Tài liệu Nghiên cứu cố định vi khuẩn lactobacillus reuteri sử dụng làm chế phẩm sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HẠNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI SỬ DỤNG LÀM CHẾ PHẨM SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : : : : Chính quy Công nghệ sinh học CNSH - CNTP 2012 – 2016 THÁI NGUYÊN – 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HẠNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI SỬ DỤNG LÀM CHẾ PHẨM SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giáo viên hƣớng dẫn : ThS. Bùi Tuấn Hà THÁI NGUYÊN – 2016 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của mọi người. Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, cùng toàn thể các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Tuấn Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lời cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Qua đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, người thân luôn quan tâm, động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016. Nguyễn Thị Hạnh ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1: Những điểm tương đồng về mặt hình thái của L.reuteri và Lactobacillus 4 Bảng 2.2: Những khác biệt về hình thái của L.reuteri so với Bacillus .................... 4 Bảng 2.3 :Tỷ lệ rửa trôi sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) ...... 12 Bảng 2.4: So sánh chất mang alginate và chất mang BC trong cố định tế bào nấm men: ........................................................................................................ 15 Bảng 3.1: Thành phần môi trường MRS .................................................................. 24 Bảng 3.2: Các thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong thí nghiệm: ...................... 25 Bảng 4.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào vi khuẩn bằng chất mang algiante .......................................................................................... 38 Bảng 4.2: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 40oC........... 41 Bảng 4.3: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 45oC........... 42 Bảng 4.4: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 50oC........... 43 Bảng 4.5: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 1. .................................... 44 Bảng 4.6: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 2 ..................................... 45 Bảng 4.7: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 3. .................................... 46 Bảng 4.8: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với muối ăn nồng độ 3%. .............. 48 Bảng 4.9: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với muối ăn nồng độ 5%. .............. 49 Bảng 4.10: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với nồng độ NaCl 7%.................. 50 Bảng 4.11: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 5%. ............................. 51 Bảng 4.12: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 8%. ............................. 52 Bảng 4.13: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 10%. ........................... 53 iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Trang Hình 2.1: Lactobacillus reuteri dưới kính hiển vi .......................................................3 Hình 2.2: Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào.[23]................................................8 Hình 2.3: Sơ đồ công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics ....................................... 16 Hình 3.1: Sơ đồ pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân. ....................................... 27 Hình 3.2: Sơ đồ pha loãng mẫu cấy lên môi trường đĩa thạch. ................................ 27 Hình 4.1: Khuẩn lạc sau khi được cố định trên các chất mang ở điều kiện 40oC. ... 40 Hình 4.2: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 40oC. ................................................................................. 41 Hình 4.3: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 45oC. ................................................................................. 42 Hình 4.4: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 50oC .................................................................................. 43 Hình 4.5: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 1. ............................................................................................ 44 Hình 4.6: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 2. ............................................................................................ 45 Hình 4.7: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 3 ............................................................................................. 46 Hình 4.8: Khuẩn lạc sau khi được cố định trên các chất mang với NaCl 3%.......... 47 Hình 4.9: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 3% .......................................................................................... 48 Hình 4.10: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 5% .......................................................................................... 49 Hình 4.11: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 7%. ......................................................................................... 50 Hình 4.12: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 5% ........................................................................................ 51 Hình 4.13: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 8% ........................................................................................ 52 Hình 4.14: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 10% ...................................................................................... 53 iv DANH MỤC CÁC CỤM, TỪ VIẾT TẮT BC: Bacterial cellulose WHO: World Health Organization FAO: Food and Agriculture Organization ATSH : An toàn sinh học TB: Tế bào ĐC: Đối chứng v MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ..................................................... Error! Bookmark not defined. LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .............................................................................. ii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ................... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC CỤM, TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................................v Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích của đề tài ..............................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa của đề tài. ................................................................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3 2.1. Cơ sở khoa học .....................................................................................................3 2.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri .....................................3 2.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri .....................................3 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri ............................................4 2.1.4. Chức năng của probiotic ...................................................................................6 2.2. Các phương pháp cố định vi khuẩn. .....................................................................8 2.2.1. Khái quát chất mang..........................................................................................8 2.2.2. Chất mang Alginate.........................................................................................10 2.2.3. Bacterial cellulose (BC) ..................................................................................12 2.3. Chế phẩm sinh học probiotics ............................................................................16 2.3.1. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic .........................................................16 2.3.2. Ứng dụng của chế phẩm sinh học trong đời sống ...........................................17 2.4. Tình hình nghiên cứu .........................................................................................20 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................21 2.4.2. Tình hình nghiên cứu thế giới .........................................................................21 vi Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......24 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................24 3.1.1. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................24 3.1.2. Thiết bị và dụng cụ, hóa chất. .........................................................................25 3.2. Địa điểm và thời gian ngiên cứu ........................................................................25 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................25 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................26 3.4.1. Phương pháp chuẩn bị dụng cụ, hóa chất. ......................................................26 3.4.2. Phương pháp đổ đĩa thạch ...............................................................................26 3.4.3. Xác định số lượng vi khuẩn L. reuteri theo phương pháp đếm khuẩn lạc. .....27 3.4.4. Phương pháp thí nghiệm. ................................................................................28 3.4.5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................29 3.4.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L. reuteri cố định trên chất mang Natri - alginate ở các điều kiện khác nhau. ...........................30 3.4.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L. reuteri cố định trên chất mang Bacterial Cellulose ở các điều kiện khác nhau ......................33 3.4.8.Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L. reuteri ở môi trường tế bào tự do. ........................................................................................36 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................37 4.1. Kết quả thí nghiệm .............................................................................................37 4.1.1. Cố định vi khuẩn L. reuteri lên trên chất mang Natri - alginate .....................37 4.1.2. Cố định vi khuẩn L. reuteri lên trên chất mang Bacterial Cellulose ...............38 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L. reuteri cố định trên các loại chất mang ở các điều kiện khác nhau. ..............................................39 4.2.1. Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện nhiệt độ cao......................................40 4.2.2.Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện pH thấp. ...........................................44 vii 4.2.3. Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện nồng độ muối ăn cao. ......................47 4.2.4. Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện độ ẩm thấp. ......................................51 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................54 5.1. Kết luận ..............................................................................................................54 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cơ thể người và động vật, đặc biệt là đường tiêu hóa, chứa một hệ thống phức tạp và đa dạng các chủng vi khuẩn. Chúng ta có xu hướng nghĩ rằng các vi khuẩn đều có hại như "vi trùng", nhưng thực ra nhiều vi khuẩn có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ các chức năng của cơ thể.Vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng phổ biến làm probiotic cho người và động vật. Cách đây hơn 100 năm, con người đã sử dụng các vi khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng vị ngon, tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm. Hương vị của sản phẩm là do các sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus, chẳng hạn Yogurt là sản phẩm được bán rất phổ biến ở Mỹ, Yogurt được làm từ sữa bò, dê, cừu,…[32] kết hợp với các loại Streptococcus thermophiles và Lactobacillus acidophilus hoặc lactobacillus bulgaricus; diacety có trong các sản phẩm sữa lên men; trong các sản phẩm sữa lên men bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người không có khả năng hấp thu sữa có khả năng hấp thu tốt hơn. Ngoài ra, còn nhiều sản phẩm khác mang tính chất truyền thống như dưa muối, cà muối,…[22] Tuy nhiên một trở ngại lớn đối với tác dụng có lợi của vi khuẩn là khả năng sống sót trong hệ tiêu hóa của đối tượng sử dụng. Ví dụ, độ pH của dạ dày là rất thấp, chỉ khoảng 2-4, điều này quan trọng cho quá trình tiêu hoá và tiêu diệt các vi khuẩn có hại, độ pH tăng dần từ dạ dày đến ruột già; có nhiều loại hợp chất và kháng khuẩn tác động không tốt tới các loại vi khuẩn như muối mật, acid dạ dày; chúng có thể bị hủy diệt làm giảm số lượng lớn khi phải đi qua một đoạn đường ở ống tiêu hóa dài.[4] Có nhiều giải pháp để khác phục vấn đề trên như việc chọn giống vi khuẩn, chuyển vi khuẩn về dạng bào tử và trong đó việc cố định tế bào vi khuẩn lên chất mang là một phương pháp được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tiễn. Chẳng hạn cố định lên Natri alginate, Bacterial Cellulose, agar,…là những loại chất mang rẻ tiền và dễ tìm nên được sử dụng nhiều trong nghiên cứu cố định vi sinh vật. 2 Vì vậy em tiến hành nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri sử dụng làm chế phẩm sinh học nhằm xác định phương pháp cố định phù hợp cho vi khuẩn Lactobacillus reuteri và đánh giá hiệu quả của phương pháp cố định tới khả năng chống chịu của vi khuẩn. 1.2. Mục đích của đề tài - Tìm ra được hướng bảo quản tốt nhất chủng Lactobacillus reuteri mà vẫn đảm bảo yêu cầu về kinh tế. - Tìm ra được chất mang phù hợp nhất cố định cho vi khuẩn Lactobacillus reuteri. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Nghiên cứu được cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên Bacterial Cellulose. - Nghiên cứu được cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên Natri alginate. - Đánh giá được khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang chất mang ở các điều kiện khác nhau. 1.4. Ý nghĩa của đề tài. 1.4.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học - Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được loại chất mang và điều kiện mà vi khuẩn lactobacillus reuteri có thể chống chịu được. - Đề tài là tài liệu tham khảo các sinh viên, các nhà nghiên cứu khi tìm hiểu về các việc cố định vi khuẩn lactobacillus reuteri. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn đời sống Áp dụng để bảo quản tốt chủng vi khuẩn lactobacillus reuteri. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cơ sở khoa học 2.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri là một vi khuẩn gram dương, sống tự nhiên trong đường tiêu hóa của động vật có vú và chim. Vào đầu thế kỷ 20, các loài Lactobacillus reuteri đã được công nhận và được ghi trong phân loại khoa học của vi khuẩn axit lactic, nó đã bị nhầm như một thành viên của Lactobacillus fermentum. Năm 1960, vi sinh vật học người Đức Gerhard Reuter có đã phân biệt được L. reuteri từ Lactobacillus fermentum. L. reuteri cuối cùng đã được xác định là một loài riêng biệt vào năm 1980 bởi Kandler et al. Họ đã chọn tên loài là "reuteri" sau phát hiện của Gerhard Reuter, và L. reuteri có kể từ khi được công nhận là một loài riêng biệt trong chi Lactobacillus.[42] * Đặc điểm phân loại Vi khuẩn L. reuteri có đặc điểm phân loại như sau: Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus reuteri * Đặc điểm phân bố: vi khuẩn L.reuteri có mặt trong các sản phẩm đồ hộp, chúng phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên. 2.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri Hình 2.1: Lactobacillus reuteri dưới kính hiển vi 4 Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L.reuteri có những điểm tương đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus. Bảng 2.1: Những điểm tương đồng về mặt hình thái của L.reuteri và Lactobacillus Điểm tƣơng đồng Hình dạng khuẩn lạc Chi tiết Đường kính khuẩn lạc: 2,5cm. Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, lấp lánh, không tạo sắc tố. Hình que thon, dài. Hình dạng tế bào Kích thước: 0,3 - 0,8m x 3,0 - 5,0m. Tròn ở tận cùng đầu. (Nguồn: Trần Hạnh Triết, 2005)[14] Bảng 2.2: Những khác biệt về hình thái của L.reuteri so với Bacillus Điểm khác biệt Hình dạng khuẩn lạc Chi tiết Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhẵn, L.reuteri có bề mặt trơn. Bacillus luôn có dạng hình que thẳng trong khi Hình dạng tế bào L.reuteri còn có dạng hình que uốn cong. Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của L.reuteri có ở một đầu tế bào. (Nguồn: Trần Hạnh Triết, 2005)[14] 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Môi trường nuôi cấy: khó nuôi cấy, cần những hợp chất phức tạp để phát triển như: pepton, cao thịt, cao nấm men. Môi trường nuôi cấy thích hợp: MRS. - Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là khoảng 37 – 42oC. - pH tăng trưởng tối ưu là khoảng 6,5. L. reuteri không đòi hỏi điều kiện yếm khí cho sự tăng trưởng, bình thường sống trong bầu khí quyển oxy hạn chế. Chủng L. reuteri dựa vào sự sẵn có của các loại đường dễ dàng lên men, acid amin, vitamin và các nucleotide, L. reuteri có thể sử dụng một số chất nhận electron bên ngoài (fructose, glycerol, nitrat, pyruvate, 5 citrate và oxy) để đạt được năng lượng bổ sung và tăng tốc độ tăng trưởng hơn nữa. (Gerez et al, 2008)[21] * Các yếu tố ảnh hưởng đến vi khuẩn L. reuteri. 2.1.3.1. Ảnh hưởng của pH pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường, thang pH thay đổi từ 0 – 14, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. vi sinh vật ưa acid có pH phát triển tốt nhất khoảng 0 – 5.5, vi sinh vật ưa trung tính từ 5.5 – 8, vi sinh vật ưa kiềm từ 8.5 – 11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh trưởng tối ưu ở pH 10 và lớn hơn. Mặc dù, mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của chúng có giới hạn nhất định. Khi pH của tế bào có sự biến đổi đột ngột sẽ phá vỡ màng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng.(Phạm Thị Thúy Nga, 2009)[10] Hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, đặc biệt là hệ enzyme của chúng, chịu tác động mạnh của sử thay đổi pH môi trường. Vi khuẩn lactobacillus sinh tưởng tối ưu ở khoảng pH 5.6 – 6.5, sự sinh trưởng và phát triển sẽ bị kiềm hãm nếu pH môi trường thấp hơn 4 hoặc cao khoảng tối ưu. 2.1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình sống của mỗi tế bào. Mỗi loài vi sinh vật sống trong khoảng nhiệt độ khác nhau gọi là vùng sinh trưởng, trong đó có một khoảng nhiệt độ tối thích. Ví dụ như một số chủng có thể sinh trưởng được ở 55oC, trong khi có một số khác có thể sinh trưởng ở 5oC. Tuy nhiên, đa số vi khuẩn lactobacillus sinh trưởng ở 15-40oC.(Trần Hạnh Triết, 2005)[14] 2.1.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng sinh chất của vi khuẩn, với nồng độ NaCl lớn hơn hoặc bằng 5% sự sinh trưởng của phần lớn các vi khuẩn bị ức chế. Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi khuẩn, vi khuẩn gram âm dễ mẫn cảm với NaCl hơn vi khuẩn gram dương, nguyên nhân là do các enzyme của vi khuẩn bị ức chế bởi ion Cl.(Phạm Thị Thúy Nga, 2009)[10] 6 2.1.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose. Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn sinh tổng hợp, nồng độ đường càng cao thì axit sinh ra càng nhiều. Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn. 2.1.4. Chức năng của probiotic Probiotics là các vi khuẩn sống được coi là có lợi cho sức khỏe vì chúng giúp thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa. Probiotics còn tham gia hình thành các vitamin B, K, đồng thời tăng cường tạo các kháng thể giúp nâng cao khả năng miễn dịch... Các nhà nghiên cứu tại Viện Bách khoa Virginia và Đại học bang Ohio cũng đã xem xét và kết luận probiotics có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em, đồng thời giúp ích cho quá trình tiêu hóa...(Glenn R et al, 2007)[22] * Tác động kháng khuẩn Giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là: Tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và chất diệt khuẩn. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.(Lương Đức Phẩm, 2008)[4] Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh. * Tác động trên mô biểu bì ruột - Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô. - Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn. 7 - Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy. * Tác động miễn dịch. (Lương Đức Phẩm, 2011)[3] Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Cụ thể: - Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm. - Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng. - Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón. * Tác động đến vi khuẩn đường ruột Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Sự sống sót của probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này thì đúng cho tất cả các loại probiotic. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại. (Tamime A,2005)[34] * Một số vai trò khác đối với cơ thể - Chống ung thư: nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. - Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như (folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12).(Glenn R et al, 2007)[22] - Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra còn giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh. - Lên men (levure). 8 2.2. Các phƣơng pháp cố định vi khuẩn. 2.2.1. Khái quát chất mang. 2.2.1.1.Định nghĩa cố định Theo định nghĩa của hội Công nghệ enzyme, cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị trong một khu vực không gian nhất định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tác sinh học của chúng và có thể sử dụng lại nhiều lần. Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn các tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước. Tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn.(Nguyễn Thuý Hương, 2008)[7] * Phương pháp cố định tế bào: Có nhiều cách để phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên các phương pháp cố định vi sinh vật có thể tóm tắt như sơ đồ sau đây. Cố định tế bào vi sinh vật Trên bề mặt chất Liên kết Hấp phụ Trong lòng chất mang Nhốt trong cấu trúc hệ sợi Nhốt trong cấu trúc gel Không mang chất mang Liên kết chéo Màng Membrance Hình 2.2: Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào.[23] 9 2.2.1.2. Yêu cầu của chất mang Theo Trevan một chất mang lí tưởng cần có những tính chất sau: (Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, 2005)[13] - Giá thành rẻ là yêu cầu đầu tiên của một chất mang được sử dụng trong cố định vi khuẩn. - Phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định thì mới chịu đựng được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong trong các quy trình sản xuất. - Về mặt hóa học chất mạng phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng, chất mang không được làm mất hoạt tính của vi khuẩn cố định và không gây ra những hấp phụ không đặc hiệu. - Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật. - Chất mang phải có độ trương nở tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi khuẩn, vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với vi khuẩn, nhờ đó làm tăng hoạt tính của vi khuẩn cố định và số lần tái sử dụng. - Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phiến mỏng,…. * Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào: - Khả năng sống của tế bào trong chất mang: lượng tế bào còn sống sót và hoạt động sau một thời gian nhất định; khả năng chuyển hóa cơ chất và thành phần dinh dưỡng đi vào; sản phẩm trao đổi chất đi ra. - Độ bền cơ học của chất mang: sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật. - Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang, tính đến yếu tố bất lợi với điều kiện ngoại cảnh. Khả năng tái sử dụng nhiều lần, quá trình sản xuất liên tục vi sinh vật không bị rửa trôi.(Nguyễn Đức Lượng và cs, 2006)[6] 10 2.2.1.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật * Chất mang vô cơ: Thông dụng là vật liệu thủy tinh xốp, vật liệu oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomite (celit) và gốm. Đặc điểm: cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được. Có khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào. * Chất mang hữu cơ: - Polymer tổng hợp: gồm một số polymer như polystyren, polyvinylalcol, polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic... dùng cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang. - Polymer sinh học: chất mang protein: gellatin, keratin, albumin. Cố định tế bào bằng phương pháp nhốt trong cấu trúc gel. - Chất mang polysaccharid: cellulose, agarose, sephadex, và dẫn xuất. Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate, carrageenan 2.2.2. Chất mang Alginate 2.2.2.1. Định nghĩa về alginate Alginate là thuật ngữ dùng cho các muối acid alginic. Alginate đôi khi được gọi bằng thuật ngữ “algin”. Alginate là một polymer sinh học có nguồn gốc từ tảo biển, có nhiều trong vách tế bào tảo nâu (Paccophyceae) dưới dạng muối canxi, magie, natri của acid alginic. Và là loại polymer sinh học nhiều thứ 2 trên thế giới sau cellulose.[43] 2.2.2.2. Cấu tạo của alginate Công thức của acid alginic là (C6H8O6)n từ đó công thức của natri alginate là (C6H7NaO6)n, canxi alginate là (C6H7Ca1/2O6)n. Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là acid -D-Mannuronic (M) và acid -L-Gluconic (G) với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside, chỉ khác ở nhóm cacboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza. Chúng tham gia vào cấu thành và màng tế bào, chúng thường tồn tại ở dạng: G-G-G-G…, M-M-MM-…, M-G-M-G-…. Sự phân bố của thành phần M,G biến đổi nhiều theo loài, do đó có nhiều loại Alginate và có tính chất khác nhau. (Th.S Bùi Văn Tú, 2004)[12] 11 2.2.2.3. Phân loại - Alginate Natri: (C6H7NaO6)n - Alginate Kali: (tương tự như Alginate Natri) - Alginate Canxi: (C6H7Ca1/2O6)n - Alginate Magie: (C6H7O4COO)2Ca)n - Alginate Amoni: (C6H11NO6)n 2.2.2.4. Tính chất của Alginate - Khi tan trong nước Alginate tạo dung dịch nhớt, các muối alginate (Na, K, Mg) đều hào tan trong nước, tạo cho dung dịch có độ nhớt cao. Độ nhớt alginate của rong thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, vào giai đoạn sinh trưởng của rong và kĩ thuật tách chiết alginate. Độ nhớt của alginate tăng khi mức độ polymer hóa tăng, nồng độ alginate tăng và nhiệt độ giảm; bên cạnh đó, độ nhớt của alginate lại phụ thuộc rất lớn vào phương pháp tách chiết. Để tăng độ nhớt, trong quá trình tách chiết alginate ta có thể bổ sung một số phụ gia cần thiết để thu được sản phẩm có độ nhớt mong muốn. Ngoài ra, độ nhớt alginate phụ thuộc vào quá trình bảo quản. Khi đang ở dạng bột thành phẩm, alginate vẫn tiếp tục bị cắt mạch, sau một thời gian, độ nhớt của nó giảm đáng kể. Để khắc phục điều này, ta có thể cho vào alginate thành phẩm một lượng nhỏ canxi sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel. Khi sử dụng kết hợp alginate với các dạng gum khác như pactin sẽ làm tăng đáng kể độ nhớt của dung dịch. Alginate tạo dạng màng mỏng (films) của natri hoặc canxi alginate với dạng sợi (fibres) của canxi alginate. Tính chất này của alginate được ứng dụng trong việc tạo nên các lớp phủ bên ngoài.(Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, 2005)[13] 2.2.2.5. Phương pháp Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong gel alginate canxi bằng phương pháp bẫy đã trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi. Phạm vi sử dụng của nó ngày càng rộng rãi, từ các tế bào cho tới tế bào của động vật có vú. Quy trình chung là trộn lẫn dung dịch alginate natri và dịch huyền phù chứa tế bào cần cố định. Dịch huyền phù thu được cho nhỏ giọt vào một dung dịch tạo gel