Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l.) g. don.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 09 năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Khoa học sự sống trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi seminar khoa học và báo cáo đề cương luận văn. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Sinh học hiện đại và GD sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Khoa học sự sống, các thầy cô và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iv MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ............. viii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề.................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ....................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa cạn ................................... 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn ................................................ 4 1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn ............................................................... 5 1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng ................................................................ 6 1.2.1. Alkaloid ........................................................................................... 6 1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn ............................................................. 8 1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn ....... 10 1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx ...................................... 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx .................................................................. 12 1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx) ....................................................... 13 1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ................ 14 1.6. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn ............................................................................................... 16 1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật...................... 16 1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................ 17 1.7. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ..................................... 18 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20 2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 20 2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 20 v 2.1.2. Vật liệu di truyền ........................................................................... 20 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu............................................ 20 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ........................................................ 20 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 21 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro ...................................................... 21 2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn ................................... 22 2.3.3. Phân tích cây chuyển gen .............................................................. 26 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 30 3.1. Kết quả tạo cây dừa cạn mang gen chuyển crPrx ................................ 30 3.1.1. Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A. tumefaciens .................................................................................................. 30 3.1.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong hệ gen cây dừa cạn ..................................................................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24] ................... 4 Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và Vincristine (B) ................. 9 Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine và vincristine ................................. 11 Hình 1.4. Cấu trúc Cấu trúc intron và exon của CrPrx [15]............................... 13 Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens ............................................................................................................. 23 Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro ................................................................. 30 Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn.......................... 31 Hình 3.3. Mảnh lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy CCM .......................... 31 Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường SIM................................. 32 Hình 3.5. Mẫu phát triển đa chồi trên môi trường SIM....................................... 32 Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM ........................................................... 33 Hình 3.7. Cây ra giá thể .......................................................................................... 33 Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong các cây dừa cạn chuyển gen .............................................................. 36 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn ......................... 24 Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ......................................... 24 Bả ng 2.3 : Hó a chấ t pha đê ̣m rử a .......................................................................... 28 Bả ng 2.4: Hó a chấ t pha đê ̣m chiế t ......................................................................... 28 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S...................................... 28 Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR .......................................................................... 29 Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa cạn................. 34 viii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS Acetosyringone bp base pairs Cặp bazơ nitơ CrPrx Catharanthus roseus Gen Prx ở cây dừa cạn peroxidase Cộng sự cs CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked Môi trường đồng nuôi cấy Xét nghiệm ELISA ImmunoSorbent Assay EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GM Germination medium Môi trường tái sinh GMO Genetic Modify Origanism Lương thực thực phẩm biến đổi gen kb Kilo base LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy in vitro theo Murashige và Skoog OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Prx Peroxidase Gen mã hóa peroxidase Prx Peroxidase Protein peroxidase RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi ix SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Vir Virulence region WHO World Health Organization x Plasmid gây khối u Tổ chức y tế thế giới MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ung thư và sức khỏe cộng đồng là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) hàng năm trên toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này. Vì vậy, rất nhiều nhà khoa học quan tâm và tìm ra những loại thuốc mới có tác dụng chống ung thư cao. Ung thư có đặc điểm là tăng trưởng không giới hạn và di căn, trong khi các khối u lành tính thường là tự giới hạn, không xâm lấn và di căn. Hiện có ba phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là phẫu thuật, hóa trị, xạ trị. Ngoài ra, còn có một số phương pháp điều trị mới đang bắt đầu được ứng dụng vào điều trị cho bệnh nhân ung thư như sinh hóa, nội tiết, liệu pháp gen… Các liệu pháp điều trị ung thư có thể được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với nhau, loại điều trị phụ thuộc vào vị trí ung thư, mức độ lan, tuổi và tình trạng sức khỏe của bệnh nhân, các chọn lựa điều trị sẵn có và các mục tiêu cho việc điều trị. Các phương pháp này gây ra những tác dụng không mong muốn như làm suy giảm sức đề kháng, mệt mỏi, rụng tóc, đau nhức. Trong bối cảnh như vậy cùng với sự phát triển của Công nghệ Sinh học, các nhà khoa học không ngừng quan tâm nghiên cứu để tìm ra các hợp chất thứ cấp có giá trị đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghệ dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Một số hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin được chiết xuất từ một số thực vật tiêu biểu như thông đỏ, dừa cạn, trinh nữ hoàng cung, nấm linh chi, giảo cổ lam được biết đến như là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thư. 1 Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là các loại ung thư máu. Trong các indol alkaloid có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết xuất được 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm, các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen mã hóa enzyme peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu đã cho thấy trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine đạt cao nhất. Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme peroxidase. 3. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase ở cây dừa cạn 2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển crPrx trong các dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn 1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa cạn Cây dừa cạn hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân hoa, thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus. Có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L) G.Don [24]. Dừa cạn thuộc họ trúc đào Apocynaceae gồm có 8 loài, loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n=16 [7], [19]. Tám loài thuộc giống này đó là:  Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;  Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;  Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;  Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;  Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;  Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;  Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;  Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Madagascar. [7], [19] Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristien và vinblastine cao nhất [24]. 3 A B C Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24] A: Catharanthus roseus var. roseus B: Catharanthus roseus var. ocellatus C: Catharanthus roseus var. albus Cây dừa cạn có nguồn gốc ở Madagasca (Châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia… Cây dừa cạn được người Pháp dưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh. Cây dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, chịu hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta [7]. Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Cây dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [7]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng, lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá 4 hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước thường biến động tùy từng vùng phân bố dài 3cm – 6cm, rộng 2cm – 3 cm. Mỗi cành thường có 8 – 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có nhiều lông, mùa hoa và quả vào tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10 hàng năm [7]. Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Quả gồm hai đại dài 2cm – 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 – 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [7]. Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ, rễ cái đâm thẳng xuống đấy có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [7]. 1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có độc, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, một số ung thư. Ở Trung Quốc, cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle-Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [24]. Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincritine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, ajmalicin… Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine và vincristine có tác dụng làm ngừng sự phân chia tế bào ở pha giữa. Vì thế, chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7]. 5 Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái. Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở Madagascar, chứa khoảng 0,1 – 0,2% alkaloid toàn phần. Tỉ lệ alkaloid trong rễ (0,7 – 2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 – 1,15%). Các nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc từ loại cây này [19]. Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên, không phải chỉ cần dùng cây dừa cạn sắc lấy thuốc uống là khỏi bệnh. Vì để chữa được bệnh ung thư cần một liều vincristine, vinblastine có hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị. Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn: Chữa ung thư máu, viêm đại tràng: lấy từ 15 – 20 g thân lá dừa cạn khô sao vàng, sắc, chia từ 2 – 3 lần uống trong ngày. Chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15g thân lá khô/ ngày). Điều trị u xơ tuyến tiền liệt: dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g; sắc uống ngày chia 1 lần. 1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng 1.2.1. Alkaloid 1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. 6 Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [13]. Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê. Chúng là hợp chất nhóm thiên nhiên rất quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao [13]. 1.2.1.2. Phân loại alkaloid Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng được gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động vật, thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid. Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp. Các nhóm alkaloid hiện nay gồm có: • Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin. • Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohtgrin, nicotin. • Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin. 7 • Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, cevadin. • Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như: morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin. • Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin. • Nhóm indol: - Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin. - Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc/ cỏ như ergin, ergotamin, acid lysergic. - Các beta-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin. - Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin • Nhóm purin: Các xanthin (caffein, theobromin, theophyllin). • Nhóm terpenoit: - Các alkaloid aconit: aconitin. - Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin, cholin, neurin. - Các vinca alkaloid: Vinblastine, vincristine… 1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn 1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn là vinblastine, vincristine, ajmalicine, vindolinine và serpentine… Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 – 1,15%, thân 0,40%, rễ chính 0,7 – 2,4%, rễ phụ 0,9 – 3,7%, hoa 0,14 – 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ 8 Catharanthus roseus cần đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [19]. Vinblastine (vincaleukoblastine), công thức phân tử: C48H58N4O9, có ở lá với hàm lượng 0,013 – 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất là 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh astetylow-virus thì sẽ không có vinblastine. Vincristine (leurocristine) có công thức phân tử: C46H56N4O10, hàm lượng thấp hơn, trong khoảng 0,0003 – 0,0015% [17]. Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7 – 1,2% alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [17]. A B Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và Vincristine (B) 1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào. Ngoài ra, cây dừa cạn còn có tác dụng hạ huyết áp và kháng một số chủng nấm gây bệnh. Nhưng ở giai đoạn 9 mang thai lại ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật gây độc cho thai nhi, thuốc chỉ dùng ở thời kì mang thai khi bệnh đe dọa đến tính mạng hoặc các thuốc khác không thể sử dụng được [20]. Hiện nay, vinblastine được ứng dụng rộng rãi vào điều trị bệnh ung thư ở người và được hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh mạch, thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, liên kết nhiều với protein huyết tương. Vinblastine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thánh desacetyl vinblastine – là chất có hoạt tính mạnh hơn vincristine, thuốc thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không biến đổi [11]. Hiệu quả chống ung thư vincristine hơn vinblastine cao hơn khoàng 10 lần để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, tác dụng tốt hơn trên bệnh bạch cầu cấp tính khác, bệnh Hodgkin, lymphosarcoma, sarcom tế bào lưới và ung thư vú có hiệu lực [11]. 1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và cincristine được tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole). Cả hai đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [22]. 10