Tài liệu Nghiên cứu công nghệ chiết xuất hypericin và các hợp chất flavonoid từ các loài ban-hypericum của việt nam làm thuốc chống virus cúm typ a cho gia cầm

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHCN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HYPERICIN VÀ CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ CÁC LOÀI BAN - HYPERICUM CỦA VIỆT NAM LÀM THUỐC CHỐNG VIRUS CÚM TYP A CHO GIA CẦM Đề tài nghiên cứu KHCN cấp Bộ TS. Trần Bạch Dương 7643 01/02/2010 HÀ NỘI 1 - 2010 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHCN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HYPERICIN VÀ CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ CÁC LOÀI BAN - HYPERICUM CỦA VIỆT NAM LÀM THUỐC CHỐNG VIRUS CÚM TYP A CHO GIA CẦM Đề tài nghiên cứu KHCN cấp Bộ Chủ nhiệm đề tài: TS. Trần Bạch Dương Cán bộ tham gia: TS. Hoàng Văn Hoan TS. Ngô Thị Hải Yến Ths. Nguyễn Thị Hiền Anh CN. Nguyễn Quốc Đạt CN. Lại Thị Bảo Hiền CN. Phạm Thị Thanh Hiếu Ths. Vương Chí Hùng Hà Nội, 1 - 2010 MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1 Giới thiệu chung về hypericin và các dẫn xuất 3 1.1.1 Vài nét về hypericin 3 1.1.2 Tính chất hóa học và hoạt tính sinh học của hypericin 4 1.1.3 Một số ứng dụng của các sản phẩm chứa hypericin 6 1.2 Các phương pháp công nghệ sản xuất hypericin 7 1.2.1 Công nghệ tổng hợp hypericin 7 1.2.2 Công nghệ chiết xuất hypericin từ các loài Hypericum 9 1.3 Một số loài Ban - Hypericum ở Việt Nam CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 13 2.2.1 Chiết xuất cao tổng số giàu các thành phần naphthodianthron 13 2.2.2 Phân lập sản phẩm giàu hypericin (≥ 90 %) từ cao chiết tổng số 14 2.2.3 Phân tích các sản phẩm 15 2.2.4 Thử nghiệm - sàng lọc hoạt tính chống virus của các sản phẩm 15 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Đánh giá nguyên liệu hai loài Ban - Hypericum 17 3.2 Chiết tách sản phẩm hypericin ≥ 90 % 18 3.3 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ phân lập cao chiết 23 hypericin từ các loài Ban - Hypericum 3.3.1 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết xuất 23 3.3.2 Thử nghiệm chiết xuất lượng lớn Cao chiết Hypericum 27 và phân lập hypericin 90 % 3.4 Thử nghiệm hoạt tính chống Virus 29 3.4.1 Nghiên cứu điều chế chế phẩm chống Virus Influenza Typ A cho gia cầm 29 3.4.2 Thử nghiệm in vitro hoạt tính chống virus của sản phẩm Cao Hypericum 29 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN 31 KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI Các loài Ban - Hypericum, là các cây bụi nhỏ thuộc họ Măng cụt (Clusiaceae) mọc hoang và cũng được trồng làm cảnh, phân bố rộng rãi ở khắp các nước ôn đới, cận nhiệt đới và ở các vùng lãnh thổ có độ cao từ 500 - 1500 m. Ở Việt Nam, các loài này mọc hoang dại và được trồng làm thuốc ở vùng núi và cao nguyên phía Tây Bắc, từ lâu trong dân gian đã sử dụng nước sắc từ lá và hoa của các loài này để chữa sốt phát ban - Tên gọi Ban rỗ, Nọc sởi của các loài Hypericum xuất phát chính từ công dụng này. Nhưng có lẽ nổi tiếng nhất và được thương mại hóa là Cỏ Thánh John - Hypericum perforatum, cao chiết (St John’s wort extract) và một số hoạt chất chính của cây này đã được sử dụng từ thế kỷ 17 ở châu Âu và sau đó là Bắc Mỹ làm thuốc chữa sốt, chống virus và chống suy nhược. Năm 1942 cấu trúc của hypericin, hoạt tính quang hóa ứng dụng trong chẩn đoán X-quang và hoạt tính ức chế quá trình tổng hợp 5-hydroxytryptamin ứng dụng trong điều trị chống suy nhược đã được công bố [1]. Hypericin thuộc lớp chất biflavon là hoạt chất chính của các loài Ban, chiếm tới 0,05 % hàm lượng khô trong lá và hoa của các loài này. Từ các thập niên 1980 trở về trước, mặc dù các hoạt tính khác của hypericin còn chưa được đánh giá rõ ràng trên các thử nghiệm in vitro và in vivo, nhưng các bác sỹ trong các bệnh viện ở châu Âu và Mỹ vẫn sử dụng rộng rãi thuốc chứa cao chiết Cỏ Thánh John và hypericin trong các điều trị chống suy nhược và trong chẩn đoán X-quang, ở Đức, một năm sử dụng tới hơn 100 triệu liều (~ 4 µg/kg thể trọng/ngày đêm). Đến năm 1992, sau các nghiên cứu của Meruelo và các cộng sự, thông qua tác dụng ức chế enzym kinaza C, hoạt tính của hypericin làm nhiễu và ức chế quá trình tập hợp phân chia nhân virus mới được khẳng định. Thêm vào đó, hypericin có tác dụng ngăn cản rất mạnh quá trình thâm nhập màng tế bào của các virus, một loạt các nghiên cứu đã được thực hiện và công bố về hoạt tính của hypericin như chống HIV1, virus viêm gan C và chống ung thư. US-FDA, JECFA và Hội đồng châu Âu đều đã công bố các tiêu chuẩn về các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng chứa hypericin hoặc cao chiết cỏ thánh John. Do có các tác dụng lên hệ thần kinh vận động, nên đây là loại thuốc được sử dụng theo đơn [1 - 4]. Vào đầu thế kỷ 21, bùng phát đại dịch cúm A H5N1 cùng với biến thể H9N2 trên các đàn gia cầm và lây nhiễm sang người lan rộng khắp thế giới, các biện pháp sử dụng thuốc tamiflu chữa cúm A cho người, vaccine và các thuốc chống virus cho 1 gia cầm đều được sử dụng đồng thời. Hypericin đã trở thành một lựa chọn tích cực đối với việc phòng và chống nhiễm virus cho đàn gia cầm, hypericin có tác dụng ức chế và ngăn ngừa virus H5N1 và cả biến thể H9N2. Hiện nay, những nước bị ảnh hưởng nặng nề nhất của dịch cúm gia cầm là Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc đều đã đẩy mạnh việc sản xuất và phát triển sử dụng hypericin trong phòng chống dịch cúm A cho gia cầm [5, 6]. Ở Việt Nam, các loài Ban - Hypericum đều đã được khai thác và sử dụng từ lâu trong dân gian làm thuốc chữa sốt phát ban. Sau năm 2000, một số đơn vị nhà nước và tư nhân nhập giống Hypericum perforatum dưới tên gọi Hoa chuỗi ngọc (đây là tên dân gian tự đặt) về trồng làm cảnh và phát triển nguyên liệu cho dược phẩm trong phía Nam. Cho đến nay, mặc dù cũng đã có một số đơn vị nghiên cứu thông báo trên các phương tiện thông tin đại chúng về việc đã nghiên cứu công nghệ chiết xuất hypericin làm thuốc chống cúm A cho gia cầm, nhưng trên thực tế, trong nước chưa hề có sản phẩm được triển khai thử nghiệm. Cũng chưa có công trình khoa học nào công bố về việc nghiên cứu hoàn thiện phân lập hypericin từ các loài Ban Hypericum ở Việt Nam. Xuất phát từ những tiếp cận nêu trên, song song với các hoạt động nghiên cứu và triển khai chiết xuất các sản phẩm thiên nhiên của Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài “Nghiên cứu công nghệ chiết xuất hypericin và các hợp chất flavonoid từ các loài Ban - Hypericum của Việt Nam làm thuốc chống virus cúm Typ A cho gia cầm” theo các nhiệm vụ cụ thể dưới đây: 1. Khảo sát nguyên liệu vùng Tây Bắc và cao nguyên miền Trung; 2. Phân lập và xác định hàm lượng hypericin và các hợp chất naphthodianthron trong các loài Ban - Hypericum của Việt Nam, trên cơ sở đó xác định loài Ban đặc hữu làm nguyên liệu chiết xuất hypericin; 3. Nghiên cứu xác định công nghệ chiết xuất cao chiết flavonoid giàu hypericin và thành phần naphthodianthron; 4. Điều chế chế phẩm chống virus cúm Typ A cho gia cầm và thử nghiệm in vitro, từ đó xây dựng cơ sở cho thử nghiệm in vivo. 2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về hypericin và các dẫn xuất 1.1.1 Vài nét về hypericin Hypericin là chất sắc tố đỏ, thuộc lớp chất naphthodianthron có ở các cây Ban Hypericum, trong đó nổi tiếng nhất phải kể đến Cỏ Thánh John (Hypericum perforatum L.) [1, 2, 3]. Hypericin cũng được tìm thấy trong da của một số loài côn trùng ăn lá Ban như Crisolina hyperici và trong loài nấm Dermocyte austrovenete. Các hợp chất naphthodianthrone khác, được tìm thấy trong tự nhiên bao gồm fagopyrin, được phân lập từ kiều mạch, stentorin từ nhiễm sắc thể của động vật nguyên sinh có tiên mao Stentor coeruleus, và blepharismin từ Blepharisma. Các hợp chất naphodianthron brôm hóa được tìm thấy ở các loài san hô và các sắc tố hóa thạch ở các Crinoid kỉ Jura [7]. Hàm lượng của hypericin trong cây tập trung chủ yếu ở lá (tới 0,466 %), ở hoa và ở thân ít hơn - từ 0,0095 đến 0,086 %. Ngoài hypericin, cây Ban còn có các flavon và terpen khác như hyperosit, hyperforin, pseudohypericin, quercetin, 2methyloctan, α-pinen, dodecanol, nonan, 3-methyl nonan, undecan, isoundecan và 6methyl-5-hepten-2-on. Trong cây còn có tannin, ancaloid, ocimen và các xanthon [7]. Trong tự nhiên, hypericin luôn tồn tại cùng với một chất gần gũi về mặt hóa học với nó là pseudohypericin [8], hình dưới đây nêu cấu trúc hóa học của hypericin và pseudohypericin: 3 Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hypericin và các dẫn xuất của nó có hoạt tính kháng virus bao gồm cả retrovirus. Các chất kháng virus, bao gồm cả retrovirus là các dẫn xuất este mono- và dicacboxylic của hypericin bằng cách thế vào một hoặc cả hai vị trí methyl. Vì vậy hiện nay hypericin được xem là một loại thuốc chống virus tiềm năng [1 - 7]. 1.1.2 Tính chất hóa học và hoạt tính sinh học của hypericin a. Tính chất hóa học của hypericin Năm 1943, Brockmann lần đầu tiên phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của hypericin từ thực vật. Ông cũng là người đầu tiên tìm ra phương pháp tổng hợp hypericin từ các dẫn xuất anthraquinon emodin và sản phẩm khử hóa là emodin anthron. Cấu trúc hypericin được xác định bằng phổ nhiễu xạ tia X cho thấy phân tử Hypericin bị vặn và là một vòng xoắn kép [7]. Hypericin không tan trong nước, dầu, diclometan và các dung môi ít phân cực khác. Hypericin tan trong các dung dịch kiềm, các bazơ hữu cơ như pyridine và các dung môi hữu cơ phân cực như axeton, etanol, metanol, etyl axetat, etyl metyl xeton. Khi tan trong các dung dịch này, hypericin tạo ra các dung dịch màu đỏ có bước sóng phát xạ là 600 mm. Hypericin cũng tan trong các môi trường sinh học bằng cách tạo phức với các phân tử sinh học như ADN, albumin huyết thanh người (HSA), các lipoprotein màng tế bào LDL và HDL, màng tế bào và các chất của tế bào trong khi nó không liên kết với các phân tử IgG [7, 8, 9]. Hypericin thể hiện tính axít carboxylic mạnh với hai giá trị pKa là 1,7 và 12 trong etanol, trong DMSO hypericin có pKa 1,2. Hypericin tạo thành các muối mono bazơ với các bazơ vô cơ trong khoảng pH từ 4 - 11, các muối này tan trong nước và các dung môi phân cực, khác với hypericin tự do chỉ tan rất ít trong nước. Trong thực vật, hypericin tồn tại ở dạng muối với kali. Các muối mono của hypericin với natri được ứng dụng trong bệnh viện và các phép thử hoạt tính sinh học [7, 9]. Như đã đề cập, các muối của hypericin trong các dung môi hữu cơ có màu đỏ với cường độ hấp thụ cao (trong EtOH, λ1 = 545 và λ2 = 590 nm, ε = 52.000 với λ2) và phát quang màu đỏ. Các muối đơn trong nước ngưng tụ và tạo thành phân tử lượng cao không phát quang. Hypericin kết tủa trong đệm muối phốtphát (PBS) nhưng trong các dung môi hữu cơ phân cực liên kết giữa các phân tử bị phá vỡ và tạo thành các monome. Ở nồng độ thấp hypericin liên kết với các chất hoạt động bề mặt như nhưng ở nồng độ cao nó lại bị ngưng tụ [7]. 4 Hypericin và các muối của nó là các chất quang hóa (Các chất nhạy sáng). Khi có mặt ôxi không khí, hypericin ôxi hóa tryptophan, quá trình này bị ức chế bởi sodium azid và crocetin. Hypericin và các muối của nó trong các dung môi hữu cơ còn thể hiện tính chất quang khử (photoreduce), khử ôxi thành các hợp chất peroxid (H2O2). Phản ứng quang hóa của các phức hypericin-albumin huyết thanh người (HY-HSA) khi có mặt ôxi không khí sinh ra ôxi nguyên tử. Khi vắng mặt ôxi, các gốc tự do semiquinon được sinh ra. Tuy nhiên, khi nồng độ HSA cao, tương tự với nồng độ của protein này trong huyết thanh, sự hình thành các gốc tự do semiquinon và các anion một phần thay thế các gốc ôxi hoạt động. Đây chính là các tác nhân tiêu diệt virus, và là nguyên nhân lý giải hoạt tính chống virus của hypericin [2, 7, 9, 10]. Trong các sắc thể của tế bào, hypericin có khả năng phát quang, hiện nay nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang tập trung nghiên cứu và ứng dụng hypericin trong trị liệu quang động học (photodynamic), là một liệu pháp mà một chất hóa học được chuyển vào sinh vật rồi sau đó chất này được hoạt hóa bằng ánh sáng có bước sóng đặc biệt từ các đèn phát sáng chuyên biệt hay nguồn laze dùng cho các mục đích trị liệu [7, 9]. Trong chẩn đoán hình ảnh, bằng cách tiêm truyền tĩnh mạch hoặc uống, hypericin được tích lũy vào trong các tế bào ung thư và chỉ thị vị trí của các tổ chức ung thư. b. Các hoạt tính sinh học của hypericin Tính kháng khuẩn Hypericin có tính kháng khuẩn và là chất ức chế không đặc hiệu của men kinaza. Hypericin ức chế enzym dopamin β-hydroxylaza, qua đó làm giảm nồng độ dopamin, dù rằng nó cũng làm giảm nồng độ của norepinephrin và epinephrin. Dịch chiết thô của các loài Hypericum spp. có ái lực yếu với các thụ thể của MAO-A và MAO-B. Tuy nhiên hypericin tinh khiết lại không có tính chất này mà lại có ái lực với các thụ thể NMDA [9]. Hypericin cũng ức chế protein kinaza C là một enzym điều hòa quan trọng khác của các C virus (HVC). Hoạt tính chống virus Hypericin thể hiện khả năng chống virus rất hiệu quả. Chất này gây thụ động hóa một loạt các virus và retrovirus có lớp vỏ lipid như HIV, viêm gan B, cúm Typ A, Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex 1 và 2 (HSV-1 và HSV-2), EpsteinBarr virus (EBV) ... [1 - 22]. Các virus không có vỏ lipid như adenovirus và poliovirus không bị thụ động. Hypericin làm rối loạn nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình nhân bản của virus như lắp ghép, mọc chồi, tạo vỏ và cả quá trình 5 tổng hợp protein tùy thuộc tính chất của màng virus. Hypericin có chức năng như là một chất nhận điện tử từ các phản ứng vận chuyển điện tử sinh lý và đồng thời cho đi các điện tử và sinh ra các ôxi hoạt động [7]. Khả năng liên kết với các màng tế bào cũng đóng góp vào hoạt tính chống virus của hypericin. Bên cạnh sự thụ động hóa các virion, tương tác của hypericin với các màng tế bào cũng ảnh hưởng đến các pha khác của quá trình nhân bản và lây nhiễm của retrovirus. Hoạt tính tiềm năng chống sự hình thành các khối u của hypericin Vì hypericin ức chế hoạt tính enzym succioxidaza trong dịch huyền phù ti thể nên hợp chất này có thể cản trở sự hình thành các khối u. Thêm vào đó, phản ứng phân hủy quang hóa của hypericin cũng làm các khối u dưới da bị thoái hóa. Đây là hoạt chất duy nhất thể hiện hoạt tính tiêu diệt các khối u bề mặt phụ thuộc ánh sáng [3, 7, 9]. Một chức năng tế bào khác bị ức chế bởi hypericin là pha tan của phản ứng gây độc tế bào của các tế bào lympho CD8 (CTL). Các tế bào CTL là một phần quan trọng của đáp ứng miễn dịch tế bào tham gia vào sự thải ghép và tiêu diệt các tế bào khối u. Sự tiêu diệt các tế bào đích bởi CTL hoàn toàn bị ức chế bởi hypericin trong dịch nuôi cấy, sự biểu hiện thụ thể CD4 của tế bào T cũng bị ức chế bởi hypericin. Hypericin ức chế thuận nghịch hoạt tính tyrosine kinaza của nhân tố tăng trưởng biểu mô [3, 9, 11, 12, 13, 14, 15]. 1.1.3 Một số ứng dụng của các sản phẩm chứa hypericin Dịch chiết Hypericum có chứa thành phần hypericin hoặc sản phẩm sấy khô được sử dụng làm trà thảo dược và thuốc chống suy nhược OTC [8]. Trà thảo dược: Ở Hà Lan, trà thảo dược được bán trên thị trường dưới dạng túi lọc. Mỗi túi trà chứa 2 g Hypericum (lá khô) cung cấp 1 liều khoảng 250 µg hypericin/tách trà. Khách hàng được khuyên mỗi ngày uống 3 lần, mỗi lần từ 1 đến 2 tách, như vậy nó cung cấp 1500 µg hypericin một ngày (khoảng 25 µg/kg thể trọng/ngày). Thuốc chống suy nhược OTC: Năm 1996, Kerb đề cập đến việc sử dụng Hypericum trong thuốc OTC ở Đức. OTC được bán ra với số lượng 106 triệu liều hàng ngày/năm (daily doses per year) trong năm 1994. Mỗi viên (“LI 160/PK) chứa 300 mg cao chiết Hypericum có thể đạt hàm lượng 250 µg hypericin, tương đương một liều 3,8 µg hypericin/kg thể trọng/một viên. Những liều hàng ngày có thể nhiều hơn tới 10 lần. Ở Hà Lan có 2 loại tương tự nhau của viên này được bán trên thị 6 trường, chứa từ 180 đến 330 µg hypericin trong khoảng 300 mg cao chiết Hypericum mỗi viên. Khách hàng được khuyên dùng 6 hoặc 3 viên/ngày, trong trường hợp cả 2 loại đều chứa 1000 µg/g (khoảng 15 µg/kg thể trọng một ngày). Tên thương mại của loại thuốc chống suy nhược được bán ở Đức là Pchychotonin® [8]. Ở Trung Quốc, hypericin từ Hypericum perforatum L. đã được tách chiết và bào chế thành công làm thuốc chống virus H5N1. Phòng thí nghiệm công trình trọng điểm thuốc thú y và gia cầm thuộc Viện khoa học nông nghiệp Trung Quốc đã hoàn thành thí nghiệm lâm sàng chữa trị virus cúm gia cầm týp A H5N1 tại Phòng thí nghiệm P3 của trường Đại học nông nghiệp Hoa Nam: 12 giờ sau khi bị cấy vi-rút cúm týp A H5N1 bằng nhân công, 16 con gà thí nghiệm được dùng thuốc Hypericin 0,0108 g và 0,0216 g liên tục trong 3 ngày liền và đều còn sống. Sau 15 ngày thí nghiệm, nhóm Nghiên cứu đã giải phẫu các nhóm gà thí nghiệm, họ đã dùng phương pháp tiêm chủng phôi gà để phân tích vi-rút và phương pháp RT-PCR để kiểm tra sự phân li của vi-rút, mọi kết quả kiểm tra đều âm tính, tỷ lệ diệt vi-rút cúm týp A H5N1 và H9N2 đạt tới 100 % và 99,9 %. Kết quả thử nghiệm cho thấy hypericin có thể chữa khỏi 100 % gia cầm nuôi bị cấy virus H5N1 và cũng có tác dụng phòng chống đối với virus cúm gia cầm týp A H9N2 [5, 7, 25]. Hiện tại hypericin đang được tập trung nghiên cứu dùng trong trị liệu quang hóa chữa các bệnh do các loại virus có vỏ lipid gây ra như HIV, MCMV murine CMV, SV (sindbis virus), H1N1 và biến thể H9N1, FV, HSV-1, HSV-2, EIAV (enemia virus) và ung thư [1-25]. 1.2 Các phương pháp công nghệ sản xuất hypericin 1.2.1 Công nghệ tổng hợp hypericin [26, 27] Hypericin thương mại được sản xuất từ emodin. Emodin được chuyển hóa thành protohypericin, chất này khi được chiếu sáng sẽ được chuyển hóa thành hypericin. Bước chuyển hóa đầu tiên cần xử lý emodin trong dung dịch kiềm khi có mặt hydroquinon trong một ampule hàn kín trong thời gian 3 tuần ở 120°C. Hiệu suất chuyển hóa protohypericin rất thấp, nhỏ hơn 29 %. Ngoài hiệu suất phản ứng thấp, một khó khăn khác của quy trình này là không khả thi ở qui mô lớn do cần một lượng lớn dung môi và quá trình phân tách sắc ký phức tạp. Theo các cách khác, emodin được khử thành emodin anthron, sau đó ôxi hóa thành protohypericin trong dung dịch pyridin khi có mặt piperidin. Tuy vậy, hiệu suất của phương pháp này thấp hơn 10 %. 7 Năm 1991, Mazur và các cộng sự [26] đã tìm ra một phương pháp tổng hợp mới đáp ứng được các yêu cầu là quy trình tổng hợp đơn giản, hiệu suất cao và có thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp. Theo quy trình này, hypericin được tổng hợp bằng cách dime hóa ôxi hóa emodin anthron bằng cách cho chất này phản ứng với một chất chuyển ôxi (pyridin N-oxid) trong một dung môi được lựa chọn là các amin bậc ba (pyridin) khi có mặt một chất xúc tác ôxi hóa khử FeSO4 và một amin bậc hai (piperidin) để tổng hợp ra protohypericin. Protohypericin sau đó được chuyển thành hypericin bằng cách chiếu sáng với ánh sáng khả kiến. Phương pháp tổng hợp nguyên liệu đầu vào, emodin anthron được tổng hợp với năng suất cao đã được thương mại hóa. Hiệu suất chuyển hóa emodin anthron thành protohypericin dưới các điều kiện chọn lọc đạt tới 70 %. Chất này được tách trực tiếp từ hỗn hợp phản ứng mà không cần thêm bất cứ bước chiết tách hay sắc ký nào khác. Sau đây là công nghệ sản xuất hypericin đã được các tác giả nói trên công bố. Hòa tan emodin anthron trong hỗn hợp pyridin và piperidin, thêm vào hỗn hợp pyridin N-oxid và FeSO4, đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 1 giờ ở 100°C. Hỗn hợp sản phẩm được cô kiệt trong chân không, sau đó trộn với dung dịch axít clohyđric 3 % theo tỉ lệ 1 : 20 (v/v) để kết tủa protohypericin màu tối. Kết tủa này được lọc và rửa với nước cho đến khi dịch rửa đạt pH trung tính. Hòa tan 8 protohypericin trong axeton và chiếu sáng bằng đèn halogen công suất 500 W qua đêm. Dung dịch axeton sau đó được cô trong chân không và trộn với hexan theo tỉ lệ 1 : 10 (v/v). Lọc thu kết tủa hypericin, hiệu suất phản ứng là 63 %. Hypericin được tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp điều chế và kết tinh [26]. 1.2.2 Công nghệ chiết xuất hypericin từ các loài Hypericum [28 - 32] Như đã nêu trong mục 1.2.1, hypericin tổng hợp từ emodin anthron đã bắt đầu được sử dụng trong dược phẩm từ những năm 1990, tuy vậy giá thành của hypericin tổng hợp vẫn còn cao so với chiết xuất từ thiên nhiên. Thêm vào đó, nồng độ của hypericin trong thuốc uống (dạng capsual) và tiêm truyền thường rất thấp: ~ 0,3 % theo tổng khối lượng đóng thuốc, liều dùng điều trị cũng chỉ ở mức thấp khoảng 15 µg/kg thể trọng một ngày. Do đó, các phác đồ điều trị ở Mỹ và châu Âu vẫn sử dụng cả cao chiết Hypericum perforatum L. (thường chứa khoảng 3 ‰ hypericin, được đóng thuốc dạng capsual), các bác sỹ Âu - Mỹ cũng vẫn ưa thích sử dụng St. John’s Wort Extract 0,3 % hypericin trong các đơn thuốc [8]. Chính vì vậy, ngay tại Bắc Mỹ và châu Âu, Cỏ Thánh Giôn vẫn được phát triển mạnh làm nguyên liệu chính khi sản xuất dược phẩm chứa 0,3 % hypericin. Bảng 1.1 dưới đây nêu tiêu chuẩn chất lượng của bột cao chiết St. John’s Wort Extract theo Dược điển Mỹ USP/NF và Dược điển châu Âu EU Pharmacopoeia năm 2007. Bảng 1.1: Tiêu chuẩn bột cao chiết Cỏ Thánh Giôn theo USP/NF và EU Ph. 2007 ST JOHNS WORT EXTRACT 0.3 % HYPERCIN Cao chiết Cỏ Thánh Giôn 0,3 % Hypericin Botanical Sources: Hypericum perforatum L Dược liệu: Hypericum perforatum L Used Part: Stems & Flowers Bộ phận dùng: Cành và Hoa Appearance: Fine Powder Trạng thái: Bột tinh sạch Color: Dark Brown Màu sắc: Màu nâu tối Odor: Characteristic Mùi: Đặc trưng Taste: Characteristic Vị: Đặc trưng Assay(Hypercin): 0.3% Min Hàm lượng Hypericin: ≥ 0,3 % Mesh Size: 95 % Min Through 80 Mesh Cỡ hạt: ≥ 95 % qua rây 80 Mesh Loss on Drying: 5.0% Max Hàm ẩm: ≤5% Sulphated Ash: 5.0% Max Tro sulfat: ≤5% 0,40 - 0,60 g/mL Bulk Density: 0.40 – 0.60 g/mL Tỷ trọng: Heavy Metal: 20ppm Max Kim loại nặng: ≤ 20 ppm Arsenic (as As2O3): 2ppm Max Arsen ≤ 20 ppm Total Plate Count: 1,000 cfu/g Max + Tổng vi sinh: ≤ 1000 bào tử/g Yeast and Mold: 300 cfu/g Max + Nấm men và mốc: ≤ 300 bào tử/g E.Coli: Negative + E.Coli: Âm tính Salmonella: Negative + Salmonella: Âm tính Staphylococcus: Negative + Staphylococcus: Âm tính Microbiology Control: Vi sinh vật: 9 a. Chiết xuất cao chiết giàu hypericin từ Hypericum perforatum L. Cho đến nay, ở châu Âu và Bắc Mỹ vẫn áp dụng công nghệ truyền thống để chiết Hypericum perforatum L.. Cành, lá và hoa được sấy khô, nghiền thành bột mịn tới cỡ hạt dưới rây 0,3 mm. Bột nguyên liệu được chiết hồi lưu trên hệ thiết bị Soxhlet công nghiệp lần lượt bằng n-hexan (quá trình loại chất béo - defatted) rồi sau đó bằng metanol. Dịch chiết metanol được cô loại kiệt dung môi dưới áp suất thấp. Sản phẩm bột cao chiết được chế tạo bằng phương pháp đông khô hoặc sấy phun. Với phương pháp công nghệ này, từ nguyên liệu H. perforatum L. loại tốt (chứa từ 0,1 - 0,2 % hypericin) sẽ thu được ~ 25 % bột cao chiết có hàm lượng hypericin cao (từ 0,3 - 0,4 %), hiệu suất thu nhận hypericin từ nguyên liệu đạt gần toàn lượng [28, 31, 32]. Với sự phát triển của kỹ thuật hiện đại, một số công nghệ chiết mới đã được nghiên cứu để đưa vào áp dụng trong sản xuất cao chiết Hypericum. Trong đó đáng chú ý là các công nghệ sử dụng kỹ thuật chiết siêu âm (USE) và công nghệ chiết dưới áp suất cao ~ 100 atm (PSE) để hỗ trợ nâng cao năng suất và rút ngắn thời gian chiết. Để lấy làm ví dụ, bảng 1.2 dưới đây nêu kết quả nghiên cứu so sánh hiệu quả chiết của công nghệ truyền thống và công nghệ có hỗ trợ của phương pháp kỹ thuật mới [28, 29]. Bảng 1.2: Hàm lượng Hypericin trong cao chiết H. perforatum L. Lượng mẫu khô (g) Cao chiết Khối lượng (g) và (%) so với nguyên liệu Trong cao chiết Trong Dược liệu 50 g 12,4 g (24,8 %) 0,390 % 0,097 % Chiết ngâm USE 20 g 1,95 g (8,25 %) 0,180 % 0,250 % o 20 g 4,60 g (23,0 %) 0,178 % 0,040 % Chiết PSE ở 50 C 10 g 2,02 g (20,2 %) 0,210 % 0,040 % o 10 g 2,81 g (28,1 %) 0,420 % 0,120 % Kỹ thuật chiết Chiết Soxhlet Chiết PSE ở 25 C o Chiết PSE ở 100 C Hàm lượng Hypericin (%) Nhìn chung, hiệu quả chiết theo tất cả các kỹ thuật chiết đều lệ thuộc rất lớn vào chất lượng nguyên liệu. Tuy nhiên, phương pháp chiết sử dụng siêu âm (USE) tỏ ra không phù hợp với H. perforatum L.. Phương pháp chiết Soxhlet và chiết dưới áp suất cao khi thực hiện ở nhiệt độ sôi của metanol đều cho hiệu quả chiết tương đương, với lượng hypericin được trích ly triệt để khỏi nguyên liệu (~ 98 - 100 %). Phương pháp chiết PSE có thời gian thực hiện tổng cộng cả hai bước ~ 2 giờ, ngắn hơn rất nhiều so với 8 giờ khi chiết Soxhlet. 10 b. Phương pháp tinh chế hypericin từ sản phẩm tổng hợp và chiết xuất Để tinh chế sản phẩm cao chiết St. John’s Wort Extract nhằm nâng hàm lượng hypericin tới 0,5 % hoặc cao hơn, ở châu Âu thường sử dụng sắc ký lỏng điều chế trên pha tĩnh trao đổi ion lưỡng tính Diaion HP 20, cột tách ID 200 x L 420 mm, với pha động là Etanol 95 %, phân đoạn diệp lục và terpen được rửa giải với axeton. Hypericin tinh khiết ≥ 98 % từ nguồn tổng hợp hữu cơ hoặc chiết xuất từ Cỏ thánh Giôn đều phải tinh chế bằng phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong môi trường axít/ancol - thông thường là dung dịch HCl 0,5 - 1 % trong metanol hoặc etanol [28 - 34]. Trong công nghiệp, hypericin được tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp điều chế. Cột tách ID 400 x L 350 mm, pha tĩnh RP-C8 hoặc RP-C18, hệ dung môi sử dụng làm pha động rửa giải sắc ký thông thường là Metanol/Etyl axetat/đệm photphat (pH 2,5), với kỹ thuật tách này, năng suất đạt tới 200 g hypericin 98 % một lượt tách [28 - 34]. 1.3 Một số loài Ban - Hypericum ở Việt Nam Trong Y học cổ truyền của Việt Nam trước đây, các thầy lang đều đã sử dụng cỏ Ban, Ban rỗ, Nọc sởi là các loài Ban của Việt Nam để sắc nước làm thuốc uống trị cảm cúm, sởi và sốt phát ban; tên gọi cỏ Ban cũng xuất phát từ chính công dụng của loài cây này. Nhưng trải qua nhiều thế hệ, với nhiều biến động xã hội lớn, ngày nay ít người còn biết đến các bài thuốc dân gian có sử dụng cỏ Ban [35]. Theo các tác giả Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam còn lại một số loài Hypericum là Ban rỗ, Ban Nepan, Ban lá dính [35, 36]. Tác giả Nguyễn Quốc Thức, Viện Dược liệu cũng đã công bố một số thành phần flavon (quercetin, quercitrin và astilbin) từ một số loài Ban H. japonicum và H. patulum của Việt Nam [38, 39, 40]. Trong quá trình nghiên cứu thực địa tìm nguồn nguyên liệu cho đề tài này, phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt, chúng tôi đã khảo sát và tìm lại được ở Đà Lạt hai loài Ban rỗ (Hypericum ascyron L.) và cây Nọc sởi (chưa được khẳng định chính xác - tạm gọi là Hypericum spp.). Loài Hypericum perforatum L., nhân dân và các nhà vườn gọi là Hoa Chuỗi ngọc, được nhập khẩu và nhân giống ở Đà Lạt đã bị lai tạo với mục đích trồng làm cảnh, không còn là loài thuần chủng làm dược liệu như St. John’s Wort ở Bắc Mỹ và châu Âu. 11 Cây Ban rỗ: Cây Ban rỗ, Hồ nam liên kiều, còn có tên thuốc là Hồng hán liên - Hypericum ascyron L., thuộc họ Măng cụt - Clusiaceae. Cây thảo lâu năm, không lông, cao 50 - 80 cm, nhánh có 4 cạnh. Lá có phiến thon, dài 5 - 9 cm, rộng 1 - 2 cm, gốc có hình mũi tên, có đốm trong gân phụ 5 cặp, không có cuống. Hoa ở ngọn, 1 - 3 hoa, to; cuống dài 1 - 1,5 cm; lá đài không có rìa lông; cánh hoa 5 vặn, dài 2,5 - 3,5 mm, vàng đỏ cam; nhị thành ba nhóm; bầu 3 ô. Quả nang dài 2,5 cm, hạt nhỏ. Cây Ban rỗ ra hoa tháng 6 - 7, quả tháng 8 - 9. Nhân dân thường dùng để cầm máu, trừ phong thấp, trị đòn ngã tổn thương. Có khi dùng uống thay trà. Quả và hạt đôi khi còn được dùng phối hợp với các vị thuốc khác để trị các bệnh về da, điều hoà kinh nguyệt và trị lậu. Công dụng chính là dùng chế nước uống có hiệu quả làm cho tai thính để tiếp nhận âm thanh. Theo tác giả Võ Văn Chi [35], cây này phân bố nhiều ở các savan trên Lào Cai, nhưng với thực tế khảo sát còn hạn chế, chúng tôi chưa tìm được vùng tập trung cây này ở Lào Cai. Trên cao nguyên Lâm Đồng chúng tôi đã tìm lại được một số bụi mọc hoang trong các khoảng rừng trống ở Đà Lạt. Cây đã được các chuyên gia thực vật của Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt khẳng định về mặt thực vật học. Cây Nọc sởi: Cây bụi nhỏ, thân và lá không lông, cao 30 - 50 cm, thân tròn hơi có cạnh. Phiến lá thon, dài 4 - 5 cm, rộng 1 cm, gốc hình mũi tên, không cuống. Hoa ở ngọn, 1 - 3 hoa, to; cuống dài 1 - 1,5 cm; lá đài không có rìa lông; cánh hoa 5, dài 2,5 - 3,5 mm, vàng cam; nhị thành ba nhóm; có bầu. Quả nang dài 2 - 3 cm, hạt nhỏ. Cây ra hoa, quả tháng 8 - 9, cây này phân bố nhiều trên Đà Lạt, mọc hoang trong các khoảng rừng trống. Về mặt hình thái thực vật, cây tương đối giống với các loài Hypericum pulcherum và Hypericum japonicum [theo Giáo sư Vũ Văn Chuyên, Đại học Dược Hà Nội - Tạp chí Cây thuốc quý, 13 - 2006]; Hiện nay, chúng tôi vẫn tiếp tục nhân giống để theo dõi và nghiên cứu, từ đó sẽ có kết quả phân loại chính xác hơn. Trong khuôn khổ đề tài này mẫu cây Nọc sởi tạm được gọi là cây Hypericum spp.. 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài Ban của Việt Nam được thu thập tại Đà Lạt vào tháng 6 năm 2009. Mẫu sử dụng toàn cây, được phơi khô trong bóng râm rồi nghiền thành bột mịn dưới rây 0,3 mm. Kết quả như sau: + Ban rỗ - Hypericum ascyron L.: Đã thu thập 35 kg mẫu cây tươi, sau khi xử lý thu được 6,5 kg bột nguyên liệu; + Nọc sởi - Hypericum spp.: Đã thu thập 15 kg mẫu cây tươi, sau khi xử lý thu được 2,5 kg bột nguyên liệu. 2.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1 Chiết xuất cao tổng số giàu các thành phần naphthodianthron Qua tham khảo tài liệu và các thí nghiệm khảo sát sơ bộ, chúng tôi lựa chọn phương án chiết Soxhlet truyền thống đã cải tiến theo Ghosal [32] để nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chiết cây Hypericum của Việt Nam. Hình 2.1 dưới đây mô tả hệ thiết bị chiết Soxhlet. Nguyên liệu được nạp vào túi chiết đặt trong bầu chiết. Đun chiết với dung môi n-hexan trong 1 giờ, điều khiển tốc độ hồi lưu sao cho dịch trong bầu chiết rút xuống bình đun khoảng 3 - 5 phút một lần. Nguyên liệu sau khi “defatted” được tháo ra khỏi túi chiết, làm khô trong chân không ở 50 - 60oC, sau đó nạp lại vào túi chiết rồi tiếp tục chiết soxhlet bằng metanol/nước (8 : 2, v/v nét cải tiến của Ghosal) [32] trong khoảng từ 6 - 10 giờ. Tốc độ hồi lưu được điều khiển sao cho dịch chiết tụt xuống bình đun khoảng 5 - 10 phút/lượt rút dịch. Để gây đông tụ các chất màu bazơ và tăng tính tan Hình 2.1: Bộ dụng cụ Soxhlet của các hợp chất phenolic, dung môi metanol/nước được pha thêm NaOH đến pH từ 8,5 - 9. 12 Dịch chiết được lọc sạch và cô loại kiệt metanol ở áp suất giảm. Lúc này thể dịch cô còn lại khoảng 1/10. Axít hóa dịch cô bằng axít photphoric đến pH 2,0 - 2,5; để tĩnh tránh ánh sáng qua đêm (khoảng 12 giờ) ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện kết tủa ổn định màu nâu tối. Lọc lấy kết tủa và rửa lại bằng nước de-ion nhiều lần đến khi nước rửa trung tính. Làm khô sản phẩm ở 50 mbar, 50oC trong 2 giờ rồi nghiền, rây thành bột mịn dưới rây 0,25 mm. Bột sản phẩm có màu nâu đỏ, hàm lượng hypericin ~ 0,2 - 0,4 % phân tích theo HPLC, bảo quản trong lọ kín màu nâu, tránh ánh sáng và nhiệt độ cao. 2.2.2 Phân lập sản phẩm giàu hypericin (≥ 90 %) từ cao chiết tổng số Hình 2.2: Thiết bị tách sắc ký MPLC Sản phẩm giàu thành phần hypericin được phân lập từ cao chiết Hypericum của Việt Nam trên thiết bị tách sắc ký trung áp điều chế MPLC của Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam (Hình 2.2). Thiết bị sử dụng một bơm định lượng trung áp MD80/100 nén dung môi đi qua cột tách (tốc độ dòng 0 - ~ 30 ml/phút, áp lực nén 0,5 - 20 bar). Cột tách sắc ký kích thước ID 50 x L 350 mm được nhồi pha đảo Merck LichroPrep RP-C18 (40 - 63 µm) và nén chặt bằng thiết bị chuyên dùng. Điều kiện phân tách sắc ký điều chế được xây dựng và nghiên cứu hoàn thiện dựa theo điều kiện tách sắc ký St. John’s wort Extract trên cột Silica gel RP-C18 của các tác giả Anand và cộng sự - Ấn Độ [28]. 13 2.2.3 Phân tích các sản phẩm a/ Phổ hấp thụ phân tử - Phổ tử ngoại: Sản phẩm Hypericin của đề tài được ghi và phân tích phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) trên máy UV-Vis 3101 PC Shimadzu tại Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển bền vững, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. b/ Sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ: Các sản phẩm phân lập từ Hypericum Việt Nam được phân tích định tính và bán định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối trực tuyến khối phổ (HPLCMS) trên hệ thiết bị LC-MSD-Trap-SL Agilen 1100, Viện Hóa học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Điều kiện phân tích: - Cột tách: 4,5 x 250 mm; Pha tĩnh RP C-18 cỡ hạt 5 µm; - Pha động: 1. Acetonitril/Metanol/Axit axetic gradient; 2. Metanol/Etyl axetat/H3PO4 (pH 2,5) - Detector UV-Vis: 254 nm, 290 nm, 590 nm; - Detector MSD-Trap-SL; - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, 1,5 ml/phút và 2,5 ml/phút; - Mẫu phân tích 5 µl dung dịch mẫu pha trong CH3OH nồng độ 5 mg/ml. c/ Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Hypericin 90 % là sản phẩm của đề tài được phân tích sơ bộ cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13 C NMR trên máy NMR Brucke AVAN 500 MHz của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.4 Thử nghiệm - sàng lọc hoạt tính chống virus của các sản phẩm Hoạt tính chống virus của các sản phẩm của đề tài đã được sàng lọc và thử nghiệm in vitro tại Viện Khoa học Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc và tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử dựa trên cơ sở đánh giá mức độ thụ động hóa sự hình thành khuẩn lạc của các virus Influenza A/Port-Chalmers/73 và Herpes simplex dòng KOS (HSV-1). Kết quả được ghi lại bằng phép đo phóng xạ của 3H-uridin có trong ARN của các tế bào bị gây nhiễm; đo trên phiến thử 96 giếng (8 × 12). “Hypericin 90 %” và “Chế phẩm chống virus” được pha loãng bằng đệm photphat Saline và đưa vào các giếng theo dãy các nồng độ giảm dần; dịch virus 14 được cho vào các giếng với số lượng và thể tích thống nhất. Phiến thử được ủ lắc trong nhiều giờ ở 4°C sau đó cho lây nhiễm vào các đĩa tế bào Vero (nuôi cấy một lớp) đường kính 60 mm bằng cách: Nhỏ hỗn hợp virus/mẫu thử lên các đĩa tế bào nuôi cấy với thể tích 0,2 ml/ đĩa và ủ 1 giờ ở 37°C. Tạo lớp trên: FCS (huyết thanh nhau thai bê) 2 % trong agar. Tiếp tục ủ 3 ngày trong tủ nuôi cấy với khí quyển CO2. Nhuộm màu và đếm số khuẩn lạc. 15 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá nguyên liệu hai loài Ban - Hypericum Chúng tôi tiến hành chiết bột nguyên liệu khô từ hai loài Ban đã thu thập được của đề tài theo quy trình chiết Soxhlet nêu ở mục 2.2.1. Cụ thể như sau: + Lượng mẫu sử dụng trong mỗi lượt chiết là 10 g; + Các soxhlet phân tích đánh giá có bầu chiết dung lượng 250 ml; + Điều kiện phân tích nhanh HPLC (Xem thêm mục 2.2.3b) được chuẩn từ cơ sở dữ liệu của hãng Agilent Technology theo tác giả Robert Ricker (2002): - Pha động sắc ký: 23 % 25 mM Na2HPO4/77 % Metanol; - Tốc độ dòng pha động 1 ml/phút; - UV-Vis 254 nm. Với điều kiện phân tích nêu trên, hypericin có thời gian lưu khoảng 5 phút, các cấu tử còn lại trong hỗn hợp bị rửa giải ngay từ 1 - 3 phút đầu; + Hàm lượng Hypericin = % theo UV x Lượng cao chiết (g)/10 (g). Bảng 3.1 nêu kết quả phân tích đánh giá hàm lượng của hypericin trong hai nguyên liệu (hàm lượng tương đối theo mật độ hấp thụ UV 254 nm). Bảng 3.1: Hàm lượng hypericin trong hai loài Hypericum Nguyên liệu % Hypericin/cao chiết Lượng cao chiết % Hypericin/ng.liệu Hypericum ascyron L. 0,31 % 3,08 g 0,095 % Hypericum spp. 0,32 % 2,96 g 0,094 % Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng hypericin trong cả hai loài gần giống nhau với sai lệch ở mức độ 0,001 %. Như vậy, có thể kết luận hai loài này có giá trị tương đương khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất hypericin. Hàm lượng hypericin hai loài Ban này (0,095 %) thấp hơn không đáng kể so với St. John Wort của châu Âu, Bắc Mỹ và Ấn Độ: 0,09 - 0,12 % [28 - 32]. Từ các đánh giá sơ bộ kết quả phân tích nguồn cây hoang dại nêu trên, chúng tôi hiện đã phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt chuẩn bị nhân giống và trồng thử để lựa chọn loài cho hiệu quả nuôi trồng ổn định và khai thác tốt nhất phục vụ mục đích làm dược liệu, phát triển kết quả của đề tài. 16