Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen CODA vào cây cà chua

  • Số trang: 60 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 27 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------------------- PHẠM THỊ NHẬT ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN CODA VÀO CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến PGS.TS. Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, người thầy đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo của TS. Phạm Bích Ngọc – Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học, đồng cám ơn các cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ trọng điểm gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, các đồng nghiệp và tập thể lớp Cao học công nghệ sinh K6A đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Thái Nguyên, ngày ..... tháng ...... năm 2015 Học viên Phạm Thị Nhật Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng sự say mê nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS.TS Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng nhà trường. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Học viên Phạm Thị Nhật Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................3 1.1. Tổng quan về cây cà chua ....................................................................................3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, giá trị của cây cà chua...................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học .............................................................................................6 1.1.3. Một số nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua trên thế giới và ở Việt Nam .....7 1.2. Gen codA mã hóa choline oxydase ....................................................................12 1.2.1. Giới thiệu về gen codA ....................................................................................12 1.2.2. Giới thiệu về glycine betaine ..........................................................................13 1.2.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betain tăng cường khả năng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi ........................................................17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................21 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................21 2.1.1. Vật liệu thực vật ..............................................................................................21 2.1.2. Chủng khuẩn ...................................................................................................21 2.1.3. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm .......................................................................21 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................22 2.2.1. Phương pháp tạo cây cà chua chuyển gen ......................................................22 2.2.2. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen ......................................26 2.2.3. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ...........................................................32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................33 3.1. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA ..............33 3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen codA trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ......................................................................................................33 3.1.2. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA ...........34 3.1.3. Phân tích cây cà chua chuyển gen codA bằng kỹ thuật PCR ..........................37 3.1.4. Phân tích cây cà chua chuyển gen codA bằng kỹ thuật RT-PCR....................38 3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng cà chua chuyển gen trong in vitro ..........41 3.2.1. Chọn lọc ngưỡng chịu mặn của cà chua trong in vitro .....................................41 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen...................42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………………….47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số loài cây trồng chuyển gen codA mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp glycine betaine, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi ....... 19 Bảng 2.1: Môi trường nuôi và chọn lọc cây cà chua chuyển gen ............................. 23 Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB đặc................................................................ 23 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR nhân gen ....................................................... 27 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 1 ....................................... 29 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 2 ....................................... 30 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR nhân gen actin từ cDNA .............................. 31 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA từ cDNA .............................. 31 Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả chuyển gen codA vào cây cà chua ............................... 34 Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng ra rễ ở cây cà chua in vitro trong điều kiện bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy ..................................................... 41 Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen.. 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Con đường sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao............................................ 15 Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn E. coli ............................................ 15 Hình 1.3: Con đường sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn A. globiformis ............................... 16 Hình 1.4: Sinh tổng hợp GB ở Actinopolyspora halophilia ............................................ 16 Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ............................................................................... 22 Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen pBI121/codA .. 33 - A. tumefaciens ............................................... 33 Hình 3.3: Một số hình ảnh chuyển gen codA vào cây cà chua PT18 ............................. 35 .............. 37 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA tổng số tách chiết từ một số dòng cà chua chuyển gen và không chuyển gen ............................................................ 37 Hình 3.6: Kết quả tách chiết RNA từ mẫu cây cà chua ................................................... 38 Hình 3.7: Kết quả tách RNA khi loại DNA bằng DNAse ............................................... 39 Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin trong các dòngcà chua PT18 chuyển gen ......................................................... 40 Hinh 3.9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen codA trong các dòngcà chua PT18 chuyển gen ......................................................... 40 Hình 3.10: Cây cà chua không chuyển gen trên trên môi trường ra rễ ở các nồng độ muối NaCl .......................................................................................................... 42 Hình 3.11: Các dòng cà chua chuyển gen codA và không chuyển gen trên môi trường ra rễ có bổ sung 200mM NaCl .......................................................................... 44 Hình 3.12: Mảnh lá cà chua tái sinh trên môi trường có bổ sung 200 mM NaCl .......... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Anh µl micro lit µM micro mol AS Acetosyringone BAP 6-Benzyl amino purine Bp Base pair cDNA Complementary DNA Nghĩa tiếng Việt Chất dẫn dụ Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzyme sao mã ngược Cefo Cefotaxime CodA Choline oxidase gene Cộng sự Cs DNA Deoxirionucleic Acid GB Glycine betaine IBA Indolyl acetic acid Kb Kilo base MS Murashige and Skoog, 1962 Môi trường cơ bản M Marker Thang Marker chuẩn mM Milimol NAA Naphtyl acetic acid NOS Nopaline synthase teminator OD Opitical density PCR Polymerase Chain Reaction RT – PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược WT Wild type Cây không chuyển gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây cà chua có tên khoa học là Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae). Quả có chứa nhiều vitamin C nên có vị chua. Quả cà chua mọng, khi chín có màu vàng hoặc đỏ, có nhiều hình dạng: tròn, dẹt, có cạnh, có múi, v.v. Cà chua được dùng trong chế biến thực phẩm, tạo vị ngon và màu sắc hấp dẫn. Ngoài ra cà chua còn có tác dụng khá tốt trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Lá cà chua có nơi dùng chữa bệnh về huyết áp và các bệnh ngoài da. Ở nước ta việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại rau được khuyến khích phát triển. Diện tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và trung du phía Bắc. Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể như héo tươi, virus,... khó phòng trị. Các nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp đều cho thấy tổng sản lượng các cây lương thực trên thế giới chỉ đạt 20% tiềm năng di truyền. Nguyên nhân chính cho là do các stress của môi trường tác động lên cây trồng, hạn mất nước, hạn mặn và lạnh đều gây lên sự mất nước nội bào trong mô thực vật. chống chịu những yếu tố bất lợi phi sinh học khác nhau, trên. Những tác động bất lợi từ môi trường như khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan thường làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của nhiều loài cây trồng [30]. Một trong những phản ứng thường gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nước đó là tăng cường tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa như các loại đường tan, axit amin để tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào. Glycine betaine được biết đến là một trong 2 những chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như khô, hạn, lạnh [47]. Ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong việc nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng bằng cách kích thích cây trồng tổng hợp các chất thẩm thấu tương thích giúp tế bào có thể vượt qua các điều kiện cực đoan. Vì vai trò quan trọng của các chất tạo áp suất thẩm thấu để đáp ứng với áp lực môi trường ở thực vật, cây trồng gặp điều kiện bất lợi có thể được tăng cường bằng tăng tích lũy các chất hòa tan tương thích thông qua nhân giống cây trồng truyền thống, lựa chọn sự trợ giúp của marker hoặc kỹ thuật di truyền. Một trong các gen được sử dụng để chuyển vào cây trồng là codA giúp cây tự tổng hợp và tích lũy Glycine betaine. Xuất phát từ thực trạng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen codA vào cây cà chua”. 2. Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được cây cà chua mang gen codA 3. Nội dung nghiên cứu (1) Chuyển gen codA vào lá mầm cà chua thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (2) Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây cà chua chuyển gen mang gen codA (3) Phân tích và đánh giá cây chuyển gen 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây cà chua 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, giá trị của cây cà chua 1.1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado. Trước khi tìm ra châu Mỹ thì cà chua đã được trồng ở Peru và Mehico. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia. Các nhà vườn đã trồng, thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại. Những giống và loài hoang dại này được mang từ nơi xuất xứ đến Trung Mỹ, rồi đến Mehico [1]. Đến đầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng, nhiều vùng đã trồng cà chua làm thực phẩm. Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày. Cuối thế kỷ XIX, trên 200 dòng, giống cà chua được giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới [1]. Cà chua thuộc họ cà (Solaneceae), bộ cà (Solanales), phân lớp cúc (Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Lycopersicum esculentum. Cà chua còn có nhiều tên gọi khác nhau như Lycopersicum esculentum Mill, L. lycopersicum, S. lycopersicon, v.v [9]. Từ lâu có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan điểm riêng của mình. Theo H.J. Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersicon. Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum L.) thuộc loài thứ nhất [1]. Theo L.B. Lihner Nonnecke (1989) thì L. esculentum là loài cà chua trồng có 4 biến chủng sau: - L. esculentum var. Commune là giống cà chua thông thường. Hầu hết những giống cà chua trồng đều thuộc biến chủng này. Đặc điểm là thân, lá rậm rạp, sum suê, quả có khối lượng trung bình lớn. 4 - L. esculentum var. Grandifolium. Lá của biến chủng này to, giống lá khoai tây, mặt lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít. - L. esculentum var. Validum. Cà chua anh đào, cây đứng, mập. - L. esculentum var. Pyriforme. Cà chua hình quả lê. Tât cả các loài cà chua đều có số nhiễm sắc thể 2n = 24. 1.1.1.2. Giá trị dinh dưỡng Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao. Trong số các loại rau, củ, quả dùng làm rau thì cà chua là thực phẩm chứa vitamin, chất khoáng và nhiều chất có hoạt tính sinh học nhất, là thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Theo các nhà dinh dưỡng hằng ngày mỗi người sử dụng 100-200 g cà chua sẽ thỏa mãn nhu cầu các vitamin cần thiết và các chất khoáng chủ yếu. Thành phần của cà chua như sau: trọng lượng chất khô là 5-6% trong đó đường dễ tan chiếm 3%, axit hữu cơ 0,5%, xenlulo 0,84%, chất keo 0,13%, protein 0,95%, lipit thô 0,2%, chất hoáng 0,6%. Hàm lượng Vitamin C trong quả tươi chiếm 17-35,7 mg [3]. Bên cạnh những giá trị dinh dưỡng to lớn giúp bổ sung nhiều dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể thì cà chua còn có ý nghĩa rất lớn về mặt y học. Cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng tạo năng lượng, tăng sức sống, làm cân bằng tế bào, giải nhiệt, chống hoại huyết, kháng khuẩn, chống độc, kiềm hóa máu có dư axit, hòa tan ure, thải ure, điều hòa bào tiết, giúp tiêu hóa dễ dàng các loại bột và tinh bột. Dùng ngoài để chữa trứng cá, mụn nhọt, viêm tấy và dùng lá để trị vết đốt của sâu bọ. Chất tomarin chiết xuất từ lá cà chua khô có tác dụng kháng khuẩn, chống nấm, diệt một số bệnh hại cây trồng [6]. Ngoài ra cà chua còn chứa nhiều hợp chất hóa thực vật khác và chất xơ giúp cho cơ thể bài xuất cholesterol, giảm cục máu đông, đề phòng các tai biến của bệnh tim mạch, bệnh béo phì. Cà chua ăn tươi, làm nước ép thì không bị mất vitamin C nhưng khi nấu chín như làm sốt cà chua, nấu canh với sườn, với thịt nạc hay riêu cua, riêu cá...lại làm tăng khả năng hấp thu Lycopen và beta-caroten. Cà chua có lợi 5 cho sức khỏe ở mọi lứa tuổi. Đối với chị em phụ nữ, ăn nhiều cà chua sẽ có làn da khỏe đẹp, giảm nguy cơ béo phì và giảm nguy cơ ung thư vú. Ngoài ra nếu sử dụng nhiều cà chua thì tỷ lệ oxi hóa làm hư các cấu trúc sinh hóa của AND giảm xuống thấp nhất [8]. 1.1.1.3. Giá trị kinh tế Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và có nhiều cách sử dụng. Có thể dùng ăn tươi thay hoa quả, trộn salat, nấu canh, xào, nấu sốt vang và cũng có thể chế biến thành các sản phẩm như cà chua cô đặc, tương cà chua, nước sốt nấm, cà chua đóng hộp, mứt hay nước ép. Ngoài ra, có thể chiết tách hạt cà chua để lấy dầu. Quả cà chua vừa có thể dùng để ăn tươi, nấu nướng vừa là nguyên liệu cho chế biến công nghiệp với các loại sản phẩm khác nhau. Do đó, với nhiều nước trên thế giới thì cây cà chua là một cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế rất cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng. Cà chua là loại rau quả hàng đầu thế giới. Theo FAO, năng suất cà chua trên thế giới năm 2005 đạt 27,59 tấn/ha nhưng đến năm 2010 năng suất này tăng lên 33,59 tấn/ha . Năm 2010, diện tích trồng cà chua trên toàn thế giới đạt 4,34 triệu ha trong khi đó diện tích trồng cà chua ở châu Á là 24,34 triệu ha chiếm 56,13% diện tích cà chua toàn thế giới. Năng suất của châu Á đạt 33,57 tấn/ha. Trong năm 2012, sản lượng cà chua toàn cầu là hơn 162 triệu tấn, trị giá hơn 55 tỷ USD. Ở nước ta, cà chua được trồng từ rất lâu đời, cho đến nay cà chua vẫn là loại cây trồng chính được nhà nước quan tâm phát triển, năm 2010, diện tich cà chua cả nước đạt 17,6 nghìn ha, năng suất đạt 11,6 tấn/ha. Phần lớn diện tích trồng cà chua tập trung tai đồng bằng sông Hồng như Hà Nội, Hải Phòng , Hải Dương, Thái Bình, Hưng Yên, Bắc Giang, Nam Định, và một số tỉnh tại miền Trung, Tây Nguyên, Nam Bộ [56]. Cà chua là một trong những mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao kể cả dạng tươi và dạng chế biến. Lượng cà chua trao đổi trên thị trường quốc tế là 32,7 triệu tấn, trong đó 10% ở dạng quả tươi. Ở Mỹ tổng giá trị xuất khẩu một hecta cà chua cao hơn 4 lần so với lúa nước, 20 lần so với lúa mỳ [1]. Ở Việt Nam cà chua được 6 trồng trên 100 năm nay, diện tích gieo trồng cà chua hàng năm biến động từ 15-17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn [10]. Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng. Hiện nay, việc sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu và tạo thành công cây cà chua chuyển gen nhằm nâng cao năng suất, chất lượng của cà chua. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, ưa khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ. Có ánh sáng cây mới sinh trưởng và phát triển tốt. Cà chua sinh trưởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22-26oC. Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trưởng, khi nhiệt độ xuống dưới 10 oC cà chua không ra hoa. Mặc dù được xếp vào nhóm cây tương đối chịu hạn song cà chua cũng là cây ưa nước, cần một lượng nước lớn cho suốt quá trình sinh trưởng, phát triển nên cà chua cần phải được tưới nhiều nước, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nước sẽ làm cho quả dễ bị nứt. Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nước sẽ làm cho hoa được hình thành ít, dễ bị rụng quả [5]. Cà chua có thân tròn mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn thân cây hóa gỗ. Đặc tính của cà chua là bò lan xung quanh hoặc mọc thành bụi. Căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng chiều cao cây có thể phân ra 3 loại: loại lùn (dưới 65 cm), loại trung bình (từ 65 cm-120 cm), loại cao (từ 120 cm-200 cm). Trong quá trình phát triển, cây cà chua sẽ mọc rất nhiều chồi nách làm cho cây rậm rạp nên trong sản xuất người ta đưa ra kỹ thuật tỉa nhánh để cho cây tập trung dinh dưỡng nuôi quả. Hệ rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, trong điều kiện đồng ruộng rễ cà chua có thể ăn rộng tới 1,3 m và sâu tới 1 m. Với khối lượng rễ như vậy, cà chua được xếp vào cây chịu hạn. Khả năng tái sinh của rễ cà chua mạnh. Lá cà chua là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác. Đa số lá cà chua thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá hoàn chỉnh gồm có 3-4 đôi lá chét. Ở giữa các đôi lá chét còn có lá giữa, trên gốc lá chét có những lá nhỏ gọi là lá bên. Bộ lá có ý nghĩa quan trọng đối với năng suất, số lá trên cây ít, khi lá bị bệnh 7 hại sẽ ảnh hưởng đến năng suất quả. Tùy thuộc vào giống mà lá cà chua có màu sắc và kích thước khác nhau. Hoa cà chua thuộc loại hoa hoàn chỉnh (gồm lá đài, cánh hoa, nhị và nhụy). Cà chua tự thụ phấn là chủ yếu do đặc điểm cấu tạo của hoa và do cây cà chua còn tiết ra nhiều tiết tố độc nên không hấp dẫn côn trùng, ngoài ra hạt phấn nặng do đó khó có sự thụ phấn chéo xảy ra. Hoa cà chua thường mọc thành chùm, hoa dính vào chùm bởi cuống ngắn. Cà chua có 3 dạng chùm hoa: dạng chùm hoa đơn giản, dạng chùm hoa trung gian và dạng chùm hoa phức tạp. Số chùm hoa trên cây dao động từ 4-20, số hoa trên chùm dao động từ 2-26 hoa. Hoa đính dưới bầu nhụy, đài hoa màu vàng, số đài và số cánh hoa tương ứng nhau từ 5-9. Hoa lưỡng tính, nhị đực liên kết nhau thành bao hình nón, bao quanh nhụy. Quả cà chua thuộc loại quả mọng bao gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn, giá noãn. Quả thường có 2,3 hay nhiều ngăn hạt. Hình dạng và màu sắc quả phụ thuộc vào từng giống. Ngoài ra màu sắc quả chín còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ phụ thuộc vào hàm lượng caroten và lycopen. Ở nhiệt độ 30oC trở lên, sự tổng hợp lycopen bị ức chế, trong khi đó sự tổng hợp beta-caroten không mẫn cảm với tác động của nhiệt, vì thế trong mùa nóng cà chua có màu quả chín vàng hoặc đỏ vàng. Trọng lượng quả cà chua dao động rất lớn từ 3-200 gam phụ thuộc vào giống [4]. 1.1.3. Một số nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trên thế giới Trong khoảng 200 năm trở lại đây tình hình chọn tạo cà chua trên thế giới đã có nhiều tiến bộ. Lịch sử nghiên cứu chọn tạo cà chua trên thế giới bắt đầu ở châu Âu. Người Italia là những người đầu tiên phát triển các giống cà chua mới, họ chọn các giống có sự khác nhau về tính trạng quả, chủ yếu là màu sắc quả. Theo ý kiến của Anpachev (1978), Iorganov (1971), Phiên Kì Mạnh (1961) thì xu hướng chọn tạo giống cà chua mới là [12]: + Tạo giống chín sớm phục vụ cho sản xuất vụ sớm + Tạo giống cho sản lượng cao, giá trị sinh học cao, dùng làm rau tươi và nguyên liệu cho chế biến đồ hộp 8 + Tạo giống chín đồng loạt thích hợp cho cơ giới hóa + Tạo giống chống chịu sâu bệnh Các nhà chọn tạo giống trên thế giới đã sử dụng nguồn gen của các loài hoang dại làm nguồn gen chống chịu với các điều kiện bất thuận bằng nhiều con đường khác nhau như lai tạo, chọn lọc giao tử, hợp tử, đột biến nhân tạo…bước đầu đã thu được những thành công nhất định. Gần đây, nhiều nước trên thế giới đặc biệt là Mỹ, các nhà khoa học đã tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen trong đó có cà chua. Những giống cây trồng này ngoài khả năng chống chịu được sâu bệnh, tuyến trùng, khô hạn, sương muối mà còn có khả năng cất giữ bảo quản lâu, chất lượng cao, mang nhiều dược tính, năng suất cao. Các nhà nghiên cứu tại đại học bang Oregon (Mỹ) đang hoàn thiện một giống cà chua tím, đây là một sự kết hợp giữa màu sắc và chất dinh dưỡng. Loại cà chua này có nguồn gốc từ dạng dại ở Nam Mỹ. Hàng trăm năm trước các nhà khoa học đã phát hiện cà chua màu tím trong thiên nhiên nhưng loài cây này nhỏ và có độc. Vào thập niên 1960-1970, các nhà khoa học đã thu nhặt hạt giống từ cà chua tím và lai với loài hiện đại để cho ta loại quả an toàn với mọi người hơn dạng ban đầu của nó. Hiện nay với nền khoa học kỹ thuật hiện đại các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục những công trình nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua để đáp ứng nhu cầu của con người đặc biệt là cà chua quả nhỏ phục vụ ăn tươi và chế biến. Năm 2012, một báo cáo đầu tiên về cà chua chuyển gen tại Thái Lan cho biết các bệnh do virus gây ra là một trong những yếu tố quan trọng làm hạn chế sản lượng của cà chua ở Thái Lan. Giống cà chua biến đổi gen (Genetically modified (GM) tomatoes) có thể được sử dụng để kiểm soát một cách hiệu quả sự tấn công của virus. Tuy nhiên, tính kháng trong giống cà chua biến đổi gen được nhìn nhận là có tính chuyên biệt với chủng virus. Gene stacking (chồng gen) là một cách tiếp cận có tính chọn lọc (alternative approach) để phát triển các dòng cà chua có tính kháng phổ rộng với nhiều chủng virus khác nhau. Các nhà khoa học thuộc Đại Học Kasetsart đã chồng hai gen, CMV replicase và CaCV nucleocapsid protein liên quan 9 đến tính kháng với virus CMV và CaCV, theo thứ tự, trong giống cà chua. Hai gen này trước đây đã được chuyển nạp thành công vào giống Seedathip 3 và Seedathip 4, theo thứ tự, bằng Agrobacterium. Lai thuận nghịch giữa giống Seedathip 3 chuyển gen và Seedathip 4 chuyển gen cho thấy sự phân ly của con lai chuyển gen này ở giai đoạn cây con nhờ kỹ thuật PCR với những cặp mồi đặc hiệu đối với cả hai gen. Trong 685 dòng con lai (F1) của tổ hợp lai này, có 247 dòng (36,06%) chứa cả hai gen chuyển, 172 dòng (25,11%) chứa một gen chuyển và 266 dòng (38,83%) không có mang gen chuyển. Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới cho thấy việc chồng các gen chuyển như vậy trong cây cà chua có thể thành công bằng kỹ thuật lai thuận nghịch (reciprocal). Các dòng cà chua có những gen được chồng vào cho thấy không có khác biệt ý nghĩa đối với các tính trạng nông học so với giống cà chua bình thường và dòng bố mẹ khởi thủy [34]. Năm 2013, các nhà khoa học của Đại học Banaras Hindu và Viện Nghiên cứu rau của Ấn Độ đã tạo giống cà chua biến đổi gen biểu hiện gen ZAT12, điều khiển tính kháng đối với nhiều loại hình stress. Kết quả phân tích Southern blot cho thấy sự tích hợp thành công của gen này vào trong genome dòng cà chua biến nạp (To). Phân tích RT-PCR cũng xác định sự biểu hiện của gen này ở cây thế hệ T2. Năm trong sáu dòng cà chua chuyển gen có biểu hiện tối đa của gen ZAT12 khi được xử lý khô hạn trong vòng một tuần. Kết quả này cũng phù hợp với hàm lượng nước tương đối, sự kiện “electrolyte leakage”, chỉ số màu của diệp lục, hàm lượng hydrogen peroxide và phân tích hoạt động của catalase theo đó chỉ ra tính chịu khô hạn tăng [17]. Năm 2014, một nhóm nghiên cứu quốc tế do các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) tại Bắc Kinh, Trung Quốc, đã công bố tóm tắt lịch sử về hệ gen trong quá trình nhân giống cà chua trên cơ sở giải trình tự 360 giống của cây cà chua, bao gồm cả tự nhiên và các loài đã thuần hóa. Nghiên cứu này, do Sanwen Huang của Viện Rau và Hoa của CAAS tiến hành, được xây dựng trên giống Heinz 1706 với trình tự bộ gen cà chua đầu tiên được hoàn thành vào năm 2012. Đối với dự án này, các nhà nghiên cứu giải trình tự 333 giống màu đỏ, 10 loài cà chua hoang dã và 17 giống lai hiện nay đã thương mại 10 hiện trên khắp thế giới. Các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng khối lượng cà chua tiến hóa thông qua một quá trình gồm hai bước từ cà chua hoang dã nhỏ sang cà chua cherry và sau đó cho cà chua quả lớn. Nghiên cứu này cũng cho thấy sự khác biệt di truyền giữa các giống cà chua lớn, và cà chua chế biến như Heinz 1706. Các nhà nghiên cứu đã các định các gen chịu trách nhiệm cho kiểu hình này nằm trên nhiễm sắc thể năm, đại diện cho một dấu hiệu di truyền của cà chua chế biến [50]. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam Một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua bắt đầu xuất hiện ở nước ta từ thời kỳ thực dân Pháp xâm lược và chiếm đóng. Đến nay đã hơn 100 năm, cây cà chua ngày càng được ưu chuộng và sử dụng rộng rãi khắp cả nước. Nhu cầu tiêu dùng và đòi hỏi ngày càng cao của thị trường đã đặt ra vấn đề cấp thiết cần chọn tạo bộ giống thích hợp nhằm phát huy hết tiềm năng của giống trong điều kiện sinh thái nước ta. Công tác chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam bắt đầu từ nửa sau thế kỷ 20 và hiện nay đã đạt được những thành tựu rất đáng khích lệ. Theo Nguyễn Hồng Minh công tác nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở nước ta có thể được chia thành các giai đoạn sau [7]: - Giai đoạn trước năm 1985: Giai đoạn này công tác chọn tạo giống chủ yếu là thu thập nguồn vật liệu (nhập nội), chọn lọc, lai tạo, đánh gá từ các nguồn vật liệu này như các giống: Ba Lan, Dazuma, Nozumi, ….Sản xuất cà chua trong giai đoạn này còn nhỏ lẻ, sử dụng chủ yếu các giống cà chua múi và sản xuất chủ yếu trong vụ thu đông. Những năm cuối 1970 đầu 1980 các nghiên cứu về thời vụ đề xuất, ở miền Bắc có thể trồng được vụ cà chua xuân hè mở rộng thời gian cung cấp sản phẩm. - Giai đoạn 1986-1995: Các nghiên cứu tập trung về chọn giống cà chua chịu nóng để phục vụ cho trồng cà chua trái vụ. - Giai đoạn 1996-2005: Giai đoạn này công tác nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ưu thế lai được đẩy mạnh với mục tiêu là tạo các giống lai có nhiều ưu điểm về năng suất, chất lượng, trồng chính vụ và trái vụ, đồng thời phục vụ cho chế biến công nghiệp. 11 Ở giai đoạn này điểm nhấn là tạo giống cà chua lai chịu nóng. Tới năm 1997, trong số các tổ hợp ưu tú đã tuyển chọn ra tổ hợp nổi trội đáp ứng được mục tiêu đặt ra, đặt tên là HT7. Năm 2000, giống HT7 đã phát triển sản xuất đại trà 150 ha chủ yếu ở trái vụ (sớm, muộn) trên địa bàn các tỉnh miền Bắc. Giống HT7 phối hợp nhiều tính trạng quý: khả năng chịu nóng cao, ngắn ngày, quả nhanh chin và chin đỏ đẹp, phối hợp được nhiều đặc điểm độc đáo về cấu trúc thịt quả và vỏ đảm bảo chất lượng tiêu dung, chất lượng bảo quản và vận chuyển [8]. Giống cà chua PT18 có năng suất cao, chất lượng phù hợp cho chế biến công nghiệp và thích hợp với điều kiện sinh thái ở các vùng trồng cà chua nguyên liệu miền Bắc Việt Nam do PGS.TS. Trần Khắc Thi, ThS. Dương Kim Thoa và cộng sự tại Viện nghiên cứu rau quả nghiên cứu. Từ dòng cà chua CLN 2026 D có nguồn gốc từ Trung tâm rau màu Châu Á (AVRDC), bằng phương pháp chọn lọc cá thể qua nhiều thế hệ đã chọn ra được dòng PT 18 có nhiều triển vọng, năng suất và chất lượng phù hợp cho chế biến. Giống được Hội đồng Khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận là giống quốc gia tháng 4 năm 2004 [9]. - Giai đoạn từ 2005-2006 trở đi: Giai đoạn này sản xuất cà chua quả nhỏ đã có sự phát triển về diện tích (phục vụ chủ yếu cho đóng hộp xuất khẩu). Năm 20042005 đã hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất hạt giống cà chua quả nhỏ ra đại trà, đã tạo ra bộ giống cà chua quả nhỏ chất lượng cao trong đó tiêu biểu là giống HT144 [7]. Ngoài ra, sau nhiều năm phát triển sản xuất cà chua ở nước ta và sự phát triển ồ ạt của các giống ngoại nhập, nguy cơ bùng phát dịch bệnh hại ngày càng cao đặc biệt hiện nay là bệnh virus (TYLC). Do đó, vấn đề chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh nhất là bệnh virus đang được triển khai và đẩy mạnh. Do nhu cầu về phát triển sản xuất và tiêu dùng cà chua ngày càng cao và tính chất cạnh tranh với các giống ngoại nhập ngày càng khốc liệt, các nghiên cứu về tạo giống cà chua lai trong nước cần được đẩy mạnh để tiếp tục đưa ra các giống mới phục vụ sản xuất. 12 Bên cạnh đó, Việt Nam đang tiếp cận dần với cây cà chua biến đổi gen. Với những lợi ích mà cây trồng biến đổi gen mang lại, cùng với những yêu cầu của con người ngày càng tăng về vấn đề an ninh lương thực, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng, và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi của khí hậu,…cây trồng biến đổi gen cần được quan tâm và mở rộng diện tích. Để tạo đà cho phát triển cây trồng biến đổi gen, nhiều cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long …. đã có những nghiên cứu cơ bản ban đầu như sàng lọc các gen hữu ích, thiết kế vector chuyển gen. 1.2. Gen codA mã hóa choline oxydase 1.2.1. Giới thiệu về gen codA Gen codA mã hóa cho choline oxydase, là enzyme chìa khóa có vai trò quan trọng trong phản ứng sinh tổng hợp Glycine betain (GB). Quá trình sinh tổng hợp GB được tìm thấy ở nhiều sinh vật khác nhau: vi khuẩn, động vật và thực vật hạt kín. Tuy nhiên, gen codA chỉ được tìm thấy và phân lập ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương sống trong đất. Khi môi trường đất nhiễm mặn, vi khuẩn này sử dụng gen codA như một vũ khí bảo vệ giúp chúng sống sót. Gen codA (đã được công bố trong ngân hàng gen NCBI có mã số AY304485), phân lập từ vi khuẩn Arthrobacter globiformis có kích thước 1641bp, mã hóa cho choline oxidase gồm 547 amino acid, là một enzyme giữ vai trò quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp glycine betaine ở vi khuẩn. Choline oxidase xúc tác phản ứng oxi hóa bốn electron của choline để tạo thành glycine betaine. Vì vậy, enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong sự tồn tại và thích nghi với môi trường sống của vi khuẩn A. globiformis, sự tích lũy hàm lượng cao glycine betaine trong tế bào chất giúp cho tế bào chống lại sự khử nước và hiện tượng co nguyên sinh chất trong điều kiện môi trường bất lợi. Năm 1997, Hayashi và cộng sự đã chuyển gen codA phân lập từ vi khuẩn A. globiformis vào cây Arabidopsis thaliana. Trong nghiên cứu này, gen codA được thiết kế thêm đoạn peptide tín hiệu (transit peptide) dẫn vào trong đích là lục lạp.
- Xem thêm -