Tài liệu Nghiên cứu công nghệ chiết tách concret trầm hương từ cây dó aquilaria spp. bằng co2 siêu tới hạn phục vụ xuất khẩu

Bé c«ng th−¬ng ViÖn hãa häc c«ng nghiÖp viÖt nam B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu khcn Tªn ®Ò tµi: NGHI£N CøU C¤NG nghÖ chiÕt t¸ch concret trÇm h−¬ng tõ c©y dã aquilaria spp. b»ng ph−¬ng ph¸p CO2 siªu tíi h¹n phôc vô xuÊt khÈu §Ò tµi nghiªn cøu KHCN cÊp Bé ThS. NguyÔn Ngäc Thanh 7641 01/02/2010 Hµ Néi, 12/2009 Bé c«ng th−¬ng ViÖn hãa häc c«ng nghiÖp viÖt nam B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu khcn Tªn ®Ò tµi: NGHI£N CøU C¤NG nghÖ chiÕt t¸ch concret trÇm h−¬ng tõ c©y dã aquilaria spp. b»ng ph−¬ng ph¸p CO2 siªu tíi h¹n phôc vô xuÊt khÈu §Ò tµi nghiªn cøu KHCN cÊp Bé Chñ nhiÖm ®Ò tµi: ThS. NguyÔn Ngäc Thanh C¸n bé tham gia: TS. L−u Hoµng Ngäc TS. Phan Thanh B×nh ThS. NguyÔn Thu H−¬ng ThS. Lª §¨ng Quang ThS. NguyÔn Mai C−¬ng ThS. NguyÔn Thanh Loan CN. Lª Ngäc Thøc KS. NguyÔn ThÞ Thu Trang Hµ Néi, 12/2009 MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3 1.1. Công nghệ chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn (Supercritical CO2 - SCO2) 3 1.1.1. Vài nét về trạng thái siêu tới hạn 3 1.1.2. Lựa chọn dung môi CO2 siêu tới hạn trong chiết tách 5 a. Tính tan của các chất trong CO2 siêu tới hạn 5 b. Sử dụng dung môi hỗ trợ trong quá trình chiết xuất bằng SCO2 6 1.1.3. Một số ứng dụng của công nghệ chiết xuất các sản phẩm thiên nhiên 6 bằng CO2 siêu tới hạn trên thế giới a. Chiết xuất hoạt chất từ hoa Huplon 7 b. Chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học, tinh dầu và các chất thơm từ 8 thảo dược bằng công nghệ sử dụng SCO2 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh thái và phân bố của cây Dó Bầu 10 1.2.2. Sự tạo thành Trầm hương trên cây Dó 10 1.2.3. Giá trị kinh tế và tình hình phát triển cuả cây Dó trên thế giới và trong 12 nước 1.2.4. Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Aquilaria 13 a. Các sesquiterpene 13 b. Các chromon 15 c. Các thành phần hóa học khác 16 1.3. Tình hình nghiên cứu tinh dầu trầm hương 16 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu 22 2.2.2. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 22 2.2.3. Phương pháp chiết bằng SCO2 22 a. Thiết bị chiết suất SFT 250 và thao tác thực nghiệm 22 b. Nguyên lý hoạt động và sự biến đổi trạng thái của CO2 trong quá trình 24 chiết 2.2.4. Chiết và chưng cất các mẫu đối chứng theo phương pháp chiết tách 25 1 truyền thống a. Phương pháp cất cuốn theo hơi nước 25 b. Phương pháp chiết bằng n-hexan 26 2.2.5. Tối ưu hóa các điều kiện công nghệ chiết bằng SCO2 26 2.2.6. Phương pháp phân tích thành phần hóa học của sản phẩm 27 a. Các phương pháp sắc ký 27 b. Các phương pháp khảo sát cấu trúc 29 2.3. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm khác 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Khảo sát nguyên liệu 31 3.1.1. Khảo sát độ ẩm nguyên liệu 31 3.1.2. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả chiết 31 3.2. Mô hình hóa quá trình thực nghiệm và xác định điều kiện chiết 32 3.2.1. Nguyên liệu gỗ mang Trầm loại 5 32 a. Xây dựng hàm mục tiêu trên phần mềm MODDE 9.0 32 b. Kết quả tính cực trị và xây dựng bề mặt đáp ứng trên phần mềm 33 c. Tiến hành các thí nghiệm kiểm chứng 37 3.2.2. Nguyên liệu gỗ mang Trầm loại 6 37 a. Xây dựng hàm mục tiêu trên phần mềm MODDE 9.0 37 b. Kết quả tính cực trị và xây dựng bề mặt đáp ứng trên phần mềm 39 c. Tiến hành các thí nghiệm kiểm chứng 42 3.3. Chiết concret và cất cuốn tinh dầu trầm hương đối chứng 42 3.3.1. Cất cuốn theo hơi nước 42 3.3.2. Chiết bằng n-hexan 43 3.4. So sánh thành phần cấu tử dễ bay hơi trong các mẫu 43 3.5. Đề xuất tiêu chuẩn sản phẩm chiết từ gỗ mang trầm bằng SCO2 46 3.6. Phân lập một số cấu tử của mẫu chiết bằng SCO2 51 3.6.1. Phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) 51 3.6.2. Phân tách bằng sắc ký cột (CC) 51 3.7. Khảo sát cấu trúc của các chất phân lập 52 3.8. Đề xuất sơ đồ nguyên lý hệ thống chiết 100L 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 2 LỜI MỞ ĐẦU Các phương pháp chiết tách và khai thác chất thơm, tinh dầu, hương liệu từ giữa thế kỷ 20 đã mang nhiều nét biến đổi mạnh mẽ so với diện mạo của nó trước đây. Bên cạnh các phương pháp cổ điển như chưng cất, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, các phương pháp mới có tính hiệu quả cao như quá trình chiết với sự hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm, dung môi CO2 siêu tới hạn (SCO2) đang ngày càng thay thế trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Phương pháp chiết tách bằng dung môi CO2 siêu tới hạn mang tính kỹ thuật hoàn toàn mới do các đặc điểm rất lý tưởng trong vùng siêu tới hạn của CO2. Dung môi CO2 ở trạng thái tồn tại giữa lỏng và khí, tỷ trọng của dung môi sấp xỉ bằng với chất lỏng, hệ số khuếch tán và độ linh động cao tạo ra quá trình chuyển khối mạnh mẽ, hòa tan được cả những chất dễ bay hơi trong thành phần tinh dầu bên cạnh đó kéo ra cả các oleoresin khó bay hơi. Quá trình chiết diễn ra ở vùng nhiệt độ thấp từ 20-800C không làm phân giải các chất thơm, CO2 tách ra hoàn toàn khỏi dịch chiết, không để lại dư lượng dung môi và kim loại nặng. Sản phẩm chiết mang hương thơm gần gũi với tự nhiên nhất so với các phương pháp khác. Sinh trưởng và phát triển chi Dó mạnh mẽ ở Việt Nam đã tạo ra được một thuận lợi lớn cho khai thác nguồn lâm sản quý giá này. Trầm hương là một sản vật rất đặc trưng được sinh ra từ những cây thuộc chi Dó, từ xa xưa Trầm Hương Việt Nam đã được ưa chuộng sử dụng trên nhiều nước, và cho tới hiện nay khi mà các loài này có nguy cơ bị tuyệt chủng, chỉ còn lại rất ít nước thuộc vùng Đông Nam Á còn có khả năng khai thác trầm. Trầm đã trở thành một sản phẩm mang tính riêng và đặc trưng ở khu vực. Riêng Việt Nam đã chiếm 6 loài Dó : A.baillonii ; A.banaensis ; A.crassna ; A. malaccensis ; A. rugosa L.C.Kiet ; A. sinensis (A.agallocha) đa dạng và sản lượng nhiều nhất trong khu vực. Việt Nam cũng là nước đứng đầu trong số các nước xuất khẩu Trầm hương, không những vậy chất lượng Trầm còn có thể đạt tới hạng cao nhất. Một khó khăn hiện nay đó là hiện tượng trồng và kinh doanh cây Dó tràn lan, không theo quy hoach đã đến mất kiểm soát về chất lượng cây giống, chất lượng Trầm, phổ biến là hạng 5 và 6. Việt Nam đang chịu nhiều thiệt thòi khi phải xuất khẩu các mặt hàng Trầm thô ít giá trị, khả năng khai thác tất cả các nguồn lợi từ cây Dó không đạt, mục đích chính vẫn là tạo Trầm thô hoặc đồ gỗ mỹ nghệ để bán. 1 Tinh dầu Trầm hương (agarwood oil) được biết đến trên thế giới như một loại hương liệu quí dùng để chế tạo nước hoa cao cấp, chất định hương bền mùi. Giá trị của tinh dầu rất cao, giá đắt, thị trường tiêu thụ trực tiếp là các nước Ả Rập, Nhật Bản, khu vực Hồi giáo, Phật giáo, các ngành công nghiệp hương liệu, mỹ phẩm dược phẩm và thực phẩm. Thực trạng ngành trồng Dó đang phát triển nhưng chưa được quy hoạch, chưa có chiến lược đa dạng hóa sản phẩm. Lĩnh vực sản xuất tinh dầu Trầm còn yếu, sản lượng thấp, cở sở nhỏ lẻ và chủ yếu là chưng cất thủ công. Trước vấn đề cần khai thác các nguồn chất thơm, tinh dầu từ cây Dó với mục đích khai thác tốt hơn, nâng cao chất lượng một loại sản phẩm quí, đề tài ‘‘Nghiên cứu công nghệ chiết tách concret Trầm hương từ cây Dó Aquilaria spp. bằng CO2 siêu tới hạn phục vụ xuất khẩu’’ được tập trung nghiên cứu với các nội dung : • Nghiên cứu quá trình chiết concret từ cây Dó bầu Aquilaria crassna Piere ex Lecomte bằng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn trên gỗ loại 5, 6. • Phân tích thành phần các cấu tử chính, dễ bay hơi bằng GC-MS, so sánh với tinh dầu cất lôi cuốn bằng hơi nước và concrete chiết bằng dung môi nhexan. • Đề xuất hệ thống chiết concret bằng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. • Phân lập một số thành phần hóa học có trong concret. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Công nghệ chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn (Supercritical CO2 - SCO2) Năm 1861, Gore lần đầu tiên giới thiệu về khả năng hòa tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO2 lỏng. Vào các năm 1875 - 1876, Andrews, một trong những người đầu tiên nghiên cứu về trạng thái siêu tới hạn của CO2, đó tiến hành đo và cung cấp những giá trị áp suất và nhiệt độ tới hạn của CO2 khá gần với các số liệu hiện đại [45]. Hiện tượng một số muối vô cơ như các muối: KI, KBr có thể hòa tan trong dung môi etanol và tetracloruametan ở trạng thái siêu tới hạn được Hannay và Hogarth công bố lần đầu tiên tại hội nghị khoa học Hội khoa học Hoàng gia London năm 1879 [45, 15]. Buchner (1906) cũng thông báo về khả năng hòa tan của một số hợp chất hữu cơ kém bay hơi trong SCO2 cao hơn nhiều lần so với trong CO2 ở dạng khí [28]. Sau này đã có nhiều tác giả nghiên cứu và công bố về tính chất của dung môi ở trạng thái siêu tới hạn, như là các hydrocacbon phân tử lượng thấp (CH4, C2H6, C3H6), các ôxit Nitơ, CO2,... Các chất tan phổ biến đó được khảo sát bao gồm các chất thơm, tinh dầu, các dẫn xuất halogen, các triglyxerid và một số các hợp chất hữu cơ khác...[45,Error! Reference source not found.,32,28,12] Các nghiên cứu về công nghệ chiết xuất các hợp chất thiên nhiên bằng dung môi siêu tới hạn thực sự đó được bắt đầu từ những năm 1970 và đó mở ra khả năng áp dụng đa dạng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và môi trường.v.v... [12]. Một ví dụ: nhà máy công nghiệp đầu tiên ở châu Âu sử dụng công nghệ chiết xuất bằng SCO2 đó được hãng HAG A.G. xây dựng và đưa vào hoạt động từ năm 1979 để tách caffein ra khỏi nhân cà phê [Error! Reference source not found., 32]. 1.1.1. Vài nét về trạng thái siêu tới hạn Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà tại đó, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại mà tồn tại ở một dạng đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở trạng thái trung gian này, mang đặc tính của cả chất khí và chất lỏng [28]. Chất ở trạng thái siêu tới hạn có tỷ trọng tương đương như tỷ trọng của pha 3 lỏng. Nhưng sự linh động của các phân tử lại rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số khuếch tán cao giống như khi chất ở trạng thái khí. Hình 1.1 biểu thị vùng trạng thái siêu tới hạn của một chất trong biểu đồ cân bằng pha rắn, lỏng và khí của chất đó theo sự biến thiên của áp suất và nhiệt độ [28, 12, 46]. Giá trị PC phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của các chất, ví dụ với các chất có phân tử lượng nhỏ như các hydrocacbon có số cacbon từ 1đến 3 thì giá trị Pc của chúng không cao, mà chỉ xấp xỉ vào khoảng 45 bar [12]. Giá trị TC chỉ tăng ít theo phân tử lượng, nhưng TC lại phụ thuộc nhiều vào độ phân cực của chất. Độ phân cực của phân tử càng lớn thì giá trị TC cũng càng lớn. Điều này được giải thích là do ở các chất phân cực, tồn tại một lực cảm ứng giữa các cực của phân tử, do đó năng lượng để phá vỡ trật tự giữa các phân tử khi chất ở pha lỏng sẽ lớn hơn nhiều so với các chất không phân cực. P Nếu giữa các phân tử có liên kết hydro thì giá trị TC sẽ tăng lên rất Vùng siêu tới hạn Rắn lớn. Ví dụ, H2O là một chất có phân tử lượng thấp nhưng giá trị Tc lại rất PC cao (374,20C), đó là do giữa các phân Lỏng tử H2O xuất hiện liên kết hydro. Các 1 - Điểm ba (PT, TT) thông số vật lý của một số dung môi PT Khí 2 - Điểm tới hạn (PC, TC) ở điểm tới hạn được trình bày trong T bảng 1.1. Hình 1.1 Đồ thị trạng thái của các chất ở vùng siêu tới hạn Bảng 1.1. Điểm tới hạn của một số dung môi [Error! Reference source not found.] Chất Nhiệt độ o tới hạn ( C) Áp suất Tỷ trọng riêng tới hạn (bar) tới hạn (g/cm3) Metan -82, 6 46, 0 0, 162 Etylen 9, 3 50, 3 0, 218 Carbon dioxide 30, 9 73, 8 0, 468 Etan 32, 3 48, 8 0, 203 Propan 96, 7 42, 4 0, 217 Aceton 235, 0 47, 0 0, 278 Metanol 239, 5 80, 9 0, 272 Các dung môi siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả 3 dạng rắn, lỏng và khí. Dung môi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả 4 các cấu tử không bay hơi của mẫu. Hiệu quả phân tách kết hợp của quá trình chưng cất lôi cuốn và quá trình chiết ngược dòng lỏng - rắn [Error! Reference source not found.]. 1.1.2. Lựa chọn dung môi CO2 siêu tới hạn trong chiết tách CO2 và một số dung môi khác ở trạng thái siêu tới hạn có các tính chất hóa lý đặc biệt như [Error! Reference source not found., 45,46] + Sức căng bề mặt thấp; + Độ linh động cao, độ nhớt thấp; + Tỷ trọng xấp xỉ tỷ trọng của chất lỏng; + Có thể điều chỉnh khả năng hòa tan các chất khác bằng cách thay đổi nhiệt độ và áp suất. Để đáp ứng các yêu cầu công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên, SCO2 là dung môi được ưu tiên lựa chọn áp dụng vì các thuận lợi sau [12, 13, 28, 32] - CO2 là một chất dễ kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành công nghệ húa chất khác; - Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết. Khi được đưa lên đến trạng thái tới hạn, CO2 không tự kích nổ, không bắt lửa và không duy trì sự cháy; - CO2 không độc với cơ thể, không ăn mòn thiết bị; - Điểm tới hạn của CO2 (Pc = 73 atm; Tc = 30,9oC) là một điểm có giá trị nhiệt độ, áp suất không cao lắm so với các chất khác cho nên sẽ ít tốn năng lượng hơn để đưa CO2 tới vùng siêu tới hạn; - Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồng thời cũng hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại nặng và có thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt độ để nâng cao độ chọn lọc khi chiết tách; - Khi sử dụng CO2 thương phẩm để chiết tách không có dư lượng cặn độc hại trong chế phẩm chiết. a. Tính tan của các chất trong CO2 siêu tới hạn Có một số quy luật tổng quát về tính tan của các chất trong CO2 lỏng đã được Hyatt đưa ra [13, 45, 46,], và có thể áp dụng cho dung môi SCO2 như sau: 5 1. Các chất có phân tử lượng trên 500 đ.v.c. thì kém tan; 2. Các chất tan rất tốt như: các aldehyd, xeton, este, ancol và các cacbon halogenua có phân tử lượng nhỏ và trung bình; 3. Các hydrocacbon mạch thẳng dưới 20 C, ít phân cực, phân tử lượng thấp và các hydrocacbon thơm phân tử lượng nhỏ tan tốt; 4. Các chất hữu cơ phân cực như các axit cacboxylic nếu phân tử lượng rất nhỏ tan được trong SCO2; 5. Các axit béo và các triglyxerid đều tan kém. Mặc dầu vậy, nếu este hóa các axit béo bằng một rượu đơn chức thì tính tan tăng lên nhiều; 6. Nếu trong phân tử các chất tan có thêm các nhóm phân cực như hidroxyl, carbonyl, hay Nitơ, thì tính tan sẽ bị suy giảm. Nói chung các ancaloid, các hợp chất phenol, aniline, amid, urea, urethan và các phẩm màu azo đều tan kém; 7. Các carotenoid, axit amin, các axit quả, diệp lục và đa phần các muối vô cơ đều không tan. b. Sử dụng dung môi hỗ trợ trong quá trình chiết xuất bằng SCO2 Dung môi hỗ trợ là một lượng nhỏ loại dung môi hữu cơ được đưa thêm vào hòa trộn với SCO2, thường là 1 - 5 % mol, nhằm thay đổi tính chọn lọc của dung môi trong quá trình tách, chẳng hạn như làm thay đổi tính phân cực, hay các tương tác riêng của dung môi đối với các chất tan, mà không làm thay đổi đáng kể tỷ trọng và khả năng chịu nén của dung môi chính [12,13, 46]. Metanol là một ví dụ tốt, khi cho thêm metanol với nồng độ 3,5 % mol trong SCO2 làm tăng độ tan của axit 2amino-benzoic lên đến 620 % [32]. Khi thêm dung môi hỗ trợ (co-solvent) sẽ làm thay đổi các giá trị tới hạn (nhiệt độ, áp suất) của dung môi chính. Thông thường với nồng độ co-solvent nhỏ hơn 5 % mol, sự sai khác này không đáng kể [32]. 1.1.3. Một số ứng dụng của công nghệ chiết xuất các sản phẩm thiên nhiên bằng CO2 siêu tới hạn trên thế giới Trên thế giới đã sử dụng công nghệ chiết xuất bằng SCO2 vào việc loại cafein của chè và cà phê trong quá trình sản xuất các loại đồ uống không cafein [28, 19, 15]. Đối với công nghiệp sản xuất đồ uống không có cồn, SCO2 được dùng để chiết loại cồn ra khỏi chế phẩm thay cho phương pháp cũ là chưng cất. Trong công nghiệp thuốc lá, SCO2 được sử dụng để chiết những thành phần dễ bay hơi và tách 6 phần hương tự nhiên từ cây thuốc lá để nâng cao chất lượng sản phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm ứng dụng công nghệ SCO2 để sản xuất các sản phẩm có hàm lượng chất béo và cholestesrol thấp hoặc các thực phẩm chức năng (giàu axit béo DHA, EPA, FOS .v.v...); SCO2 cũng được dùng để chiết các hợp chất của hoa huplon [Error! Reference source not found., 32, 28] dùng trong công nghệ bia và dược phẩm; chiết các hoạt chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên. Trung Quốc và Ấn Độ đã có nhà máy sản xuất thiết bị cũng như các nhà máy chiết tách một số chế phẩm có nguồn gốc thực vật sử dụng công nghệ chiết bằng CO2 siêu tới hạn. Bảng 1.2 cung cấp một số thông tin về những nước hàng đầu trong ứng dụng công nghệ chiết xuất bằng SCO2 và các sản phẩm từ công nghệ này [3,28]. Bảng 1.2. Các sản phẩm được sản xuất bằng công nghệ SCO2 ở một số nước trên thế giới [3,28] Nước Đức Australia Anh Mỹ Công ty Sản phẩm tự nhiên HAG-General Foods - Cà phê SKW Chemical - Chè, huplon, gia vị Barth - Huplon Carlton & United - Huplon English Hops - Huplon, gia vị General Foods - Cà phê Pfizer - Huplon Phasex - Các sản phẩm khác Theo đánh giá của Vitzthum và các cộng sự thì việc sử dụng SCO2 vào chiết tách các hoạt chất thiên nhiên với sản lượng lớn ở quy mô công nghiệp để ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm... sẽ trở thành phổ biến trong tương lai. a. Chiết xuất hoạt chất từ hoa Huplon Trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ chiết xuất hoạt chất bằng CO2 lỏng từ hoa Huplon được công bố lần đầu tiên vào năm 1950 ở Liên Xô cũ và Nhật Bản. Nhưng chất lượng chế phẩm chiết xuất lúc đó không cao và vẫn còn ở dạng sản phẩm thí nghiệm [28]. Cho tới năm 1981, công nghệ sử dụng SCO2 chiết xuất dịch hoa Huplon mới thành công và bắt đầu được áp dụng ở Đức. Trong những năm 80, sản lượng các chất được chiết bằng SCO2 từ hoa Huplon ở Đức đã tăng nhanh và vượt quá 10.000 tấn/năm. Sau đó tới những năm đầu thập kỉ 90, công nghệ chiết 7 SCO2 mới thực sự lan rộng ra Châu âu và Mỹ [28]. Ưu điểm của chế phẩm Huplon chiết bằng SCO2 so với các phương pháp khác được thể hiện chủ yếu ở sự vắng mặt các thành phần tạp chất như diệp lục, nhựa cứng - sản phẩm từ quá trình oxy hóa khi chưng cất, muối vô cơ và các cặn không tan khác. Thêm vào đó, hàm lượng các thành phần hữu ích cũng cao hơn ở kỹ thuật truyền thống, các so sánh này được cụ thể hóa trong bảng 1.3. Bảng 1.3. So sánh thành phần chế phẩm chiết hoa Huplon bằng SCO2 và bằng các kỹ thuật truyền thống [28] Thành phần Chế phẩm chiết với Chế phẩm chiết Chế phẩm chiết Alpha axit ố 35 - 45% ồ 30 - 40% 40 - 50% Beta axit 15 - 20% 10 - 15% 18 - 40% Nhựa ít biến tính 3 - 8% 3 - 8% 5 - 20% Nhựa cứng 2 - 5% 2 - 10% -- Chất dễ bay hơi 1 - 3% 1 - 2% 2 - 8% Lipit và sáp 1 - 2% vết 0 - 5% vết 1 - 5% -- Clorophyll >1% vết -- Muối vô cơ <1% 0,5 - 1% vết Cặn chất tan <1% 0,01 - 0,1% -- vết 1 - 5% 1 - 5% Tanin Nước b. Chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học, tinh dầu và các chất thơm từ thảo dược bằng công nghệ sử dụng SCO2 Công nghệ SCO2 đang được nghiên cứu áp dụng để chiết các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh và tăng cường sức khoẻ từ thảo mộc [3,6,4,45]. Các hợp chất triterpenoid mà đặc trưng nhất là faradiol có tác dụng chống viêm được chiết từ hoa cây cúc vàng (Calendula officialis). Nếu chiết bằng SCO2, hàm lượng faradiyl este trong sản phẩm chiết cao gấp hàng trăm lần so với hàm lượng trong sản phẩm chiết bằng cồn, cho thấy sự ưu việt của công nghệ SCO2 trong việc chiết tách sản phẩm này [32]. Các hợp chất chống ung thư từ thảo dược rất được quan tâm nghiên cứu trên thế giới và công nghệ chiết bằng SCO2 cũng có nhiều triển vọng áp dụng, chẳng hạn như vinblastin - chất chống ung thư máu từ cây dừa cạn [32]; moncrotaline từ hạt cây lục lạc (crotalaria spectabilis) [32]; maytansine từ cây maytenus senegalenis; taxol - có tác dụng chống các khối u phổi, ung thư vú và buồng trứng [32]. Công 8 nghệ chiết bằng SCO2 có thêm 10 - 20 % dung môi hỗ trợ (co-solvent) là methanol cho hàm lượng hoạt chất 0,27 - 1,82 %, cao hơn hẳn so với chiết bằng cồn (0,125 %). Công nghệ SCO2 được áp dụng rộng rãi để chiết tách nhiều loại tinh dầu. Ngoài những ưu điểm chung, khi áp dụng cho các đối tượng tinh dầu, công nghệ này còn có một số tính ưu việt khác mà các công nghệ kinh điển (chiết dung môi, cất lụi cuốn hơi nước) không có được. Sản phẩm có độ tinh khiết cao và có mùi hương đặc trưng. Công nghệ SCO2 đặc biệt hiệu quả khi áp dụng cho các đối tượng tinh dầu quý và kém bền nhiệt [31, 47, Error! Reference source not found., 3]. Tinh dầu hoa nhài được chiết bằng SCO2 cho năng suất khá cao (0,2 - 0,37 %) [32]. Tinh dầu hoa hồng cất lôi cuốn hơi nước chỉ cho hiệu suất 0,025 %, chủ yếu được sản xuất ở Thổ Nhĩ Kỳ, Bungaria và Ma Rốc. Tinh dầu hoa hồng chiết bằng SCO2 có đầy đủ các đặc trưng của absolute hoa hồng chiết bằng dung môi (hexan/ethanol), nhưng có chất lượng tốt hơn và không chứa dư lượng dung môi [32]. Bảng 1.4 trình bày kết quả so sánh hiệu suất chiết các sản phẩm absolute và concrete từ một số loại nguyên liệu hoa giữa kỹ thuật chiết sử dụng dung môi hữu cơ và kỹ thuật chiết bằng SCO2. Bảng 1.4. Hiệu suất thu Concrete và Absolute từ các loại nguyên liệu hoa với các kỹ thuật chiết bằng dung môi hữu cơ và bằng SCO2 [32, 33] Kỹ thuật chiết bằng dung môi hữu cơ Chiết bằng SCO2 Tên Hoa Concrete (%) Absolute từ concrete (%) Absolute (%) Helichrysum 0,90 - 1,15 60 - 70 4,40 - 6,60 Hoa Dạ hương lan 0,17 - 0,20 10 - 14 - Hoa Nhài 0,28 - 0,34 45 - 53 0,44 - 0,66 HoaTử đinh hương 0,60 - 0,95 35 - 45 - Hoa Cam 0,24 - 0,27 36 - 55 0,28 Hoa Hồng 0,22 - 0,25 50 - 60 - Violet 0,07 - 0,13 35 - 40 - YlangYlang 0,80 - 0,95 75 - 80 - Công nghệ chiết sử dụng SCO2 còn có thể áp dụng đối với hầu hết các loại tinh dầu và chất thơm quý khác từ thảo mộc như tinh dầu hương lau, hoa nhài, hoa cam, lavan (Lavandula stoechas), hoàng đàn, hương lau, hoa bưởi.v.v... [6, 4, 5,44]. 9 1.2. Đối tượng lựa chọn nghiên cứu của đề tài Đề tài nghiên cứu chiết concret từ nguyên liệu là gỗ thân cây Dó Bầu được trồng để khai thác trầm hương tại Việt Nam bằng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. Bên cạnh đó khảo sát và phân lập một số cấu tử của concrete thu được. 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh thái và phân bố của cây Dó Bầu Cây Dó Bầu được xếp loại thực vật thuộc họ Trầm Hương Thymelaeaceae, chi Aquilaria Lamk, loài Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte. Dó Bầu thuộc loại thuộc loại thân gỗ, cao 30-40 m, vỏ xám, có xơ. Lá mọc so le, có phiến mỏng, thuôn hay bầu dục ngọn giáo, nhọn ở gốc, thon hẹp dần ở chóp. Hoa thành chùm hay thành tán, ở nách lá có lông. Quả khô, loại quả nang, hình quả lê, có lông lún phún dài 4 cm, rộng 3 cm, dày 2 cm, ở gốc có bao hoa đồng trưởng có vỏ quả mở làm hai mảnh van, xốp. Hạt thường chỉ có gồm một phần chính ở trên dạng nón và một phần kéo dài ở dưới cũng bằng phần trên, vỏ ngoài cứng và hóa gỗ, bên trong mềm. Cây thường ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 6 [8,9]. Cây Dó Bầu thích hợp phát triển ở những vùng có độ cao 1000m, thường tập trung ở độ cao 300-700m, độ dốc trên 25%. Nhiệt độ thích hợp không dưới 150C và nhiệt độ tối đa không vượt quá 350C, nhiệt độ phù hợp thường là 22-290C. Lượng mưa cả năm ở các vùng có Trầm từ 1200mm trở lên, mùa khô từ 3 đến 5 tháng. Cây Dó bầu thường mọc trên nhiều loại đất núi, đất đỏ, đất xám, đất đỏ vàng, đất feralit trên đá macma trung tính, đất feralit trên đá kết tinh chua, trên đá biến chất dạng phiến và cả trên đất đỏ bazan. Cây ưa đất thịt pha cát, có tầng sâu, dầy và nhiều mùn[9]. Sự phân bố của cây Dó ở nước ta, thường tìm thấy ở những vùng núi hướng về phía có gió biển, nên thường gặp ở vùng phía Đông Trường Sơn hơn là Tây Trường Sơn. Hiện nay ở nước ta, cây Dó bầu được trồng tập trung nhiều nhất ở một số tỉnh như:Quảng Nam, Bình Phước, Bình Dương, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, An Giang, Đắc Lắc, Gia Lai, Quảng Trị…với khoảng 15000 -18000 hécta. Nơi có diện tích trồng Dó bầu nhiều nhất là Hà Tĩnh khoảng 3000 ha, tiếp đến là Bình Phước khoảng 1000 ha. Trong đó cây Dó bầu chuẩn bị khai thác (4 năm tạo trầm) có trên 400 hécta. Theo Hội trầm hương Việt Nam, mỗi năm diện tích cây Dó bầu cả nước tăng trên 2.500 hécta, ước tính đến 2010, diện tích Dó bầu của cả nước sẽ lên đến 30.000 hecta [Error! Reference source not found.]. 1.2.2. Sự tạo thành Trầm hương trên cây Dó 10 Ba giả thuyết hiện nay có liên qua đến việc hình thành Trầm hương : là kết quả của những quá trình bệnh học, gây thương tích và phi bệnh học[Error! Reference source not found.,43]. Nhưng các giả thuyết này đều chưa đủ cơ sở để kết luận giả thuyết nào là đúng hoàn toàn [Error! Reference source not found.]. Heuveling van Beek[9,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.] cho là quá trình đối ứng lại vết thương. Theo Oldfield[Error! Reference source not found.] cây Dó hình thành nhựa do đối ứng lại sự lây lan của nấm, và giả thuyết sự lây lan nấm làm tăng việc tạo nhựa như là một phản ứng của vật chủ chống lại việc phát triển của nấm. Cây Aquilaria bị lây lan tự nhiên bởi nhiều loại nấm như Aspergillus spp, Botrydyplodia spp, Dilodia spp, Furarium bulbiferum, Flaterium, F.oxysporum, F.solani, Penicillium spp và Pythium spp. Các nghiên cứu của S.R.Bose cho rằng Trầm hương là những phần gỗ bệnh lý, xuất hiện ở Aquilaria agallocha dưới tác động của tác nhân gây bệnh là một số loại nấm ở nhóm bất toàn [9]. Julaluddin [9] cho rằng vùng gỗ Trầm có chứa một loại nấm Cryptosphacria mangifera ở cây Dó nhiễm bệnh và sau một thời gian vùng bị nhiễm sậm màu đi, tạo thành trầm rõ rệt vì khi đốt tỏa ra mùi trầm. Những nhân tố khác như tuổi cây, khác do biến đổi theo mùa, biến đổi môi trường và biến đổi di truyền của Aquilaria spp có thể giữ vai trò quan trọng trong hình thành Trầm hương. Không phải là tất cả cây Aquilaria tạo ra trầm hương, Gibson[Error! Reference source not found.] báo cáo rằng ước chừng chỉ 10% Aquilaria spp. và một số thống kê khác cũng nhận định chỉ 1/10 cây trưởng thành trên 20 cm đường kính ở bề cao ngang ngực có thể tạo ra trầm hương. Một số báo cáo bởi Dự án Mưa Rừng [Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.] ở Việt Nam cho biết sự hình thành trầm hương có thể xuất hiện trên những cây Dó trẻ ba năm tuổi. Cho đến nay nguồn gốc của quá trình tạo trầm vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn [9,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.]. Quá trình gây trầm nhân tạo trên cây Dó trồng đã có thành công bước đầu trên cả hai phương diện nghiên cứu và thực tiễn. Những cây Dó đủ điều kiện để tạo trầm thường có thời gian sinh trưởng 5 năm tuổi trở lên, đường kính thân cây từ 1518cm[9,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.]. Các phương pháp tạo trầm đang được áp dụng hiện nay là : - Phương pháp gây tổn thương: đục khoét hoặc đóng sắt vào thân cây. Cách này dễ làm, ít tốn kém, nhưng lâu cho trầm và chất lượng thấp. 11 - Phương pháp sinh học: Tạo men vi sinh rồi cấy vào thân cây. Cách này khó làm, ít người biết, giá thành cao, nhưng an toàn về mặt sử dụng sản phẩm. - Phương pháp hoá chất: Tạo hỗn hợp hóa chất rồi cấy vào thân cây. Cách này phức tạp, nhanh cho trầm, nhưng có thể lưu lại một phần hoá chất có hại. - Một số cách tạo trầm khác như kết hợp một số phương pháp trên với nhau đã được trình bày trong bản phát minh sáng chế tạo trầm của các tác giả: Balnchette, Robert A, Van Beek, Henry Heuveling trong dự án Mưa rừng ở Việt Nam [Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.]. 1.2.3. Giá trị kinh tế và tình hình phát triển cuả cây Dó trên thế giới và trong nước Trầm hương trên thị trường thế giới thời kỳ 1995-1997 khoảng 1350 tấn (số liệu của Đài Loan trong khoảng thời gian này hơn 2050 tấn). Theo thống kê của TRP (tổ chức mưa rừng nhiệt đới), khoảng 5 năm gần đây khu vực Đạo giáo và Hồi giáo sử dụng hơn 2500 tấn trầm các loại. Trầm hương mua bán trên thị trường hầu hết là khai thác từ thiên nhiên. Các nước có nguồn Trầm hương cung cấp cho thế giới tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á và vài nước Nam Á như Ấn Độ, Bangladesh, Bhutan. Tuy nhiên, nạn khai thác trầm hương vào những thập niên cuối của thế kỷ 20 có tính chất hủy diệt cây Dó, làm cho nguồn cung cấp trầm hương trên thị trường ngày càng cạn kiệt. Chẳng hạn, năm 1993, Indonesia khai thác và xuất khẩu hơn 661 tấn thì năm 1997 chỉ còn 302 tấn; tương tự như Indonesia, Malaysia từ 43,6 tấn còn 21,6 tấn; Campuchia năm 1995 khai thác và xuất khẩu 133,8 tấn thì 3 năm sau chỉ còn 13,2 tấn; Ấn Độ năm 1995 xuất khẩu 15,1 tấn thì năm 1997 chỉ còn 1,4 tấn. Ở Việt Nam, theo thống kê của ngành thương mại từ năm 1986-1990, khai thác và sản xuất khoảng 1163,9 tấn Trầm hương. Nhưng cũng giống như các nước là số lượng ngày càng giảm sút. Chẳng hạn năm 1985 khai thác và xuất khẩu 216,1 tấn thì năm 1990 chỉ còn 73,4 tấn. 1kg Kỳ nam, thập niên 80 giá 1.500-5.000USD, nay tăng lên 15.000-50.000USD (theo loại). Trầm hương loại 1 từ 800-1.200USD lên 7.000-8.000USD/1kg, các loại khác cũng có mức tăng từ 10 đến 15 lần [Error! Reference source not found.]. Trầm hương được mua bán dưới nhiều hình thức khác nhau, phần nhiều xuất khẩu dạng mảnh, miếng chiếm 95%, dạng gỗ chiếm 3%, dạng bột chiếm hơn 1% và tinh dầu dưới 1%[Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.]. 12 Thị trường mua bán Trầm hương và các sản phẩm Trầm hương chủ yếu là Đài Loan, Thái Lan, Hồng Kông, Singapore (70% tái xuất); thị trường tiêu thụ trực tiếp là các nước Ả Rập, Nhật Bản (loại trầm hương tốt), khu vực Hồi giáo. Trong nước hiện nay, Trầm hương là mặt hàng kinh tế cao nhưng do trầm trong tự nhiên ngày càng cạn kiệt vì vậy việc gây giống trồng cây Dó, tạo trầm hương, chế biến, xuất khẩu đem lại nhiều lợi ích kinh tế ở Việt Nam. Ngoài ra, trồng cây Dó có thể đem lại các sản phẩm khác như gỗ làm đồ gia dụng, làm bột giấy, bột nhang, lá làm dược liệu, vỏ làm sợi [9,Error! Reference source not found.]. Có thể khẳng định con người đã tạo được trầm hương trên cây Dó là rõ ràng (sau 2 năm tạo có thể thu được trầm hương loại 5, loại 6 từ 1kg đến vài kg/cây). Tuy nhiên, hiện nay những tổ chức và cá nhân nắm được kỹ thuật tạo trầm chưa nhiều, thường giữ bí mật, coi đó là bí quyết riêng [Error! Reference source not found.]. Đến năm 2010, nhu cầu về trầm hương sẽ vượt quá cầu, ở Việt Nam, các vùng cây Dó ngày càng phát triển nhưng vẫn còn tự phát, 95% trầm trên thị trường hiện nay là trầm hương nhân tạo, giải pháp của Chính Phủ là cần phải tạo được một hành lang pháp lý cho cây Dó phát triển [Error! Reference source not found.]. 1.2.4. Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Aquilaria a. Các sesquiterpene Phần Trầm trên cây Dó mang lại giá trị kinh tế cao do có chứa nhựa thơm, các thành phần mang mùi là các sesquiterpen. Nhóm sesquiterpen chủ yếu gồm: Sesquitepene khung Vetispiran [51,27,55] 1 O 2 5 3 OH 14 CHO 10 9 4 8 6 7 15 11 12 13 Agarospirol 7 6 8 1(10)-spirovetiven-11-ol-2-one CHO 4 4 3 1 8 11 1 3 10 2 13 O 10 2 9 13 OH oxo-agarospirol 7 5 6 5 9 OH O Nhóm Vetispiran được tác giả Varma K.R, Nakanishi T, Näf R.[36, 65] tách ra từ phần concret n-hexan và benzen của cây A. agallocha Roxb. có nguồn gốc từ Việt Nam và Ấn Độ, cũng được tìm thấy tại cây A. malaccensis Benth. ở Indonesia [40,41]. Agrospirol đã được công bố là có tác dụng lên thần kinh chuột và ảnh hưởng như một loại thuốc an thần, gây ngủ [55]. Sesquitepene khung Guaiane [22,25,24,23] OHC Guaia-1(10),11-diene HO HOH2C Guaia-1(10),11-dien-2,15-diol Guaia-1(10),11-dien-15-al O O O O H H Guaia-1(10),11-dien-9-one Guaia-1(10),11-dien-2,15-olide 1,10-Epoxyguai-11-ene Được công bố bởi các tác giả Ishihara M., Tsuneya T.[22] khi khảo sát các hợp chất thơm có trong mẫu trầm hương Việt Nam A. agallocha Roxb. Loại thương phẩm được mang tên Kanankoh trên thị trường Nhật bản. Đã có 9 sesquiterpene khung guaiane được phân tách bằng sắc ký cột, sắc ký khí điều chế và giải thích cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS, IR và NMR. Sesquitepen khung Agarofuran [35,34,40,41] O O 14 α-agarofuran β-agarofuran O O epoxy-β-agarofuran Xuất hiện trong A. agallocha Roxb. của Ấn độ khi tinh dầu thương phẩm được tinh chế lại bằng chưng cất cuốn hơi nước dưới áp suất giảm và chiết bằng SCO2, các tác giả Näf R., Velluz A. và cộng sự [35,34,36] đã phân tách được 4 agarofuran. Trong đó xác định được cấu trúc của dạng α và β-agarofuran ngoài ra còn có epoxy và 2-oxo agarofuran. Khi so sánh thành phần các chất thơm trong concrete chiết bằng benzen sử dụng phương pháp GC/MS và GLC của hai loài A. agallocha Roxb. của Việt Nam và A. malaccensis Benth. ở Indonesia nhập khẩu qua Singapore [40,59,41], các tác giả Nakanishi T. và Yoneda K. đã nhận thấy sự khác nhau là loài trầm của Việt nam có chứa α -agarofuran nhưng không chứa βagarofuran và ngược lại. Một số sesquiterpen khung khác H H OH CH2OH Prezizaene Jinkohol II Jinkohol O OH H CHO H Selina-3,11-dien-9-one Selina-3,11-dien-14-al 10-epi-gama-eudesmol O OH OH Jinkoh-eremol Valenca-1(10),8-dien-11-ol Karanone Các Jinkohol và II được Nakanishi T. và Yoneda K.[59] cùng cộng sự tách ra bằng sắc ký cột sau đó xác định bằng NMR từ loài Aquilaria sp. Của Indonesia. Trong khi đó loài A. agallocha Roxb. của Việt Nam không thấy có [40,41]. Karanone và dihydrokaranone được tìm thấy trong A. sinesis mọc ở Campuchia và 15 Trung Quốc [18]. Khung selinane được Ishihara M.[24,23,25] tìm thấy cùng với khung guaiane ở A. agallocha Roxb. của Việt Nam và Gunasekera [Error! Reference source not found.] tìm thấy ở A. malaccensis mọc ở Thái Lan. b. Các chromon O O O R1 O O O R2 Flindersiachromone: Oxidoagarochromone A Yagura T., ShimadaR1=R2=H Y.[53,54], Konoshima T., Konishi T.[29], Nakanishi T. và Inada A.[42] đều nhận định đã tách được các dẫn xuất của 2-(2-Phenylethyl) chromone từ hạng trầm tốt nhất Kanankoh[42] Trong đó đặc biệt có các dẫn xuất dạng diepoxy tetrahydrochromon như oxidoagarochromon A, B,C được tìm thấy A.crassna Pierre ex Lecomte thu từ Việt Nam và được cho là yếu tố xác định của các cây Dó tạo trầm bằng phương pháp kích cảm nhân tạo [55] c. Các thành phần hóa học khác Theo nhận định của Hsu, benzylaceton, p-methoxybenzylaceton, axit hydrocinnamic, p-methoxylhydrocinnamic, agarospirol, agarofuran có trong phần tinh dầu của loài Dó không kích cảm nhân tạo. Từ dịch chiết CHCl3 của loài A. agallocha Roxb.mọc tại Ấn độ, Bhandari P., Pant P.[18,11] đã tách được aquillochin và một số dẫn xuất của nó. COOH COOH MeO O MeO p-Methoxyhydrocinnamic O O O Axit hydrocinnamic OH Me Me O O MeO p-Methoxybenzylacetone MeO OMe OH benzylacetone Aquillochin Nghiên cứu về sự tạo thành tinh dầu trong cây dó A. agallocha Roxb. mọc tại Ấn độ, các tác giả Tamuli, Phatik (2005) và cộng sự đã nêu ra một số sự khác nhau trong thành phần tinh dầu của cây Dó nhiễm bệnh tự nhiên, cây Dó không nhiễm 16