Nghiên cứu cơ chế phản ứng giữa một số kháng sinh β-Lactam và Enzym PBP2a bằng các phương pháp hóa tin

  • Số trang: 175 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 29 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27372 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- NGUYỄN HỌA MI NGHIÊN C U CƠ CHẾ PHẢN NG GIỮA MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ ENZYM PBP2a BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN U N ÁN TIẾN S HÓA HỌC Hà Nội – 2012 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- NGUYỄN HỌA MI NGHIÊN C U CƠ CHẾ PHẢN NG GIỮA MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ PBP2a BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và Hóa lí Mã số: 62 44 31 01 U N ÁN TIẾN S HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TSKH. ĐẶNG ỨNG VẬN 2. GS.TS. TRƯƠNG NGUYỆN THÀNH Hà Nội – 2012 2 MỤC LỤC STT NỘI DUNG TRANG DANH MỤC CÁC BẢNG 05 DANH MỤC CÁC HÌNH 06 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 09 MỞ ĐẨU 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 14 CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ PHƢƠNG 25 PHÁP TÍNH 2.1 MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC CƠ HỌC PHÂN TỬ (MM/MD) 25 2.1.1 Mẫu cơ học phân tử (M/M) 26 2.1.2 Phƣơng pháp động lực phân tử MD 38 2.2.2 Cơ cở của phƣơng pháp tính gần đúng lƣợng tử 52 2.3 PHƢƠNG PHÁP QM/MM (HYBRID QUANTUM 65 MECHANICS/MOLECULAR MECHANICS) 2.3.1 Phƣơng pháp lai hóa QM/MM trong ONIOM CHƢƠNG 3: CHUẨN BỊ INPUT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN 79 89 NGHIÊN CỨU CHO HỆ CỤ THỂ 3.1 ĐIỀU KIỆN TÍNH VỚI PHƢƠNG PHÁP MM/MD 89 3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm của tâm hoạt động và khe hẹp 89 gần tâm 3.1.2 Nghiên cứu tính hoạt động của protein và phối tử 94 3.1.3 Tính năng lƣợng tự do gắn kết của methicillin và 96 nitrocefin lên các cấu trúc khác nhau của protein PBP2a 3.2 ĐIỀU KIỆN TÍNH VỚI PHƢƠNG PHÁP QM/MM 98 (ONIOM) 3.2.1 Các mô hình tâm hoạt hóa 98 3.2.2 Các mô hình enzym 99 4.1 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 103 KẾT QUẢ TÍNH MM/ND 103 4.1.1 Về sự tồn tại của khe hẹp gần tâm hoạt động 103 SER403 của PBP2a 4.1.2 Về tính linh động của phối tử và các axit amin vùng 108 tâm hoạt động trong các phức axyl và phức michaelis của methicillin(MC1) và nitrocefin (NC1) với PBP2a 4.1.3 Năng lƣợng tự do gắn kết nitrocefin và methicillin 114 lên các cấu trúc khác nhau của PBP2a 4.2 KẾT QUẢ TÍNH QM/MM 119 4.2.1 Đƣờng năng lƣợng phản ứng của các mô hình tâm hoạt hóa 4.2.2 Đƣờng năng lƣợng phản ứng của các mô hình 126 protein 4.2.3 Lý do cho sự khác biệt trong hoạt tính giữa MC1 và 130 NC1 4.2.4 Thảo luận 134 KẾT LUẬN 136 TÀI LIÊU THAM KHẢO 140 PHỤ LỤC 154 DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG STT 1 Bảng 4.1 Các dữ liệu của phức michaelis tính toán trên Trang 94 phần mềm AutoDock và GROMACS 2 Bảng 4.2 RMSF (nm) và véctơ riêng (nm2) của phối tử và Ser403 103 trong các phức michaelis khe β3Z mở của PBP2a* với meticillin và nitrocefin 3 Bảng 4.3 So sánh các thành phần của năng lượng tự do gắn kết * 104 (kJ.mol-1) 4 Bảng 4.4 Năng lượng tương đối (kcal/mol) của các phức phản ứng, các 111 trạng thái chuyển tiếp, các trạng thái trung gian, các sản phẩm trong phản ứng của MC1 và NC1 5 Bảng 4.5 Năng lượng tương tác tĩnh điện và tương tác vdW 118 giữa các nguyên tử QM và môi trường Protein (kcal/mol) 6 Bảng 4.6 Góc căng của các phối tử (theo độ), như được 121 xác định trong hình 4.10 7 Bảng4.7 Điện tích nguyên tử Mulliken của meticillin 122 8 Bảng 4.8 Điện tích nguyên tử Mulliken của nitrocefin 122 9 Bảng 4.9 Điện tích nguyên tử Mulliken của mô hình SER403 123 5 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang 1 Hình 1.1 Ảnh SEM hiển vi của meticillin- kháng Staphylococcus aureus 5 2 Hình 1.2 Cấu trúc phức axyl hóa của 1MWU từ ngân hàng dữ liệu 6 protein data bank 3 Hình 1.3 Sản sinh ra men β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân β- 7 lactam 4 Hình 1.4 Cơ chế axyl hóa trong đó nhóm cacbonyl của β-lactam bị tấn 11 công bởi SER403 của tâm hoạt hóa 5 Hình 1.5 Các cơ chất MC1 và NC1 12 6 Hình 2.1 Các loại năng lượng trong mẫu MM: 16 a: kéo căng, b: góc liên kết, c: góc nhị diện, d: Coulomb. 7 Hình 2.2 Sự khác biệt giữa thế Morse (đường nét liền) và thế điều hoà 17 (đường nét rời) 8 Hình 2.3 Biến thiên năng lượng góc nhị diện khi có 1, 2 và 3 hàng rào 18 thế năng. 9 Hình 2.4 Mẫu thế tương tác site-site giữa hai phân tử lưỡng nguyên R: 20 khoảng cách tâm khối; r1A2B và r2A1B : khoảng cách giữa các site không ở trong cùng một phân tử 10 Hình 2.5 11 Hình 2.6 Minh hoạ hai phương trình Newton 28 Thuật toán bước nhảy ếch để tính tích phân các phương trình 32 Newton (trục t xác định các giá trị hằng số khi tính tích phân) 6 12 Hình 2.7 Các dạng lai hóa tự nhiên: Rồng từ thời Lý, chạm 55 khắc Nghê trên nóc mái đình 13 Hình 2.8 Minh họa các phân lớp trong tính toán ONIOM 14 Hình 3.1 Cơ chế axyl hóa trong đó nhóm (OH) của SER403 trong 79 73 PBP2a tấn công nhóm (CO) cacbonyl của -lactam 15 Hình 3.2 Nếp gấp β3 (gồm các axit amin 594-603); cuộn Z (bao gồm 81 các axit amin 436 đến 448) 16 Hình 3.3 Cấu hình của PBP2a (vùng mầu đậm và nhạt), PBP2a* (mầu 82 đậm) và Ser 403 (các quả cầu) 17 Hình 3.4 RMSD của meticillin trong phức axyl với PBP2a nhận được 83 khi khớp bình phương tối thiểu MC1 với cấu hình ban đầu của PBP2a đầy đủ (mầu nhạt) và với chỉ riêng phân mảnh PBP2a* (mầu đậm) 18 Hình 3.5 Mô hình các phối tử trong các tính toán QM 19 Hình 3.6 Cấu trúc X-ray của PBP2a trong phức với MC1 (mã trong 90 89 PDB là 1MWU) 20 Hình 4.1 Minh họa về các trạng thái của khe hoạt động. Trạng thái mở 93 (mầu sẫm) trong cấu trúc phức acyl của metixilin và trạng thái đóng (mầu nhạt) trong cấu trúc apo protein. Các axit amin Glu447 và Thr444 thuộc về cuộn Z và các axit min Lys597 và Ala601 21 Hình 4.2 RMSD của khung protein (trên) và phối tử (dưới) nhận được 98 bằng cách khớp bình phương tối thiểu với khung protein ban đầu trong phức acyl, phức Michaelis khe β3Z mở và cấu trúc apo 22 Hình 4.3 Sự sai lệch của khoảng cách Cα trung bình (nm) của các axit 100 7 amin trong xoắn α2 đầu N (3 nhóm đồ thị đầu tiên bên trái hình trên) và nếp gấp β3 (6 nhóm đồ thị kế tiếp tính từ trái qua của hình trên) và giữa xoắn α2 đầu N và nếp gấp β3 23 Hình 4.4 Phân tích RMSF. RMSF trung bình/axit amin trong cấu trúc 101 apo (đường liền), trong phức acyl của PBP2a* với MC1 (hình tròn) và NC1 (hình vuông) và trong phức Michaelis khe β3Z mở của PBP2a* với MC1 (hình tam giác) và NC1 (hình thoi). Hình trên cùng: nếp gấp β3 và cuộn Y; hình giữa: cuộn Z; hình dưới cùng: xoắn α2 đầu N 24 Hình 4.5 Đường năng lượng phản ứng (kcal/mol) của các mô hình QM 111 tâm hoạt hóa 25 Hình 4.6 Các cấu hình tối ưu (khoảng cách liên kết, đơn vị là Å) trong 113 phản ứng của MC1 trong mô hình enzym ONIOM(DFT:MM) và mô hình QM tâm hoạt hóa (trong ngoặc đơn) 26 Hình 4.7 Các cấu hình tối ưu (các khoảng cách liên kết, đơn vị là Å) 114 trong phản ứng của NC1 với mô hình enzym ONIOM(DFT:MM) và mô hình QM tâm hoạt hóa (trong ngoặc đơn) 27 Hình 4.8 Chồng chập vị trí cấu trúc X-ray (mã 1MWU theo PDB) và 116 cấu trúc sản phẩm tối ưu (P) bằng ONIOM (màu đỏ của các nguyên tử Cacbon, quả cầu màu trắng là cấu trúc X-ray, và dạng que là cấu trúc ONIOM) 28 Hình 4.9 Các axit amin chìa khóa xung quanh các phối tử ở TS1 29 Hình 4.10 Xác định về góc căng của phối tử MC1 và NC1 và các mô 120 119 hình đơn giản hóa. 30 Hình 4.11 Bền hóa cộng hưởng trong Int’ của NC1 8 121 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG U N ÁN KÝ HIỆU DIỄN GIẢI SA Chủng vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus QM/MM Lai hóa cơ học phân tử kết hợp với cơ học lượng tử MM/MD Động lực học cơ học phân tử ONIOM Our own N-layered Integrated molecular Orbital molecular Mechanics MM PBP2a Cơ học phân tử molecular mechanics Protein Binding penicillin 2a (protein liên kết với penicillin 2a kháng thuốc) MRSA Chủng vi khuẩn tụ cầu vàng kháng methicillin PBP Protein liên kết với penicillin DFT Lý thuyết phiếm hàm mật độ Density Functional Theory NR Phức michaelis Phức axyl cấu trúc apo 1MWU Phương pháp Newton-Raphson Phức không cộng hóa trị Phức cộng hóa trị Cấu trúc của enzym PBP2a khi chưa phản ứng với cấu tử Phức đã axyl hóa của methicillin với protein binding penicillin 1MWS Phức đã axyl hóa của nitrocefin với protein binding penicillin PBP2a* Phần protein PBP2a bao gồm axit amin 310 đến 668 đã được cắt 300 axit amin từ 27 đến 300 SER403 Axit amin SERINE ở vị trí thứ 403 trong chuỗi protein PBP2a MC1 Methicillin NC1 Nitrocefin 9 MM-PBSA Molecular Mechanics- Poisson Bolzmann Surface Area MD Molecular Dynamics – Động lực cơ học phân tử QM Quantum mechanics – Cơ học lượng tử MM+, AMBER, BIO+ Tên riêng các trường lực (CHARMM), OPLS MM+ AMBER BIO+ (CHARMM) Merck Molecular Assisted Model Building and Energy Refinement Chemistry at HARvard Molecular Mechanics OPLS Optimized Potential for Liquid Simulations UHF Unrestricted Hartree-Fock - Phương trình Hartree-Fock cho cấu hình không hạn chế RHF Restricted Hartree-Fock - Phương trình Hartree-Fock cho cấu hình hạn chế RMSD Độ sai lệch bình phương trung bình (root mean square deviation) RMSF Độ sai lệch của độ lệch bình phương trung bình (the root mean square fluctuation) MO-LCAO Obitan phân tử dưới dạng tổ hợp tuyến tính các obitan nguyên tử SCF Phương pháp trường tự hợp LA Nguyên tử kết nối LAC Nguyên tử được liên kết với nguyên tử kết nối the link atom connection LAH Nguyên tử được thay thế the link atom host 10 MỞ ĐẦU Kháng sinh β-lactam lúc đầu gồm penicillin được Fleming phát hiện vào năm 1929 và đến năm 1955, cephalosporin được phát hiện lần đầu. Từ đó, các kháng sinh β-lactam được sử dụng rộng rãi với những lượng lớn và liên tục được phát triển, nhằm tìm ra những hợp chất mới có hiệu quả cao hơn để đối phó với tác dụng của vi khuẩn làm vô hiệu hoá các kháng sinh đã có trước, hay còn gọi là hiện tượng kháng các kháng sinh, cũng được gọi là “nhờn thuốc”. Đây là một vấn đề có tầm quan trọng hàng đầu, thu hút sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trong các lĩnh vực hoá dược, hoá sinh, sinh lý, vi trùng học và y học. Chủ đề của đề tài là “Nghiên cứu cơ chế phản ứng giữa một số kháng sinh β-lactam và enzym PBP2a bằng các phương pháp Hóa tin” nhằm đi đến có đóng góp vào việc giải quyết vấn đề nan giải nói trên, tức là nghiên cứu lý giải cơ chế kháng sinh β-lactam liên tục bị các vi khuẩn làm mất hiệu quả. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung về mặt bản chất hóa học, cơ chế hóa học để tìm ra phương pháp nghiên cứu, cơ chế tác dụng của các thuốc β-lactam đối với vi khuẩn gây bệnh. Thông qua việc tính toán các tính chất hóa lý, hàng rào thế năng, năng lượng tương tác giữa thuốc kháng sinh với enzym của vi khuẩn gây bệnh bằng các phương pháp tính lý thuyết, chúng tôi đã thu được các kết quả khả quan trong việc đánh giá khả năng ức chế của thuốc và giải thích được phần nào nguyên nhân kháng thuốc β-lactam của vi khuẩn tụ cầu vàng. Với sự phát triển mạnh mẽ của tốc độ các hệ thống máy tính hiệu năng cao, cộng với việc ra đời của các phương pháp tính mới như các phương pháp lai hóa giữa cơ học phân tử kết hợp với cơ học lượng tử QM/MM, hay giữa phương pháp động lực phân tử kết hợp với cơ học phân tử MM/MD đã trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực giúp giảm thời gian tính và đem lại rất nhiều kết quả như mong muốn, góp phần giúp con người khám phá, giải quyết được 11 nhiều bài toán hóc búa phức tạp. Có thể kể ra đây một vài nghiên cứu hiện nay trên thế giới như: Sử dụng phương pháp QM/MM, MM/MD trong nghiên cứu chất ức chế proteaza-HIV và malate Dehydrogenaza. Ứng dụng QM/MM trong nghiên cứu phức các kim loại chuyển tiếp . Ứng dụng phương pháp QM/MM trong tính toán các phản ứng hữu cơ quang hóa…cùng vô số các ứng dụng và thành tựu nổi bật khác nữa89,99,100,102. Chính vì tính hấp dẫn của phương pháp cũng như các kết quả thu được rất đáng khích lệ đó, việc tiếp tục nghiên cứu, ứng dụng các thành tựu đã có của phương pháp lai hóa QM/MM, MM/MD đã trở thành một hướng đi mới của lĩnh vực hóa học tính toán cực kỳ thu hút, nhiều hứa hẹn và đã đóng góp không ít các kết quả khoa học hữu ích cho thực tiễn. Song song với việc phát triển của phần cứng máy tính, việc phát triển các phần mềm hỗ trợ việc tính toán cũng không ngừng cải tiến. Trong luận án chúng tôi sử dụng cả các phần mềm thương mại (mã nguồn đóng) và các phần mềm miễn phí (mã nguồn mở). Phần mềm GAUSSIAN09 là phần mềm đóng gói, được Giáo sư Keiji Morokuma tại Đại học Kyoto tạo điều kiện cho tác giả luận án cộng tác nghiên cứu và sử dụng. Phần mềm GROMACS4.06 là phần mềm mã nguồn mở miễn phí với tiêu chí nhanh hơn, mềm dẻo hơn, đã được cộng đồng các nhà khoa học công nhận sử dụng và công bố các công trình trên các tạp chí uy tín. Với hai phần mềm này có thể sử dụng phương pháp lai hóa QM/MM và MM/MD giúp cho việc nghiên cứu các hệ hóa sinh với số lượng rất lớn các nguyên tử một cách hữu hiệu và có những bước đột phá mới. Đây là luận án tiến sỹ đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu theo hướng lý thuyết sử dụng các phương pháp lai hóa QM/MM và MM/MD để nghiên cứu cơ chế phản ứng của một số β-lactam với enzym PBP2a. Luận án đã thu được 12 một số kết quả mới nhiều triển vọng, mở ra một hướng nghiên cứu hiệu quả, có thể triển khai và đóng góp cho nghiên cứu cơ bản của Việt Nam. 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Staphylococcus aureus (SA) hay còn gọi là vi khuẩn tụ cầu vàng một loại vi khuẩn gây bệnh và là nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng tụ cầu khuẩn. Nghiên cứu của các tạp chí chuyên ngành cho thấy rằng khoảng 50% loài người có mang SA trên cơ thể, và việc cơ thể có mang SA có liên quan với việc tăng nguy cơ nhiễm tụ cầu khuẩn.35,107 Các triệu chứng của nhiễm trùng SA bao gồm lở loét, mụn mủ, nhọt, viêm phổi, và nhiễm trùng sau phẫu thuật là một vấn đề nghiêm trọng tại các bệnh viện. Alexander Fleming (1881 – 1955) là một bác sĩ, nhà sinh học và đồng thời là một nhà dược lý học người Scotland. Ông được coi là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong y học. Ông đã được trao giải thưởng Nobel về y học năm 1945 cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey về việc tìm ra và phân tách được penicilin – được coi là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị những bệnh nhiễm trùng. Từ năm 1942 bệnh nhiễm trùng tụ cầu khuẩn có thể được chữa khỏi bằng thuốc kháng sinh penicillin, tuy nhiên, vào đầu những năm 1960, sự xuất hiện của một chủng SA mới kháng β-lactam được gọi là Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) (Hình 1.1), đã được công bố35 . MRSA gây ra một trong những bệnh nhiễm trùng nguy hiểm và thường gặp nhất ngày nay, việc kháng thuốc gây ra một trở ngại lớn trong điều trị dứt điểm bệnh, nhu cầu có những thuốc kháng sinh mới để điều trị loại bệnh này là rất cần thiết và quan trọng. 14 Hình 1.1. Ảnh SEM hiển vi của methicillin-kháng Staphylococcus aureus (hình tham khảo từ internet) Chủng mới này có mang một gen đặc biệt gọi là gen MecA, không có nguồn gốc từ SA, từ một nguồn không xác định bên ngoài nào đó. Các kháng sinh β-lactam như penicillin và methicillin khi thâm nhập vào tế bào của vi khuẩn SA liên kết với enzym penicillin binding protein (PBP) cản trở PBP xúc tác cho sự hình thành liên kết giữa các peptit của các chuỗi peptidoglycan của thành tế bào. Sự ức chế cộng hóa trị của β-lactam với PBP dẫn tới thành tế bào suy yếu và cuối cùng gây chết các tế bào. Tập quán của gen MecA giữ lại trong mã hóa của 57,34,45,108,72,20,79,52,39,38,70 (PBP2a) MRSA, . Gen MecA được bảo toàn rất cao giữa các MRSA cô lập được (hơn 90% chuỗi PBP2a là đồng nhất giữa các dòng), PBP2a mới phát hiện không giống bất kì PBP thông thường được tạo ra bởi SA (chỉ có dưới 20% chuỗi là đồng nhất) và các PBP2a này không nhạy với β-lactam. PBP2a gây ra sự kháng thuốc phổ rộng với methicillin và các kháng sinh β-lactam. PBP2a thể hiện ái lực thấp với β-lactam một cách bất thường ở chỗ nó vẫn giữ được khả năng làm trung gian xây dựng thành tế bào và giữ nguyên hoạt tính cho phép sự tổng hợp thành tế bào ngay cả ở nồng độ gây chết người của β-lactam. Cơ chế và cấu trúc tinh thể của PBP2a được trình bày ở đây làm sáng tỏ những đặc trưng cấu trúc lí giải cho sự kháng βlactam của chúng và đưa ra những hiểu biết quan trọng cho việc thiết kế những kháng sinh tiềm năng chống lại MRSA. 15 Hình 1.2. Cấu trúc phức axyl hóa của 1MWU từ ngân hàng dữ liệu protein data bank Sự ức chế hoạt động PBP2a bởi một phân tử nhỏ, dự kiến sẽ dẫn đến ly giải tế bào của vi khuẩn, do đó nên nó được coi là cách tiếp cận trực tiếp nhất để điều trị các bệnh nhiễm trùng MRSA. Thông thường các β-lactam như methicillin, làm ức chế hoạt động của PBP2a trong việc làm trung gian xây dựng thành tế bào, các hợp chất thay thế methicillin cần được thiết kế một cách nào đó cho phép nó liên kết mạnh mẽ hơn với tâm hoạt động của enzym PBP2a. Để làm điều này một cách hợp lý, chi tiết cơ chế phân tử của β-lactam liên kết với PBP2a nên được hiểu rõ. Như đã biết, quá trình này có tính ràng buộc liên quan đến quá trình tạo phức không cộng hóa trị michaelis giữa betalactam và PBP2a sau đó là đến quá trình axyl hóa, kết quả là hình thành liên kết cộng hóa trị với Ser403 nằm ở vị trí tâm hoạt động (Hình 1.2, hình 1.4).43,112 Trong quá trình axyl hóa, nhóm hydroxyl của Ser403 tấn công cacbon trong nhóm cacbonyl của phối tử. Kết quả là, liên kết C-N của phối tử β-lactam được phân tách, trong khi nhóm cacboxyl hình thành mối liên kết cộng hóa trị với nhóm hydroxyl của SER403. Việc kháng phổ rộng của MRSA với kháng sinh nên được liên kết với việc giảm tỷ lệ phản ứng axyl hóa PBP2a. Điều này có nghĩa là việc thiết kế các thuốc kháng sinh mới sẽ 16 yêu cầu kiểm soát cẩn thận các hàng rào năng lượng cần thiết trong bước axyl hóa cũng như bước tạo thành phức không cộng hóa trị trước đó. Đã có các công trình tổng quan về cơ chế kháng β-lactam.34,108,52,70 Có rất nhiều giả thuyết về cơ chế kháng β-lactam của MRSA nhưng nổi bật nên là 3 giả thiết kháng β-lactam của MRSA như sau: Cơ chế thứ nhất34,108 là việc sản sinh ra các enzym β-lactamase có khả năng thủy phân β-lactam. Theo cơ chế này đề xuất phổ biến nhất của việc kháng kháng sinh β-lactam có liên quan đến việc sản sinh ra một loại enzym thích hợp, ví dụ, β-lactamase có thể làm suy thoái, sửa đổi và thậm chí phá hủy các kháng sinh trước khi chúng có thể tiếp cận các tâm hoạt động trên MRSA. Các kháng sinh β-lactam có một yếu tố chung trong cấu trúc phân tử của chúng: đó là một vòng bốn nguyên tử được gọi là vòng lactam. Các lactamase phá vỡ β-lactam bằng cách mở vòng lactam và từ đó khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử. Những enzym này đặc biệt quan trọng trong vi khuẩn Gram âm khi chúng tạo thành các cơ chế bảo vệ chính đối với thuốc trên cơ sở β-lactam. 1 2 R1 O Beta-- lactam S HN Beta - lactam.AmpC HO N R2 AmC -OH O H2O R1 S O - O N - O O - AmC S O N HO O R2 R2 O HN O R1 HN AmpC 3 OH2 - AmC.product AmC O O - AmC product 5 4 Hình 1.3. Sản sinh ra men β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân β-lactam Việc phân loại phân tử của β-lactamase được dựa trên các nucleotit và trình tự axit amin trong các enzym này. Cho đến nay có bốn lớp (class) phân 17 loại theo chức năng được công nhận (A-D). Các lớp A, C, và D tác động theo cơ chế dựa trên serine, trong khi đó lớp B hoặc Metallo-β-lactamase cần kẽm cho tác dụng của chúng.34 Ví dụ, β-lactamase kiểu AmpC là loại β-lactamase lớp C, thường được phân lập từ vi khuẩn Gram âm kháng cephalosporin phổ rộng. AmpC được mã hóa đặc trưng trên nhiễm sắc thể của nhiều loại vi khuẩn gram âm bao gồm Citrobacter, Serratia và Enterobacter. Hình 1.3 minh họa việc sản sinh ra enzym β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân βlactam cũng như là cơ chế kháng β-lactam. Cơ chế thứ hai34,108 là sử dụng các men protein transpeptidases (được biết như là các penicillin-binding protein (PBP) cần cho việc nối các mạch peptidoglycan để tạo màng tế bào cứng tham gia gây vô hiệu hóa kháng sinh. Cơ chế này dựa trên giả thiết cho rằng quá trình axyl hóa protein bởi các kháng sinh có 3 giai đoạn: Giai đoạn 1. PBP2a tương tác với β-lactam với hằng số Kd tạo ra phức không cộng hóa trị (PBP2a - β-lactam). Giai đoạn 2. Phức không cộng hóa trị (PBP2a- β-lactam) sẽ chuyển thành phức cộng hóa trị axyl β-lactam -PBP2a với hằng số chuyển hóa K2. Giai đoạn 3. Với một hằng số K3 vô cùng nhỏ phức cộng hóa trị axyl βlactam -PBP2a phân ly tạo ra PBP2a và β-lactamoate. Trong đó: Hằng số phân ly của phức không cộng hóa trị Kd, Hằng số tốc độ bậc 1 K2, Hằng số tốc độ của quá trình phân hủy phức axyl K3. So sánh các thông số động học của PBP2a với các PBP nhạy cảm với βlactam thấy việc kháng β-lactam của PBP2a chủ yếu là do việc tạo phức axyl β-lactam - PBP trung gian là không hiệu quả mà không phải là do sự không khớp của phân tử β-lactam với tâm hoạt động (Kd) cũng không phải do sự phân huỷ nhanh hơn của phức trung gian axyl-PBP (K3)72,70,36,73. 18 Bởi vì các giá trị Kd đặc trưng cho PBP là tương đối cao (cỡ millimol), tính hiệu quả của các chất ức chế β-lactam là do khả năng của chúng tạo thành phức cộng hoá trị bền với các protein đối của chúng. Do đó, giảm tốc độ tạo phức trung gian Kd và quá trình tạo phức axyl hóa (K2) là một chiến lược hiệu quả để đạt tới tính kháng thuốc phổ rộng.70,112,41 Các PBP kháng như vậy không nhất thiết cản trở sự tăng trưởng tế bào hoặc khả năng tồn tại của nó nếu các yếu tố khác có thể bù đắp cho việc giảm tính hiệu quả của các enzym. 24,62 Cơ chế này hiện đang là nguyên nhân chính gây ra sự kháng thuốc trong một số tác nhân gây bệnh bao gồm các vi khuẩn Gram dương loài Staphylococcal và Streptococcal. 108 Cơ chế thứ ba là sự thải loại các phân tử β-lactam khỏi các tế bào Gram-âm bằng cách bơm thoát.108 Theo cơ chế này thì sự ngăn cản kháng sinh tiếp cận protein đối tác (target protein) bằng cách thẩm thấu ngược (altered permeability) hoặc thoát cưỡng bức (forced efflux) – còn gọi là thoát hoạt động (active eflux). Ví dụ, điều này có thể được thực hiện bởi các bơm kháng sinh thoát cưỡng bức (forced efflux pump) MexA, B-OprM vốn là một nguyên nhân chính gây kháng ở Pseudomonas và trong các loài gây bệnh Gram âm khác. Thoát hoạt động là một cơ chế đáp ứng việc thải loại các chất độc hại và kháng sinh ra khỏi tế bào. Nó được xem là phần không thể thiếu của sự trao đổi dị chất (xenobiotic metabolism). Cơ chế này là quan trọng trong dược học bởi vì nó tham gia vào việc kháng các kháng sinh. Các hệ thoát (efflux) hoạt động thông qua một cơ chế phụ thuộc năng lượng (Active transport) để bơm đẩy những chất độc không mong muốn qua một cái bơm thoát đặc biệt. Một số hệ thoát đặc hiệu cho từng loại thuốc, một 19 số khác lại có tác dụng kháng đa thuốc phổ rộng (multidrug resistance MDR). Các chất vận chuyển thoát khuẩn (bacterial efflux transporters) được phân thành 5 họ chủ yếu dựa trên trật tự axit amin và nguồn năng lượng được dùng để thải cơ chất. Một trong những chất đặc trưng tốt nhất cho chúng là hệ thoát thuốc (drug efflux system) MexAB–OprM của thể sinh bệnh cơ hội (opportunistic pathogen) Pseudomonas aeruginosa. Cái bơm tay ba này (tripartite pump - gồm có “bơm” MexB vận chuyển RND màng trong, lớp xốp OprM màng ngoài, và chất bao MexA tan được) tác động trên một phổ rộng các chất kháng sinh bao gồm tetracycline, chloramphenicol... cũng như các lactam và các chất thụ động -lactamase như là axit clavulanic108. Tuy nhiên tất cả đều dưới dạng giả thuyết. Một trong những kết quả đáng lưu tâm nhất là của Lim và Strynadka70. Đề xuất của Lim và Strynadka theo cơ chế thứ hai tức là việc kháng -lactam liên quan đến liên kết với các enzym protein transpeptidases (được biết như là các penicillin-binding protein (PBP) cần cho việc nối các mạch peptidoglycan để tạo màng tế bào cứng, sự kháng của các “siêu bọ” này đối với các kháng sinh dòng -lactam rất quan trọng trong điều trị được thực hiện gián tiếp thông qua enzym protein binding penicilin 2a (penicillin-binding protein 2a (PBP2a)). Lim và Strynadka đã dẫn chứng ra được rằng, cấu trúc tâm hoạt động của PBP2a thay đổi và sự chuyển dạng của phối tử cũng như hốc phản ứng tại tâm hoạt động từ cấu trúc apo ban đầu so với cấu trúc đã axyl hóa thông qua các cấu trúc Xray chụp được. Căn cứ trên các cấu trúc tinh thể của ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank) về các cấu trúc trước và sau phản ứng là 1VQQ ( protein chưa có phối tử) và 1MWU (protein đã bị axyl hóa bởi methicillin), 1MWS (protein đã axyl hóa bởi nitrocefin). Hai dẫn chứng trên dẫn chúng tôi đến việc tập trung 20
- Xem thêm -