hàng năm đạt 6,0% (trong đó khai thác tăng 4,3%; nuôi trồng tăng 7,3%, dịch vụ tăng 19,1%). Cơ cấu giá trị sản xuất thủy sản đến năm 2020: khai thác chiếm 52,3%; nuôi trồng chiếm 43,0% và dịch vụ chiếm 4,7%. Với mục tiêu từng bước đưa ngành Thủy sản tỉnh Quảng Bình phát triển thành một ngành kinh tế mạnh của tỉnh; công nghiệp hóa, hiện đại hóa trên cơ sở hiệu quả, bền vững, hòa nhập với sự phát triển thủy sản cả nước, góp phần xóa đói giảm nghèo, tăng thu nhập cho người lao động và giữ gìn an ninh Tổ quốc (932/QĐ-UBND). 1 Song song với sự phát triển của ngành khai thác và nuôi trồng hải sản, vấn đề bệnh do ký sinh trùng gây ra trên hải sản cần được quan tâm nghiên cứu. Đặc biệt là các loài ký sinh trùng thuộc lớp trùng bào tử sợi (Myxosporea) ký sinh trên cá làm ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị kinh tế của cá khai thác. Bên cạnh đó một số sản phẩm cá nhiễm trùng bào tử sợi có thể gây ngộ độc thực phẩm (Iwashita et al., 2013). Do vậy, việc nghiên cứu ký sinh trùng myxosporea ở cá biển có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, cho phép chúng ta biết được đa dạng thành phần loài và tình hình nhiễm ký sinh trùng, từ đó nghiên cứu các biện pháp nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực của ký sinh trùng myxosporea đến ngành khai thác thủy sản. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng thành phần loài myxosporea (Myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Hiểu biết được đa dạng thành phần loài trùng bào tử sợi myxosporea ký sinh trên một số loài cá biển. - Biết được một số đặc điểm khu hệ myxosporea ký sinh trên cá. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ MYXOZOA 2.1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu Myxozoa là một nhóm ký sinh trùng, được đề xuất là phân ngành, thuộc ngành Cnidaria (Canning and Okamura, 2004) ký sinh trên cả cá biển và cá nước ngọt, phân bố rộng trên thế giới (Lom and Dyková, 1992; Kent et al., 2001; Feist and Longshaw, 2006). Myxozoa gồm 2 lớp, Malacosporea và Myxosporea. Lớp Malacosporea có số lượng loài ít, trong khi Myxosporea là lớp lớn với khoảng 2.200 loài (Lom and Dyková 2006). Trước đây, myxozoa được xếp vào nhóm động vật đơn bào (Protozoa), mặc dù cấu trúc đa bào và chức năng chuyên môn hóa của các bào tử vượt mức tổ chức của sinh vật đơn bào (Lom and Dyková, 1992). Myxozoa lần đầu tiên được phát hiện bởi Jrine năm 1825 ở cơ của của cá Hồi Coregounus fera tại hồ Geneva. Trong những năm 1840, Müller đã mô tả những đặc điểm đầu tiên về bào tử myxosporea và gọi chúng là các “psorosperms = túi bào tử”. Năm 1880, Bütschli đã tiến hành nhiều nghiên cứu sâu hơn mô tả các giai đoạn hợp bào như nguyên bào tử đa nhân, sự phát triển của bào tử, sự phóng thích của các sợi cực và vai trò của chúng trong quá trình truyền nhiễm. Trong những năm 1890, Thélohan xếp các loài myxozoa thành bộ Myxosporidia đồng thời thành lập nhiều giống trong bộ này. Tác giả cũng nghiên cứu cách bào tử thực hiện việc lan truyền, phát triển trong các giai đoạn khác nhau trong vật chủ cá. Năm 1919, Kudo xuất bản sách chuyên khảo cung cấp thông tin của tất cả các loài đã được biết. Những nghiên cứu siêu cấu trúc đã đem lại cái nhìn mới về đặc điểm tế bào học và sinh học chức năng của myxozoa. Những tiến bộ của công nghệ chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét đã cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc bào tử, nang cực, các nợi nang cực, sự tạo thoi trùng và sự hình thành nang cực (dẫn theo Okamura et al., 2015). Đặc tính đa bào của các bào tử làm cơ sở để xếp myxozoa vào nhóm động vật đa bào (Štolc, 1899) và đã được khẳng định bằng phân tích phân tử (Smothers et al., 1994; Schlegel et al., 1996) và siêu cấu trúc (Desser et al., 1983). Các bằng chứng này ủng hộ đề xuất của Weill (1938) xếp myxozoa thuộc ngành Cnidaria (Siddall et al.,1995). 3 2.1.2. Đặc điểm sinh học và vòng đời của myxozoa Việc xác định con đường lây truyền của myxozoa là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát sự lây lan của chúng. Myxozoa là nội ký sinh trùng đặc trưng bởi vòng đời 2 vật chủ, bao gồm động vật không xương sống và động vật có xương sống là vật chủ chính và vật chủ trung gian tương ứng. Vật chủ của 2 lớp Malacosporea và Myxosporea khác nhau. Malacosporea sử dụng vật chủ chính là động vật không xương sống thuộc ngành Bryozoa, vật chủ trung gian là cá, trong khi Myxosporea sử dụng vật chủ chính là giun đốt ngành Annelida, vật chủ trung gian là cá, lưỡng cư, chim và chuột chù. Tất cả các loài myxozoa đều lây truyền cho vật chủ mới bằng các bào tử đa bào, bao gồm các tế bào van bên ngoài kèm theo các tế bào chân giả (sporoplasma) và các tế bào có nang cực. Tế bào nang cực có cấu trúc nội bào với các sợi có khả năng bám vào bề mặt vật chủ. Các nang cực tương đồng với các nang được sử dụng để bắt mồi và bảo vệ myxozoa sống tự do. Sau sự bám của các bào tử, các tế bào thứ cấp (sporoplasm) xâm nhập vật chủ để nhiễm cho vật chủ. Lớp Malacosporea có bào tử đơn giản và bị phá hủy tương đối nhanh. Trái lại, bào tử của lớp Myxosporea được sản sinh trong cơ cá có vỏ dày có thể duy trì lây nhiễm cho giun đốt annelids trong nhiều tháng đến nhiều năm. Các giai đoạn sản sinh bào tử của lớp Malacosporea phát triển như cơ thể giun hoặc các túi đa bào ở động vật không xương sống nước ngọt bryozoa và như một nang giả đơn bào ở cá. Các giai đoạn sản sinh bào tử của lớp Myxosporea phát triển thành một nang có thành tế bào bên ngoài ở giun đốt annelids và thành cấu trúc có màng bao quanh đơn giản như nang giả ở cá. Ở cả 2 lớp, giai đoạn tiền sinh bào tử có thể tăng sinh như những tế bào đơn trước khi đến vị trí nơi mà giai đoạn sinh sản bào tử phát triển. Nhiều myxozoa là vô hại và ít tác động đến vật chủ cá (Shul'man 1990, Lom and Dyková, 1992). Tuy nhiên, một số myxozoa gây ra bệnh có tác động đối với ngành khai thác và nuôi trồng thủy sản (Pote et al., 2000; Diamant et al., 1994). Myxozoa nhiễm cho hầu như tất cả mô cá và thể hiện một mức độ thích nghi với vật chủ và mô cá. Sự nhiễm bệnh ở động vật không xương sống còn ít được biết đến vì chưa được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Ngoại trừ những loài liên quan đến các bệnh nghiêm trọng ở các loài cá kinh tế, các tương tác giữa động vật không xương sống. 4 Hình thức lây truyền gián tiếp giữa động vật không xương và có xương sống: Đây là vòng đời chủ yếu của các loài myxospora. Trong cơ thể vật chủ động vật có xương sống, các myxospora có thể phát triển thành dạng histozoic (thường ký sinh trong mang, thận, cơ) và dạng coelozoic (ký sinh trong ống mật, túi mật, bàng quang tiết niệu) (Lom and Dyková, 2006). Bào tử phát tán vào môi trường nước thông qua nước tiểu, u nang vỡ hoặc giải phóng sau khi vật chủ chết. Các bào tử xâm nhập vào trong vật chủ không xương sống khác và thường là một số loài giun đốt sống dưới tầng đáy của thủy vực. Các động vật không xương sống là vật chủ chính của trùng bào tử sợi (Uspenskaya, 2008; Meaders and Hendrikson, 2009). Hầu hết các chu kỳ sống của myxosporea đã được biết đến đều sống trong môi trường nước ngọt (Kent et al., 2001). Hình 2.1. Vòng đời của trùng bào tử sợi Nguồn: Atkinson (2011) Hình thức lây nhiễm trực tiếp từ cá sang cá: phương thức lây truyền này không cần qua giai đoạn bào tử. Các bào tử sinh dưỡng myxosporea có thể nhiễm trực tiếp vào cá (Yasuda et al., 2002). Loài Enteromyxum spp. là ví dụ điển hình cho sự lây truyền từ cá sang cá (Redondo et al., 2002). E. leei phát triển bên trong ruột cá biển, khi chúng được giải phóng ra ngoài môi trường nước được nuốt vào trong ruột của các loài cá khác (Sitjà-Bobadilla et al., 2007). Hình thức 5 này chỉ xảy ra trong hệ thống nuôi thâm canh với mật độ cao nơi mà có mật độ lây lan nhanh chóng của ký sinh trùng. Phương thức lan truyền trực tiếp giữa động vật không xương sống với động vật không xương sống: Sự lan truyền này thông qua sự phân mảnh của các vật chủ là bryozoan (Topps et al., 2004) hoặc trong quá trình phân hạch của các myxosporea trong các loài giun nhiều tơ. Hình thức lan truyền này cũng không cần qua các vật chủ trung gian là cá mà chúng vẫn có thể phát triển nhanh trong hệ sinh thái (Morran et al., 2011). 2.2. PHÂN LOẠI MYXOSPOREA 2.2.1. Phân loại hình thái học Phân ngành Myxozoa gồm 2 lớp Myxosporea và Malacosporea. Lớp Myxosporea có các bào tử có các mảnh van cứng và xếp liền kề vào nhau và lây truyền từ giun nhiều tơ sang cá; lớp Malacosporea là các bào tử có mảnh van mềm có vòng đời lây truyền từ Bryozoa sang cá (Kent et al., 2001). Căn cứ vào số lượng nang cực thì lớp Myxosporea được chia thành hai bộ: Bộ Bivalvulida với các bào tử chứa 1-2 nang cực và bộ Multivalvulida với các bào tử có nhiều hơn 2 nang cực. Phân loại Myxozoa chủ yếu dựa vào hình thái bào tử. Trong lớp Myxosporea, hình thái bào tử là tiêu chí chính để phân loại các loài từ các hệ thống đầu tiên được thiết lập (Kudo, 1933; Tripathi, 1948; Shul'man, 1966). Bào tử là cấu trúc đặc trưng sở hữu nhiều đặc điểm quan trọng để phân loại. Các bào tử gồm mảnh van vỏ nối với nhau kèm một hoặc nhiều bào tử và một hoặc nhiều nang cực (Lom and Dyková, 1992). Số lượng và cấu tạo của van vỏ, số lượng và sự sắp xếp các nang cực được sử dụng để mô tả đặc điểm của các bộ. Các đặc điểm khác như sợi cực, có hay không phần phụ đuôi, hình dạng của các đường nối các van là những đặc điểm quan trọng để phân loại bậc họ và giống. Phân loại cấp độ loài Myxosporea dựa trên kích thước bào tử và nang cực cũng như cấu trúc chi tiết của bào tử (Lom and Arthur, 1989), chẳng hạn như số lượng vòng quấn của các sợi nang cực, sự hiện diện của sườn, rìa và vân trên các mảnh van bào tử, có hay không lớp niêm mạc, số lượng bào tử và nhân của chúng. Các đặc điểm khác bao gồm vật chủ, thông tin về môi trường sống của vật chủ, các giai đoạn sinh dưỡng (ví dụ: vị trí nhiễm và hình dạng, kích thước và 6 cấu trúc của giai đoạn sinh dưỡng), đặc điểm của cả hai giai đoạn bên ngoài và giai đoạn sản sinh bào tử (plasmodia và pseudoplasmodia). Căn cứ vào hình thái của các dạng bào tử, phân ngành Myxozoa được hệ thống như sau: Ngành CNIDARIA Phân ngành: MYXOZOA Lớp MYXOSPOREA Buetschli, 1881 Bộ BIVALVULIDA Schulman, 1959 Phân bộ Platysporina Kudo, 1919 Họ Myxobolidae Thélohan, 1892 Phân bộ Sphaeromyxina Lom and Noble, 1984 Họ Sphaeromyxidae Lom and Noble, 1984 Phân bộ Variisporina Lom and Noble, 1984 Họ Alatosporidae Shulman et al., 1979 Họ Auerbachiidae Evdokimova, 1973 Họ Ceratomyxidae Doflein, 1899 Họ Chloromyxidae Thélohan, 1892 Họ Fabesporidae Naidenova and Zaika, 1969 Họ Myxidiidae Thélohan, 1892 Họ Ortholineidae Lom and Noble, 1984 Họ Parvicapsulidae Shulman, 1953 Họ Sinuolineidae Shulman, 1959 Họ Sphaerosporidae Davis, 1917 Bộ MULTIVALVULIDA Shulman, 1959 Họ Kudoidae Meglitsch, 1947 Họ Trilosporidae Shulman, 1959 Lớp MALACOSPOREA Canning, Curry, Feist, Longshaw and Okamura, 2000 Bộ MALACOVALVULIDA Canning,2000 Họ Saccosporidae Canning, Okamura and Curry, 1996 7 2.2.2. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa Phân loại myxozoa truyền thống gặp khó khăn bởi sự giống nhau về cấu trúc bào tử. Các đặc điểm như thích nghi vật chủ, thích nghi mô, đặc điểm các giai đoạn phát triển và dữ liệu trình tự DNA có thể kết hợp để định loại chính xác hơn. Fiala et al. (2015) giới thiệu hệ thống phân loại myxozoa đã được cập nhật. Các tác giả đề nghị kết hợp các số liệu hình thái, sinh học và phân tử để mô tả myxozoa ở các cấp bậc phân loại khác nhau và để phát triển phân loại tiến hóa. Các vùng gen mã hóa RNA ribosome tiểu phần nhỏ SSU rDNA tiến hóa nhanh có ích cho việc phân biệt các loài và có thể cung cấp thông tin ở bậc phân loại cao hơn. Một vài chỉ thị phân tử khác cung cấp một số thông tin độc lập với SSU rDNA, nhưng thường là ít thông tin hơn và cần có các chỉ thị khác. Xem xét mối quan hệ tiến hóa phân tử trong các nhánh chính của myxozoa (dựa trên dữ liệu SSU rDNA) cho phép Fiala et al., (2015) xác định các mẫu cần thiết để cải thiện sự hiểu biết của chúng ta về tiến hóa của myxozoa và đề xuất các trường hợp sát nhập hoặc tách các bậc phân loại. Dựa trên phân tích SSU và trên các đặc điểm hình thái nguyên thủy, Myxozoa chia thành các dòng chính sau: Malacosporea và Myxosporea (chia thành các dòng Myxosporea biển, Myxosporea nước ngọt và Sphaerosporid) (hình 2.2). Dòng Malacosporea gồm các loài có vòng đời ở vật chủ cá và động vật không xương sống ngành Bryozoa, có hình thái giống giun hoặc cái túi ở động vật không xương sống. Toàn bộ dòng này được coi là chị em với myxosporea và được cho là myxozoa nguyên thủy. Dòng Myxosporea biển gồm các loài có vòng đời trong môi trường biển, sử dụng vật chủ chính là giun nhiều tơ. Dòng Myxosporea biển chia thành 7 nhánh (hình 2.2). Dòng myxosporea nước ngọt bao gồm các loài sử dụng giun ít tơ là vật chủ chính và phát triển chủ yếu ở môi trường nước ngọt. Tuy nhiên, có một số ngoại lệ, không tách biệt rõ ràng nước ngọt và nước biển. Một số dòng có tổ tiên xâm chiếm môi trường biển hiện nay xuất hiện trong nước ngọt. Dòng myxosporea nước ngọt được chia thành 5 nhánh (hình 2.2). Dòng Sphaerospora chủ yếu là các loài ký sinh ở đường tiết niệu ở lưỡng cư, cá nước ngọt và cá biển (hình 2.2). 8 Myxozoa đại diện cho một dòng cnidaria cổ bắt nguồn từ tổ tiên chung trong thời kỳ đầu tiến hóa. Gen mã hóa RNA ribosome tiểu phần nhỏ là một gen chung được tìm thấy ở tất cả các sinh vật trên trái đất và đã được sử dụng thành công để phân tích tiến hóa ở bậc phân loại cao hơn ở nhiều loài sinh vật nhân chuẩn. Trình tự SSU đầu tiên của myxosporea đã được sử dụng để xác định vị trí của myxozoa trong cây sinh vật nhân chuẩn (Smothers et al., 1994). Kể từ đó, trình tự SSU đã được sử dụng thường xuyên để làm rõ mối quan hệ giữa các loài myxozoa. Mặc dù không phải không có hạn chế, chỉ thị này chứng tỏ có thông tin đủ để ước tính mối quan tiến hóa trong số các loài myxozoa. Ngoài việc là một chỉ thị di truyền chung, SSU rất hữu ích cho nghiên cứu quan hệ tiến hóa của myxozoa vì tính không đồng nhất của nó (các vùng bảo tồn và thay đổi) tạo điều kiện cho phân loại ở các bậc khác nhau. Vùng bảo tồn cho phép thiết kế mồi chung và so sánh các trình tự DNA, trong khi các vùng biến đổi cho biết sự phân hóa. Tỷ lệ thay thế cao của trình tự SSU myxosporea, đặc biệt là trong các vùng biến đổi của chúng, chỉ ra sự tiến triển nhanh chóng của gen SSU myxozoa. Sự thay đổi trình tự SSU của myxosporea được phản ánh về chiều dài trình tự SSU giữa các loài dòng nước biển và nước ngọt (1.500-1.800 bp so với > 2000 bp) và các vùng biến đổi dài với nhiều nucleotide chèn ở myxosporea, nhánh Sphaerospora là một trong những đại diện có SSUs dài nhất (> 3,7 kb) trong số các loài sinh vật nhân chuẩn. Sự khác nhau về chiều dài cũng quan sát thấy ở tiểu phần lớn ribosomal RNA (LSU) giữa các dòng myxosporea. LSU được chứng minh là có nhiều thông tin hơn so với SSU. Tuy nhiên, với số lượng lớn các trình tự SSU trong cơ sở dữ liệu NCBI vẫn làm cho SSU là chỉ thị được lựa chọn đầu tiên khi phân tích tiến hóa của myxozoa. Sự phổ biến của SSU làm cho chỉ thị này hữu ích để phân tích mối quan hệ giữa các loài có quan hệ gần. Tuy nhiên, SSU thường không đủ để phân biệt sự khác biệt ở cấp độ trong loài. Để khắc phục hạn chế này, vùng chèn (the internal transcribed spacer region 1 (ITS1) đã được sử dụng. ITS1 là chỉ thị tiến hóa nhanh hơn so với SSU, bởi vì nó nằm liền kề với SSU, thiết kế mồi để nhân bản trình tự ITS1 không phải là quá khó. Xác định ITS1 giữa Myxobolus cerebralis từ Mỹ và Châu Âu tiết lộ sự di nhập gần đây của ký sinh trùng này, tiếp theo là phân tán thông qua tác nhân con người. ITS1 cũng là một chỉ thị để phân tích quan hệ tiến hóa của nhiều loài myxozoa ở các vùng địa lý khác nhau, tuy nhiên, đôi khi có thể gặp phải vấn đề để mô tả các chủng khác nhau do sự 9 biến đổi. Ở cấp độ loài, ITS1 đã được nghiên cứu trong quần thể ở các vật chủ khác nhau của Ceratonova shasta. Ngoài ra, ITS1 và ITS2 được sử dụng để làm sáng tỏ những loài myxosporea bí ẩn ký sinh trên các loài lưỡng cư. Hình 2.2. Quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa Nguồn: Fiala et al. (2015) 2.3. VAI TRÒ CỦA MYXOSPOREA Đa số các loài myxosporea là vô hại, một số ít loài gây bệnh nghiêm trọng hoặc tử vong cho vật chủ, làm cho ngành sản xuất thủy sản ảnh hưởng nghiêm trọng về giá trị kinh tế. 10