Tài liệu Nghiên cứu cơ chể phân tử kháng ung thư của bài thuốc nam địa long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ MỸ NƯƠNG NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ KHÁNG UNG THƯ CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ MỸ NƯƠNG NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ KHÁNG UNG THƯ CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số chuyên ngành: 62 42 70 01 Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 2: PGS.TS. Đỗ Thị Hồng Tươi Phản biện 3: TS. Bùi Thị Kim Lý Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Đỗ Thị Hồng Tươi Phản biện độc lập 2: TS. Võ Nguyễn Thanh Thảo NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ “Nghiên cứu cơ chế phân tử kháng ung thư của bài thuốc Nam Địa Long” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của cán bộ hướng dẫn, PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương. Các kết quả nghiên cứu trong luận án hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác. NCS. Nguyễn Thị Mỹ Nương Lời cảm ơn Để đi được trên con đường học vấn dài như bây giờ, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và động viên. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những Người đã hỗ trợ tôi trong nghiên cứu đề tài luận án, để hoàn tất bậc học cuối cùng này. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, người đã mở ra ý tưởng về hướng nghiên cứu cơ chế tác động của bài thuốc mà nhóm chúng tôi đeo đuổi trong 10 năm nay. Trong khoảng thời gian này, cô luôn hỗ trợ tôi trong học tập lẫn trong công việc giảng dạy ở trường, giúp đỡ tôi phát triển các kỹ năng nghiên cứu, khả năng sư phạm và góp phần hình thành nhân sinh quan trong tôi. Tôi đã học hỏi rất nhiều từ sự thông tuệ và tinh thần nghiên cứu khoa học nghiêm túc của cô. Tôi chân thành cám ơn các anh chị, các bạn, các em thuộc Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền. Dù đang ở nước ngoài hay công tác tại Bộ môn, mọi người đã trực tiếp hỗ trợ rất nhiều trong việc thực hiện các phương pháp thực nghiệm, thảo luận các vấn đề, hỗ trợ tìm kiếm tài liệu và hỗ trợ trong công việc. Tôi xin cám ơn bạn Bùi Hoàng Bảo Ngọc đã hỗ trợ trong phân tích dữ liệu microarray bằng IPA. Các anh chị, các bạn, các em vẫn luôn là những người chia sẻ cùng với tôi những buồn vui, khó khăn trong cuộc sống và động viên tôi nhanh chóng hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cám ơn Thầy Đinh Minh Hiệp và các anh chị, các bạn, các em trong MHG. Cám ơn thầy vẫn luôn dõi theo bước tôi và luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi. Cám ơn mọi người đã luôn động viên và giúp đỡ. Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô, anh chị em công tác tại trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, đặc biệt là quý thầy cô ở Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học. Tôi xin cám ơn Trường, Khoa, Phòng Khoa học và Công nghệ, Phòng đào tạo Sau Đại học đã ưu tiên hỗ trợ cho việc học tập và nghiên cứu của tôi. Tôi xin cám ơn các thầy cô ở các phòng thí nghiệm của Khoa đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cám ơn sự tài trợ kinh phí cho các đề tài nghiên cứu khoa học thuộc nội dung của luận án từ ĐH Quốc gia TP.HCM và Sở Khoa học - Công nghệ TP.HCM (chương trình Vườn ươm NCKH). Tôi xin cám ơn quỹ học bổng Vallet và Toshiba đã hỗ trợ cho quá trình học tập của tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô, các anh chị, các em ở Công ty TNHH CNSH Khoa Thương đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong kỹ thuật qRT-PCR về cả hóa chất, thiết bị và kỹ thuật. Tôi cũng xin cám ơn Khoa Dược, Bệnh viện Y học cổ truyền TP.HCM đã cung cấp nguyên liệu bài thuốc, sắc thuốc và kiểm tra chất lượng thuốc. Tôi xin cám ơn Trung tâm Sâm và Dược liệu, khoa Hóa – trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã hỗ trợ trong việc kiểm tra chất lượng thuốc. Tôi cũng xin đồng cám ơn Phòng Vi sinh- Dược và khoa Y học cổ truyền thuộc ĐH Y dược TP.HCM, công ty Roche Việt Nam đã hỗ trợ máy móc, cơ sở vật chất cho việc thực hiện một vài nội dung của luận án. Sau cùng tôi xin dành lời cám ơn sâu sắc đến ba mẹ, các anh chị em trong gia đình, đã luôn hỗ trợ, động viên và chăm sóc tôi. Cám ơn ba mẹ luôn ủng hộ cho việc học tập của tôi. Cám ơn ba mẹ luôn là tấm gương sáng để hình thành nên sự chăm chỉ, cần cù, hăng say lao động, tinh thần trách nhiệm và tín nghĩa ở tôi. MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn MỤC LỤC ............................................................................................................. i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .............................................................. viii MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................4 1.1. UNG THƯ THEO QUAN NIỆM HIỆN ĐẠI ...........................................4 1.1.1. Các đặc điểm bệnh sinh của tế bào ung thư ..........................................4 1.1.2. Một số con đường tín hiệu tế bào trong ung thư ...................................8 1.1.2.1. Stress mạng lưới nội chất (ER stress) .....................................................8 1.1.2.2. Đáp ứng stress oxy hóa thông qua con đường NRF2 ...........................12 1.1.2.3. Điều hòa chu kỳ tế bào .........................................................................12 1.1.2.4. Con đường đáp ứng với tổn thương DNA qua protein p53 ..................15 1.1.2.5. Con đường tín hiệu apoptosis ...............................................................17 1.1.3. Các liệu pháp điều trị ung thư ..............................................................20 1.2. Y HỌC CỔ TRUYỀN TRONG HỖ TRỢ VÀ ĐIỀU TRỊ VỀ UNG THƯ .....................................................................................................................23 1.2.1. Quan niệm ung thư trong YHCT .........................................................23 1.2.2. Tiềm năng, thách thức và định hướng phát triển của YHCT............24 1.2.3. Kiểm soát chất lượng bài thuốc ............................................................26 1.2.4. Các nghiên cứu về cơ chế của bài thuốc YHCT trong điều trị ung thư ..................................................................................................................27 1.2.5. Bài thuốc Nam Địa Long .......................................................................31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................35 2.1. VẬT LIỆU ..................................................................................................35 2.1.1. Bài thuốc..................................................................................................35 2.1.2. Các dòng tế bào ung thư ........................................................................35 2.1.3. Nguyên bào sợi ........................................................................................36 i 2.2. PHƯƠNG PHÁP .......................................................................................36 Phương pháp phân tích định tính, định lượng bài thuốc ...................36 2.2.1. 2.2.1.1. Phương pháp kiểm tra mức độ nhiễm khuẩn ........................................37 2.2.1.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng..............................................................37 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng hợp chất phenol tổng ....................38 2.2.1.4. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng ...............................39 2.2.1.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................39 Phương pháp nuôi cấy tế bào ................................................................40 2.2.2. 2.2.2.1. Phương pháp cấy chuyền tế bào ...........................................................40 2.2.2.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào sống/chết bằng trypan blue ......41 Phương pháp khảo sát khả năng gây độc tế bào .................................42 2.2.3. 2.2.3.1. Phương pháp SRB (Sulforhodamine B) ................................................42 2.2.3.2. Phương pháp xCELLigence ..................................................................43 2.2.3.3. Tính toán chỉ số gây độc tế bào chọn lọc (selective index, SI) .............44 2.2.3.4. Phương pháp phân tích isobologram ...................................................44 Phương pháp phân tích biểu hiện gene của tế bào ..............................45 2.2.4. 2.2.4.1. Phương pháp tách chiết RNA ...............................................................45 2.2.4.2. Phương pháp cDNA microarray ...........................................................46 2.2.4.3. học Dự đoán con đường tín hiệu của bài thuốc bằng các phần mềm tin sinh ...............................................................................................................47 2.2.4.4. Phương pháp qRT-PCR ........................................................................48 2.2.4.5. Phương pháp WB ..................................................................................49 Phương pháp khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis..........................50 2.2.5. 2.2.5.1. Xác định chu kỳ tế bào bằng flow cytometry ........................................50 2.2.5.2. Phương pháp nhuộm kép AO-EB..........................................................50 2.2.5.3. Phương pháp khảo sát sự phân mảnh DNA bộ gene ............................51 2.2.6. Phương pháp phân tích số liệu ..............................................................52 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ........................................................................................53 3.1. NGHIÊN CỨU KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG CỦA BÀI THUỐC .....53 3.1.1. Kiểm tra chất lượng các nguyên liệu thành phần của bài thuốc .......53 3.1.2. Kiểm tra chất lượng bài thuốc ..............................................................55 3.2. TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BÀI THUỐC ......59 ii 3.2.1. Tác động gây độc tế bào ung thư của bài thuốc NĐL .........................60 3.2.2. Tác động gây độc tế bào theo thời gian của NĐL trên tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi .................................................................................................61 3.3. VAI TRÒ PHỐI HỢP CỦA CÁC VỊ TRONG TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO MCF-7 CỦA NĐL ................................................................................64 3.4. PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CÁC GENE CỦA MCF-7 BẰNG cDNA MICROARRAY ...................................................................................................67 3.5. DỰ ĐOÁN CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA NĐL BẰNG TIN SINH HỌC .. .....................................................................................................................71 3.5.1. Phân tích làm giàu, chú giải chức năng gene (GOEA: gene ontology enrichment analysis) bằng phần mềm DAVID .................................................71 3.5.2. Dự đoán cơ chế tác động của NĐL dựa trên dữ liệu microarray bằng phần mềm IPA .....................................................................................................74 3.6. XÁC NHẬN CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU TẾ BÀO ĐƯỢC KÍCH HOẠT BỞI NĐL BẰNG qRT-PCR VÀ WB .................................................................81 3.6.1. Xác nhận kết quả của cDNA microarray bằng qRT-PCR .................81 3.6.2. Khảo sát sự thay đổi biểu biện gene ở mức mRNA bằng qRT-PCR.82 3.6.3. Khảo sát sự thay đổi biểu biện gene ở mức protein bằng WB ...........86 3.6.4. Kết quả kiểm tra kiểu hình tế bào ........................................................91 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN ...................................................................................94 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................110 KẾT LUẬN .........................................................................................................110 KIẾN NGHỊ........................................................................................................111 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ....................................................112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................113 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AO Acridine orange BN Bồ ngót CI Chỉ số phối hợp (Combination index) Ci Chỉ số tế bào (Cell index) DAVID Cơ sở dữ liệu cho chú giải, minh họa và khám phá tích hợp (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) DĐVN Dược điển Việt Nam ĐC Đối chứng ĐĐ Đậu đen ĐL Địa long ĐX Đậu xanh EB Ethidium bromide ER stress Stress mạng lưới nội chất ER Mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum) FBS Huyết thanh thai bò (fetal bovine serum) Fc Số lần thay đổi biểu hiện gene được xác định bằng cDNA microarray (fold change) FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ (The Food and Drug Administration) GOEA Phân tích làm giàu, chú giải chức năng gene (gene ontology enrichment analysis) HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) IC50 Nồng độ ức chế sinh trưởng 50% quần thể tế bào Inh% Phần trăm ức chế sinh trưởng (Percentage of growth inhibition) IPA Phân tích con đường tín hiệu tế bào (Ingenuity Pathways Analysis) iv NĐL Nam Địa Long NST Nhiễm sắc thể PBS Muối đệm phosphate (phosphate buffered saline) PI Propidium iodide qRT-PCR Phương pháp realtime RT-PCR định lượng (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) ROS Gốc oxy hoạt tính (Reactive oxygen species) SI Chỉ số gây độc tế bào chọn lọc (Selective index) SRB Sulforhodamine B UPR Đáp ứng với protein không gấp cuộn (Unfolded protein response) YHCT Y học cổ truyền WB Western blot WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hiệu suất chiết các cao thuốc ...................................................................35 Bảng 2.2. Các điều kiện thực hiện sắc ký lớp mỏng ................................................38 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra sự nhiễm khuẩn của các mẫu cao chiết các vị ĐL, ĐĐ, ĐX, BN và bài thuốc NĐL ........................................................................................54 Bảng 3.2. Độc tính của NĐL trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi .......61 Bảng 3.3. Mười gene thay đổi biểu hiện mạnh nhất của MCF-7 khi cảm ứng với NĐL ở từng thời điểm 24 và 48 h .............................................................................69 Bảng 3.4. Các gene thay đổi biểu hiện mạnh nhất chung ở cả hai thời điểm...........70 Bảng 3.5. Phân tích làm giàu, chú giải chức năng của các gene ở thời điểm 24 h bằng phần mềm DAVID ...........................................................................................72 Bảng 3.6. Phân tích làm giàu, chú giải chức năng của các gene ở thời điểm 48 h bằng phần mềm DAVID ...........................................................................................72 Bảng 3.7. Các con đường tín hiệu của MCF-7 xử lý với NĐL 24 h được dự đoán bởi IPA ......................................................................................................................75 Bảng 3.8. Các con đường tín hiệu của MCF-7 xử lý với NĐL 48h được dự đoán bởi IPA ............................................................................................................................75 Bảng 3.9. Các con đường tín hiệu của MCF-7 được dự đoán ở cả hai thời điểm 24 h và 48 h .......................................................................................................................77 Bảng 3.10. Các nhân tố phiên mã đầu nguồn được dự đoán với mức tin cậy cao khi tế bào MCF-7 cảm ứng với NĐL ở 24 và 48 h .........................................................80 Bảng 3.11. Sự thay đổi biểu hiện tương đối của một số gene được xác định bằng phương pháp cDNA microarray và qRT-PCR ..........................................................82 Bảng 3.12. Sự thay đổi biểu hiện gene tương đối của MCF-7 xử lý với NĐL được xác định bằng phương pháp qRT-PCR .....................................................................85 Bảng 3.13. Mức độ biểu hiện một số gene thuộc con đường ER stress duới tác động của NĐL ....................................................................................................................88 Bảng 3.14. Mức độ biểu hiện của các gene thuộc con đường p53 và cảm ứng apoptosis dưới tác động của NĐL .............................................................................89 vi Bảng 3.15. Mức độ biểu hiện của các gene thuộc chu kỳ tế bào dưới tác động của NĐL ...........................................................................................................................90 Bảng 3.16. Phân tích các pha trong chu kỳ tế bào MCF-7 xử lý NĐL ....................92 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Các con đường tín hiệu đáp ứng UPR và ER stress ................................10 Hình 1.2. Các cyclin và CDK trong chu kỳ tế bào ..................................................13 Hình 1.3. Các tín hiệu hoạt hóa p53 và các mục tiêu tác động của p53 ..................17 Hình 1.4. Một số liệu pháp mục tiêu tác động lên các đặc điểm đặc trưng của ung thư..............................................................................................................................22 Hình 1.5. Khó khăn của các nước thành viên trong giải quyết các vấn đề liên quan YHCT ........................................................................................................................25 Hình 2.1. Các ô đếm trong buồng đếm hồng cầu ...................................................41 Hình 2.2. Nguyên tắc xác định khả năng gây độc tế bào của một chất theo thời gian bằng hệ thống xCELLigence .....................................................................................44 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các vị thành phần ở các mẻ thuốc khác nhau. .......54 Hình 3.2. Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng của NĐL và các vị thành phần.. .....55 Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của bài thuốc ở các mẻ thuốc khác nhau .....................57 Hình 3.4. Đường chuẩn gallic acid ..........................................................................57 Hình 3.5. Đường chuẩn quercetin ...........................................................................57 Hình 3.6. Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ vitexin ...................................................................................................................................58 Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của bài thuốc với chất chuẩn vitexin ...........................58 Hình 3.8. Sự thay đổi biểu hiện của một số gene của MCF-7 xử lý với NĐL. .......58 Hình 3.9. Đường cong tăng trường của tế bào MCF-7 (M) và nguyên bào sợi (F).. ...................................................................................................................................62 Hình 3.10. Đáp ứng tức thời của tế bào MCF-7 (M) và nguyên bào sợi (F) trong khoảng thời gian ngay sau xử lý. ..............................................................................63 Hình 3.11. Giá trị IC50 của NĐL và các vị trên tế bào MCF-7 ...............................65 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện giá trị CI của NĐL trên MCF-7. ................................65 Hình 3.13. Đường cong tăng trưởng của tế bào MCF-7 khi xử lý với bài thuốc NĐL và các vị.. .........................................................................................................66 Hình 3.14. Đường cong tăng trưởng tế bào MCF-7 xử lý với các vị, các tổ hợp 3 vị và NĐL.. ....................................................................................................................66 viii Hình 3.15. Đường cong tăng trưởng của MCF-7 theo thời gian .............................68 Hình 3.16. Biểu đồ phân nhóm dữ liệu biểu hiện gene của tế bào MCF-7 không xử lý (C 24 và C 48) xử lý với NĐL sau 24 h (NĐL 24) và 48h (NĐL 48). .................69 Hình 3.17. Sự thay đổi biểu hiện tương đối của một số gene của MCF-7 khi xử lý với NĐL được xác định bằng qRT-PCR.. .................................................................84 Hình 3.18. Mức độ biểu hiện của một số protein được xác định bằng WB.. ..........87 Hình 3.19. Biểu đồ phân tích chu kỳ tế bào MCF-7 xử lý NĐL 60 h... ..................92 Hình 3.20. Các đặc điểm apoptosis của tế bào MCF-7 được xử lý với NĐL ở 60 h.. ...................................................................................................................................93 Hình 4.1. Cơ chế phân tử tác động của NĐL lên tế bào MCF-7 được dự đoán ....101 ix MỞ ĐẦU Ung thư là một trong bốn bệnh gây tử vong hàng đầu [30]. Hiện nay, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị là các liệu pháp chính thống trong điều trị ung thư, tuy nhiên gây ra nhiều tác dụng phụ. Các liệu pháp mới giúp điều trị trúng đích phân tử nhưng chi phí cao và chỉ giới hạn ở một vài loại ung thư [138]. Bên cạnh các liệu pháp Tây y, các liệu pháp sử dụng y học cổ truyền (YHCT) trong điều trị và hỗ trợ điều trị ung thư đã được một bộ phận người dân sử dụng từ lâu đời, trong đó phổ biến là các bài thuốc. Bài thuốc là sự kết hợp của các thành phần dược liệu khác nhau để tạo ra hiệu quả phối hợp, vừa tiêu diệt tế bào ung thư vừa bảo vệ tế bào thường, giảm đau, tăng cường sức đề kháng,…[15, 124] Việc sử dụng YHCT trong phòng trị bệnh có ý nghĩa quan trọng ở nhiều quốc gia phụ thuộc vào văn hóa, lịch sử, điều kiện kinh tế và nguyên lý chăm sóc sức khỏe tổng thể, nâng cao chất lượng cuộc sống của YHCT [121]. Tuy nhiên, nhiều trở ngại đã ngăn cản sự phát triển rộng rãi của YHCT, trong đó hai nguyên nhân quan trọng khiến nền y học hiện đại khó chấp nhận các sản phẩm YHCT là thiếu các bằng chứng khoa học về cơ chế tác động của thuốc và sự biến động về hiệu quả điều trị do chất lượng không ổn định của nguồn nguyên liệu [120]. Chính vì vậy, hướng nghiên cứu chứng minh cơ chế tác dụng kháng ung thư của các bài thuốc cổ truyền dựa trên cách tiếp cận của khoa học hiện đại ngày càng được quan tâm. Nhiều bài thuốc cổ truyền/dân gian Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc,… đã được chứng minh có hiệu quả kháng ung thư với nhiều cơ chế phân tử khác nhau [29, 43, 61, 65, 96, 117], tuy nhiên chưa có bài thuốc nào của Việt Nam được công bố theo hướng tiếp cận này. Theo định hướng này, nhóm nghiên cứu thực hiện các nghiên cứu trên một số bài thuốc cổ truyền/dân gian Việt Nam bằng các công cụ sinh học tế bào, phân tử và tin sinh học hiện đại nhằm góp phần cho sự phát triển YHCT trong nước. Sau một số khảo sát sơ khởi, chúng tôi chọn một bài thuốc Việt Nam có tên Nam Địa Long (NĐL) do lương y Nguyễn An Định đề xuất. Bài thuốc gồm Địa long (ĐL), Đậu đen (ĐĐ), Đậu xanh (ĐX) và Bồ ngót (BN). Các lý do lựa chọn bài thuốc này là: (1) trong dân gian bài thuốc được xem là có tác dụng điều trị sốt, viêm khớp, ung thư, điều hòa huyết áp,… (2) chưa có công bố nào về bài thuốc này; (3) 1 đây là một bài thuốc thuần Việt với các thành phần rẻ tiền, dễ nuôi trồng phổ biến ở nước ta, do đó nếu thành công, bài thuốc này sẽ có giá thành thấp và đặc biệt sẽ dễ dàng kiểm soát chất lượng về sau hơn so với các nguồn nguyên liệu ngoại nhập. Trong khuôn khổ luận án này, mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tập trung nghiên cứu cơ chế phân tử kháng ung thư của bài thuốc NĐL trên các dòng tế bào ung thư. Theo đó, các nội dung nghiên được thực hiện bao gồm: 1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu và cao chiết bài thuốc: Để đánh giá các tác dụng sinh học, đầu tiên chúng tôi cần xác định chất lượng nguồn nguyên liệu và độ ổn định của bài thuốc ở các mẻ thuốc. Chất lượng nguồn nguyên liệu được đánh giá dựa theo các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV. Tính ổn định của các cao chiết được xem xét thông qua “dấu vân tay hóa học” và “dấu vân tay sinh học”. 2. Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư và tế bào thường của bài thuốc: khảo sát trên một số dòng tế bào ung thư như MCF-7, Hep G2, NCI H460 và nguyên bào sợi bình thường, chọn dòng tế bào có đáp ứng tốt nhất. Dựa trên giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) của bài thuốc trên các dòng tế bào ung thư và tế bào thường, chỉ số gây độc chọn lọc (SI) được tính toán, từ đó đánh giá tác động gây độc chọn lọc của bài thuốc NĐL. 3. Khảo sát tác động phối hợp của bài thuốc NĐL trong hiệu quả gây độc tế bào ung thư: khả năng gây độc tế bào ung thư của các vị thành phần và bài thuốc tổng NĐL được xác định bằng phương pháp sulforhodamine B (SRB) và xCELLigence. Hiệu quả phối hợp được đánh giá bằng phần mềm CompuSyn. 4. Phân tích sự thay đổi biểu hiện gene ở mức mRNA của tế bào ung thư khi xử lý với NĐL: sử dụng phương pháp microarray để đánh giá sự thay đổi biểu hiện đồng thời của các trình tự trong tế bào, từ đó cho phép đánh giá sơ bộ tổng thể đáp ứng của tế bào khi cảm ứng với NĐL. 5. Dự đoán cơ chế tác động của NĐL bằng tin sinh học: công cụ “Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery” (DAVID) và “Ingenuity Pathway Analysis” (IPA) được sử dụng để mô tả sơ bộ dữ liệu gene được xác định bởi microarray và dự đoán các con đường tín hiệu. 2 6. Xác nhận các con đường tín hiệu của tế bào được hoạt hóa/ức chế bởi NĐL: một số con đường tín hiệu được dự đoán sẽ được xác nhận lại bằng phương pháp qRT-PCR, Western blot (WB) và kiểu hình tế bào đặc trưng. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 1.1. UNG THƯ THEO QUAN NIỆM HIỆN ĐẠI Ung thư là một trong bốn bệnh dẫn đến nguy cơ tử vong cao, sau bệnh tim mạch, bệnh hô hấp mạn tính và đái tháo đường. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization, WHO), năm 2018 trên thế giới có đến 18,1 triệu ca ung thư mắc mới và 9,6 triệu người chết do ung thư. Trong đó, châu Á có đến một nửa ca mắc mới và hơn một nửa ca tử vong do ung thư so với thế giới. Trong các loại ung thư, ung thư chiếm tỉ lệ cao nhất là ung thư vú ở phụ nữ và ung thư tuyến tiền liệt ở nam [30]. Ở Việt Nam, theo thống kê của WHO năm 2018, có 164 nghìn ca mắc ung thư mới trong năm, chiếm tỉ lệ 151,4/100.000 người/năm, thuộc nhóm có tỉ lệ mắc ung thư cao trung bình thế giới. Số người chết do ung thư là 115 nghìn người/năm, chiếm tỉ lệ 104,4/100.000 người/năm, thuộc nhóm có tỉ lệ tử vong do ung thư trung bình. Ở nam giới, ung thư gan và ung thư phổi chiếm tỉ lệ cao nhất. Trong khi đó ở phụ nữ ung thư vú là phổ biến nhất [30]. 1.1.1. Các đặc điểm bệnh sinh của tế bào ung thư Theo Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ, ung thư là tên chung của nhóm bệnh trong đó các tế bào bất thường phân chia không kiểm soát và di căn sang các mô xung quanh. Tế bào ung thư có thể di căn sang các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống máu và bạch huyết [137]. Bình thường các tế bào người tăng trưởng và phân chia khi cần thiết, dưới sự kiểm soát chặt chẽ và được hoạt hóa chết đi khi bị tổn thương. Tế bào ung thư xuất phát từ tế bào thường, tuy nhiên chúng không tuân theo quy luật bình thường. Các tế bào ngày càng già hay bất thường nhưng chúng vẫn tồn tại, hơn nữa phân chia không kiểm soát tạo thành các khối u. Từ các khối u ác tính, tế bào ung thư xâm lấn sang các mô xung quanh và theo đường máu, bạch huyết di căn đến các vùng khác trên cơ thể [114]. Để có thể bất tử và lan rộng, tế bào ung thư hình thành những đặc tính khác biệt với tế bào bình thường. Trong công bố của mình, Hanahan và Weinberg (2011) 4 đã đưa ra những đặc điểm mà hầu hết các tế bào ung thư cần có để có thể chuyển dạng từ tế bào thường thành tế bào ung thư [37]. Mặc dù còn nhiều tranh cãi vì có thể chưa đại diện được cho tất cả các tế bào ung thư do tính phức tạp của nó, những đặc điểm này phần nào giúp hình dung được những đặc tính nổi bật của tế bào ung thư. Việc hiểu rõ các đặc điểm này là cơ sở cho việc đưa ra các liệu pháp điều trị ung thư trúng đích. Các đặc điểm này bao gồm: Duy trì các tín hiệu tăng sinh: Các mô bình thường kiểm soát chặt chẽ sự sản xuất và tiết của các nhân tố thúc đẩy quá trình tăng trưởng và phân chia tế bào. Nhờ vậy các mô luôn giữ được số tế bào hằng định, thể tích tế bào và duy trì cấu trúc, chức năng bình thường của mô. Nhưng tế bào ung thư có khả năng duy trì các yếu tố tăng trưởng tế bào thông qua các cơ chế: (1) tự sản xuất các phối tử (ligand) có thể kết hợp với các thụ thể để tự kích thích quá trình tăng sinh của bản thân; (2) kích thích tế bào thường xung quanh khối u tiết các nhân tố tăng trưởng; (3) tăng cường biểu hiện số lượng protein thụ thể; (4) thay đổi cấu trúc các thụ thể để dễ dàng kết hợp với các phối tử; (5) biến đổi một số nhân tố trong con đường tín hiệu về phía hạ nguồn giúp duy trì tình trạng hoạt hóa tăng trưởng không thông qua sự kích hoạt phối tử – thụ thể. Phân tích trình tự DNA bộ gene của tế bào ung thư cho thấy các đột biến thường thúc đẩy sự hoạt hóa các thụ thể sinh trưởng. Các nghiên cứu trên tế bào ung thư da cho thấy 40% đột biến có liên quan đến cấu trúc protein B-Raf dẫn đến sự hoạt hóa liên tục con đường tín hiệu hoạt hóa phân bào tế bào (MAP kinase) bởi Raf [37]. Bất hoạt các nhân tố ức chế phát triển: Bên cạnh khả năng cảm ứng và duy trì các tín hiệu tăng trưởng, tế bào ung thư phải tránh được tác động của các nhân tố chống tăng sinh do các gene ức chế khối u mã hóa. Nhiều gene ức chế khối u bị giảm hay mất chức năng trong các dạng ung thư khác nhau, điển hình là RB (mã hóa protein u nguyên bào võng mạc retinoblasma) và TP53 (mã hóa protein ức chế khối u p53) [37]. Chống lại sự chết tế bào: Apoptosis (chết theo chương trình) là quá trình chết tế bào xảy ra dưới sự điều hòa của nhóm các nhân tố kháng apoptosis và nhóm nhân tố thúc đẩy apoptosis. Thông thường quá trình apoptosis khởi phát khi tế bào nhận 5