Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất steviosid và rebaudiosid A từ cỏ ngọt ( Stevia rebaudiana Bert.)

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bert.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bert.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Văn Hân người thầy đã tận tình giúp đỡ và hướng cho tôi những bước đi đầu tiên trong nghiên cứu khoa học. Thầy đã ân cần chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận, đóng góp cho tôi những kiến thức vô cùng quý báu trong công việc và cuộc sống. Tiếp theo tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn ở tổ Chiết xuất – BM Công nghiệp dược đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trường, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được những góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Trịnh Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. Vài nét về cây cỏ ngọt .................................................................................. 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 2 1.1.2. Phân bố, sinh thái .................................................................................... 2 1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................ 2 1.1.4. Công dụng ............................................................................................... 3 1.2. Các loại đƣờng steviol glycosid................................................................... 3 1.3. Một số nghiên cứu về chiết xuất steviol glycosid từ cỏ ngọt .................... 8 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 12 1.1. Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................... 12 1.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 12 1.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .................................................................... 12 1.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 13 1.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 14 1.3.1. Phương pháp chiết xuất ........................................................................ 14 1.3.2. Phương pháp tinh chế ........................................................................... 14 1.3.3. Phương pháp SKLM ............................................................................. 14 1.3.4. Xác định nhiệt độ nóng chảy ................................................................ 14 1.3.5. Phương pháp phổ .................................................................................. 14 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 15 3.1. Chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt .............................................................. 16 3.2. Tinh chế glycosid ....................................................................................... 17 3.2.1. Tinh chế bước 1 - Loại tạp chất bằng nước sữa vôi ............................ 17 3.2.2. Tinh chế bước 2 .................................................................................... 20 3.3. Phân lập steviosid và rebaudiosid A ........................................................ 29 3.3.1. Phân lập steviosid ................................................................................. 29 3.3.2. Phân lập rebaudiosid A ......................................................................... 34 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................. 38 4.1. Kết luận ...................................................................................................... 39 4.2. Đề xuất ........................................................................................................ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR: 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ carbon IR: Phổ hồng ngoại MS: Phổ khối lượng NXB: Nhà xuất bản SKLM: Sắc ký lớp mỏng STT: Số thứ tự Tr: Trang DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Cấu trúc của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 4 2 3 Bảng 3.1. Thể tích dịch chiết thu được sau 3 lần chiết Bảng 3.2. Đặc điểm của 2 phương pháp trung hòa 16 20 Bảng 3.3. Đặc điểm của 2 phương pháp tinh chế glycosid: sử 4 dụng nhựa trao đổi ion và sử dụng n-butanol bão hòa nước 25 Bảng3.4. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của 5 steviosid 31 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon 13C- 6 NMR của steviosid 32-33 Bảng3.6. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của 7 rebaudiosid A 35 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon 13C- 8 NMR của rebaudiosid A 36-37 DANH MỤC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 2 Hình 1.1. Bộ khung của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt Hình 1.2. Công thức cấu tạo của steviosid 3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của rebaudiosid A 6 4 Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ của 3 mẫu dịch chiết cỏ ngọt 17 1 4 5 Hình 3.2. Hình ảnh SKLM dịch chiết cỏ ngọt sau loại tạp bằng 5 nước sữa vôi 19 6 Hình 3.3. Cột nhựa trao đổi ion sau rửa giải 23 Hình 3.4. Hình ảnh SKLM dịch rửa giải qua 2 cột nhựa trao đổi 7 8 ion Hình 3.5. Hình ảnh SKLM của dịch n-butanol 23 25 Hình 3.6. Hình ảnh SKLM của 2 sản phẩm thu được từ 2 9 phương pháp tinh chế 26 10 Hình 3.7. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất và tinh chế glycosid 28 11 Hình 3.8. Hình ảnh SKLM của steviosid thô (SP1)và nước cái (NC) 30 12 Hình 3.9. Hình ảnh SKLM của steviosid kết tinh lại lần 1 30 13 Hình 3.10. Cấu trúc của steviosid 33 14 Hình 3.11. Hình ảnh SKLM của rebaudiosid A thô 34 15 Hình 3.12. Hình ảnh SKLM của rebaudiosid A kết tinh lại lần 1 34 16 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của rebaudiosid A 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm, nhu cầu về đường trên thế giới khoảng trên 100 triệu tấn. Mặc dù, có nhu cầu sử dụng lớn nhưng người bệnh tiểu đường và béo phì bị hạn chế dùng. Do đó, các nhà nghiên cứu đã không ngừng tìm kiếm các chất ngọt khác thay thế. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt như: aspartam, acesulfam potassium, saccharin, sucralose, cyclamat… Mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khỏe, tâm lý chung của người tiêu dùng là muốn tìm các chất ngọt từ thiên nhiên. Trong đó, cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) được xem là chất ngọt có ưu điểm nhất: người ta đã chiết được glycosid từ cỏ ngọt, có độ ngọt cao hơn sacchrose 250-300 lần. Mặt khác, nó còn có tác dụng điều hòa huyết áp, giảm cholesterol trong máu, không gây máu nhiễm mỡ,… và được đánh giá là an toàn cho con người [14], [15]. Ở Việt Nam, cỏ ngọt đã được trồng ở nhiều nơi: Cao Bằng, Hà Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hưng Yên, Thái Bình, Nghệ An, Lâm Đồng…[4] nhưng chưa có cơ sở nào chiết xuất được glycosid từ cỏ ngọt. Việc sử dụng cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở một số dạng trà thuốc, cao thuốc [11]. Đã có một số công trình khoa học trong nước nghiên cứu chiết xuất steviosid từ cỏ ngọt, nhưng chưa có nghiên cứu nào chiết xuất được rebaudiosid A, là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì ngọt nhất và ít dư vị đắng nhất trong số các glycosid của cỏ ngọt [15], [31]. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất steviosid và rebaudiosid A từ cỏ ngọt” nhằm mục tiêu: 1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp chiết xuất glycosid toàn phần từ lá cỏ ngọt. 2. Phân lập đƣợc steviosid và rebaudiosid A từ glycosid toàn phần. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về cây cỏ ngọt Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley. Tên khác: Cỏ ngọt, cúc ngọt, cỏ mật. Họ: Cúc (Asteraceae) [1], [4], [11]. 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cỏ ngọt là một loại cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6 m, có khi đến 1 m. Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7 cm, rộng 11,5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn thân. Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ [11]. 1.1.2 Phân bố, sinh thái Cỏ ngọt có nguồn gốc từ Brazin và Paraguay. Ngày nay, nó được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á như: Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Indonesia, Đài Loan, Thái Lan, Malaysia... [11], [16], [17]. Từ 1988, đã di thực vào Việt Nam và được trồng phổ biến tại nhiều vùng khác nhau hiện nay như: Cao Bằng, Lâm Đồng, Hà Giang, Hà Tây, Thái Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên,… Cây cỏ ngọt tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam [4], [11]. Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kì cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng, phát triển tốt vào vụ xuân – hè. Về mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi bị tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm [11]. 1.1.3 Thành phần hóa học Lá cỏ ngọt chứa: - Các ent – kauren diterpen glycosid hay còn được gọi là các steviol glycosid, gồm: steviosid, rebaudiosid A, B, C, D, E, F, dulcosid, steviobiosid. Chúng là 3 nguồn gốc tạo nên vị ngọt của cỏ ngọt và chiếm khoảng 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô [11], [25], [33]. - Các labdan diterpen gồm jhanol, austroinulin, 6 – 0 – Acetylaustroinulin. - Các triterpen gồm β – amyrin acetat, lupeol. - Các thành phần khác gồm β – sitosterol, stigmasterol, tanin và tinh dầu (0,12 – 0,43%). Các thành phần chính (43%) trong tinh dầu là caryophylen oxyd và spathulenol [11]. 1.1.4 Công dụng Trong y học cỏ ngọt và chiết xuất của nó được dùng cho bệnh nhân bị bệnh đái tháo đường, béo phì, cao huyết áp,... Ngày nay, người ta nó còn dùng để bao bọc các thuốc đắng. Ở Việt Nam, cỏ ngọt được dùng đơn độc dưới dạng trà hay kết hợp với các loại thảo mộc khác trong các thang thuốc y học cổ truyền [8]. Trong công nghiệp nó được dùng để làm tăng độ ngọt của các loại thực phẩm hay đồ uống. Ở Nhật mỗi năm tiêu thụ đến 700 tấn cỏ ngọt và chưa thấy có phản ứng độc hại nào [1]. Cỏ ngọt còn được dùng trong công nghệ chế biến mỹ phẩm như các loại sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da, vừa có tác dụng nuôi dưỡng tất cả các mô và giúp cơ thể tái tạo làn da mới trên toàn bộ bề mặt da, vừa chống nhiễm khuẩn lại trừ được nấm [1]. 1.2 Các loại đƣờng steviol glycosid 1.2.1 Công thức hóa học và tính chất Các steviol glycosid chiếm khoảng 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô và có bộ khung cấu trúc (steviol là aglycon chung) được trình bày ở hình 1.1 [21], [25], [33]. Cho đến nay đã có 9 steviol glycosid được phân lập từ lá cỏ ngọt được tổng kết ở bảng 1.1 [1], [15], [21], [25], [28], [33]. 4 Hình 1.1. Bộ khung của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt. Bảng 1.1. Cấu trúc của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt. STT Tên R1 R2 1 Steviol H H 2 Steviolbiosid H 3 Steviosid -Glc -Glc- -Glc (2 1) 4 Rebaudiosid A -Glc -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 5 Rebaudiosid B H -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 6 Rebaudiosid C -Glc (Dulcosid B) 7 Rebaudiosid D -Glc- -Rha (2 1) -Glc (3 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 8 Rebaudiosid E -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) 9 Rebaudiosid F -Glc -Glc- -Xyl (2 1) -Glc (3 1) 10 Dulcosid A -Glc -Glc- -Rha (2 1) 5 Các thành phần này có hàm lượng, độ ngọt ở các mức độ khác nhau. Bốn steviol glycosid có hàm lượng cao nhất, được đề cập đến nhiều nhất trong các tài liệu tham khảo là: steviosid (5-10%), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C (1-2%), dulcosid A (0,5-1%) [15]. Chúng ngọt hơn nhiều so với saccharose, trong đó: steviosid ngọt hơn 110 đến 270 lần, rebaudiosid A ngọt hơn 150 đến 320 lần, rebaudiosid C ngọt hơn 40 đến 60 lần, dulcosid A ngọt hơn 30 lần [12]. Trong số này, chỉ có steviosid và rebaudiosid A đã được xác định rõ các đặc tính vật lý và cảm quan. Steviosid và rebaudiosid A đã được thử nghiệm độ ổn định trong các đồ uống có ga và cả hai chất được xác định là bền với nhiệt và pH [12]. Đây cũng chính là 2 thành phần chịu trách nhiệm cho vị ngọt của lá Stevia [12], [15], [23].  Steviosid Công thức cấu tạo: Hình 1.2. Công thức cấu tạo của steviosid Tên khoa học: (13-[(2-0- -D-glucopyranosyl- -D-glucopyranosyl) oxy] kaur16-en-18-oic acid, -D-glucopyranosyl ester. Công thức phân tử: C38H60O18. Trọng lượng phân tử: 804,88 [15], [21]. 6 Tính chất: Steviosid là bột vô định hình màu trắng [21]. Độ tan: 1g steviosid tan trong 800 ml nước, tan trong dioxan, hơi tan trong alcol [11]. Nhiệt độ nóng chảy: 202-204  [28]. Rebaudiosid A Công thức cấu tạo: Hình 1.3. Công thức cấu tạo của rebaudiosid A Tên khoa học: (13-[(2-O- -D-glucopyranosyl-3-O- -D-glucopyranosyl- -Dglucopyranosyl) oxy] kaur-16-en-18-oic acid, -D-glucopyranosyl ester. Công thức phân tử: C44H70O23. Trọng lượng phân tử: 967,03. Tính chất: Rebaudiosid A là bột vô định hình, màu trắng [21]. Nhiệt độ nóng chảy: 235 [28]. 1.2.2 Tác dụng dƣợc lý  Tác dụng hạ đường huyết Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng các steviol glycosid có khả năng kích thích các tế bào tiểu đảo tụy cô lập tiết insulin, làm tăng số lượng các gen chủ chốt kiểm soát sự tiết insulin và có tác động đến sự giải phóng và truyền tín hiệu insulin [15], [20]. 7 Một số nghiên cứu trên thỏ gây tăng đường huyết do aloxan, chuột mắc bệnh tiểu đường cũng chỉ ra rằng cao nước lá cỏ ngọt hay steviol glycosid (steviosid và rebaudiosid A) có tác dụng làm giảm đường huyết [6], [11], [32].  Tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp Một số nghiên cứu invitro cho thấy steviosid và trích xuất Stevia gây giãn mạch hay ức chế sự co mạch gây ra bởi vasopressin với sự có mặt của calcium [11], [20], [32]. Nghiên cứu steviosid trên chuột đực trưởng thành với liều 25mg/kg/ngày so với lô chứng sử dụng glucose 16,7 mg/kg/ngày đường uống trong 6 tuần thấy tác dụng hạ huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương có ý nghĩa và không có dấu hiệu tăng về trọng lượng cơ thể [20]. Một số thử nghiệm lâm sàng:  Sau 3 tháng sử dụng steviosid (3 lần/ngày với liều 250 mg) trên những người bị cao huyết áp từ nhẹ đến trung bình thấy cả huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương đều giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng [15].  Kết quả tương tự cũng thu được khi sử dụng steviosid trong vòng 2 năm (với liều 500 mg, 3 lần/ngày) [20], [23], [32].  Tác dụng trên chức năng thận Một số nghiên cứu cho thấy cả steviol và steviosid đều có ảnh hưởng tới sự vận chuyển các anion ở ống thận [20]. Các nghiên cứu trên chuột cao huyết áp và bình thường, steviosid đều làm tăng cả 2 thông số lưu lượng huyết tương qua thận và tốc độ lọc cầu thận [11], [23], [32].  Tác dụng khác Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong trường hợp bị nhiễm khuẩn, steviosid có khả năng ngăn chặn tác động không mông muốn của phản ứng viêm và có thể thúc đẩy hoạt động của bạch cầu đơn nhân [33]. 8 Xi et al. (1998) đã báo cáo rằng các thành phần của lá Stevia có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ bằng ức chế 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl, oxid nitric, tham gia nhặt rác anion superoxid và hydrogen peroxid. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ Stevia có tác dụng ức chế các tác nhân gây bệnh liên quan đến thực phẩm như: S. marcescens, K. pneumoniae, B. cereus, P. aeruginosa, B. subtilis, Alcaligenes denitrificans và Salmonella typhimurium. Hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất từ Stevia là thấp hơn so với ciproflaxcin. Tuy nhiên, đối với nấm, tác dụng này cao hơn đáng kể so với amphotericin B [32]. Ngoài ra một số nghiên còn cho rằng các steviol glycosid có tác dụng chống ung thư [23].  Đánh giá mức độ an toàn Một số đánh giá an toàn của một số chất chiết xuất từ Stevia đã được thực hiện để xác minh mức độ độc tính, đột biến, gây ung thư và các vấn đề liên quan đến khả năng sinh sản. Tất cả các kết quả đều là âm tính. Những kết quả này xác nhận steviosid và các glycosid khác trong Stevia là an toàn cho con người và không có bất kỳ nguy hiểm nào tới sức khỏe khi sử dụng kéo dài [14], [15], [16]. 1.3 Một số nghiên cứu về chiết xuất steviol glycosid từ cỏ ngọt Chiết xuất các steviol glycosid từ lá Stevia là một lĩnh vực nghiên cứu hoạt động từ đầu những năm 1970. Persinos (1973) đã sản xuất steviosid từ cây Stevia bằng cách trộn lẫn bột dược liệu với canxi carbonat rồi chiết với nước. Dịch chiết được khử ion bằng cách cho qua hai cột sắc ký (Amberlite IR -120 và Duolite A4). Dịch rửa giải được cô đặc và kết tinh trong methanol để có được tinh thể steviosid [32]. Kumar (1986) đề xuất quy trình chiết xuất steviosid như sau: dịch chiết nước cỏ ngọt được loại một số tạp như: kim loại, protein hoặc tạp màu bằng axid citric và được tiếp tục loại bỏ protein, bột màu… bằng canxi oxyd hoặc hydroxyd. Tiếp tục trung hoà bởi acid citric, rồi cô đến siro. Sau đó nghiền siro với n- butanol. Thu lấy 9 dịch n-butanol, rồi để kết tinh thu được tinh thể steviosid. Hiệu suất quá trình là 7,5% [29]. Giovanetto (1988) được coi là người đặt nền tảng cho nhiều nghiên cứu về sau trong việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp trong dịch chiết nước cỏ ngọt. Quy trình gồm các bước như sau: chiết xuất với nước, loại tạp bằng nước vôi trong, rồi được cho qua 2 nền nhựa: cation acid mạnh Dowex 50W và anion base yếu Dowex WGR. Dịch rửa giải được sấy khô thu được cắn glycosid thô với độ tinh khiết khoảng 75%. Phương pháp này khá đơn giản, tuy nhiên sản phẩm có độ tinh khiết không cao và không phân lập được các steviol glycosid riêng biệt [24]. Payzant (1999) phát triển phương pháp của Giovanetto, dịch nước thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi ion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7 và được rửa giải bằng methanol. Dịch methanol chứa trên 95% steviol glycosid của dung dịch thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi ion. Cắn khô thu được sau đó được hồi lưu rồi kết tinh trong methanol, thu được steviosid. Dịch lọc để kết tinh tiếp thu được rebaudiosid A. Kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được rebaudiosid A tinh khiết đến 95%. Nghiên cứu đã phân lập được steviosid và rebaudiosid A từ hỗn hợp glycosid, tuy nhiên nhược điểm là thời gian tạo glycosid toàn phần quá dài [30]. Abelyan et al. (2006) để ra phương pháp để trích xuất steviosid và rebaudiosid A từ lá cây cỏ ngọt như sau: dược liệu chiết xuất với nước được tăng cường bằng enzyme pectinase. Dịch chiết ngoài được loại tạp bằng canxi hydroxyd, acid phosphoric, còn được trộn với beta cyclodextrin và bentonit để loại tạp. Dịch lọc được cô đến siro, thêm ethanol vào, kết tủa tách ra chứa 84% rebaudiosid A. Dịch lọc còn lại được cho qua nền nhựa trao đổi ion, bay hơi cồn thu được bột chứa steviosid khoảng 93% [12]. Một phương pháp để đạt được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao đã được đề xuất như sau: dịch chiết nước cỏ ngọt sau khi được loại tạp bằng canxi hydroxyd sẽ được trung hòa bằng dung dịch sắt (III) clorua. Dịch lọc được tiếp tục cho qua Celite và nền nhựa Amberlite. Sau đó dịch rửa giải được phun khô, bột 10 chứa khoảng 65% steviosid và 25% rebaudiosid A. Bột được tái kết tinh trong methanol thu được 90% steviosid. Dịch lọc còn lại được kết tinh tiếp trong ethanol thu được bột chứa khoảng 90% rebaudiosid A [32]. Liu et al. (2012) đề xuất phương pháp tách bằng sắc ký giữa hai glycosid steviosid và rebaudiosid A. Từ hỗn hợp 41% steviosid và 35,8% rebaudiosid A sau khi hòa tan trong ethanol được nạp trên cột sắc ký có thành phần chủ yếu là polymethacrylat/DVB nhựa polymer đồng chức năng dưới áp lực cao. Cột được tách rửa dưới áp lực trung bình với hỗn hợp methanol-aceton. Phần phân đoạn của steviosid và rebaudiosid A được thu riêng và để kết tinh. Các tinh thể được lọc ra chứa riêng từng thành phần với độ tinh khiết là 98 % [32]. Ngoài ra, một số phương pháp chiết xuất và tinh chế khác cũng được sử dụng để chiết xuất các steviol glycosid từ cỏ ngọt như: phương pháp siêu âm, sử dụng lò vi sóng, sử dụng CO2 siêu tới hạn, hay sử dụng các màng lọc nano hay siêu vi lọc [13], [19]. Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều tác giả nghiên cứu phương pháp chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt thu hái trong nước như: Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Đức Thắng (1996) đưa ra 2 quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt với nước và methanol. Quy trình chiết nước được mô tả như sau: Bột dược liệu được tận trích với nước ở 80°C, dịch lọc được cô đặc, rồi tận trích với n-butanol. Cô dung môi thu được cắn. Hòa tan cắn trong methanol nóng. Kết tinh nhiều lần cho steviosid dưới dạng tinh thể [8]. Bùi Thị Song Sơn (1996) chiết xuất steviosid sử dụng dung môi chiết là methanol, loại tạp bằng cloroform, trích ly với n-butanol rồi kết tinh trong methanol [4]. Võ Thị Thừa (2010) đưa ra quy trình sản xuất đường từ cỏ ngọt như sau: Bột dược liệu hồi lưu 4 lần với ethanol. Dịch chiết được cô tới cắn. Hòa tan cắn bằng nước nóng, lọc. Sau đó, loại bỏ mỡ bằng ether dầu rồi cô đặc. Chiết steviosid bằng n-butanol bão hòa nước. Dịch n-butanol được rửa bằng nước bão hòa n-butanol. Cất thu hồi n-butanol và cô đặc được rắn steviosid thô. Kết tinh lại trong methanol [10]. 11 Lê Thị Thọ (2011) chiết xuất steviosid theo các bước: Chiết lá cỏ ngọt bằng nước nóng (65ºC/ 4 giờ, tỷ lệ dung môi/dược liệu (w/v) = 1/35). Loại tạp chất bằng Ca(OH)2. Tách glycosid bằng cột Diaion HP-20. Rửa giải bằng hệ dung môi ethanol-H2O (v/v) 75/25. Cắn được kết tinh 2 lần trong methanol [9]. Tuy nhiên, kết quả của một số nghiên cứu trong nước chỉ mang tính nguyên tắc, thông số quy trình không được công bố cụ thể hay sử dụng dung môi độc hại. Đặc biệt, chưa có công trình nào phân lập được rebaudiosid A – steviol glycosid có ưu điểm nổi bật nhất trong cây cỏ ngọt. Từ nhu cầu cấp thiết sử dụng đường cỏ ngọt trong cuộc sống, cũng như tầm quan trọng của rebaudiosid A, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm đưa ra được quy trình chiết xuất glycosid đơn giản, hiệu quả từ lá cỏ ngọt và đồng thời đưa ra được phương pháp phân lập 2 đường glycosid quan trọng trong cỏ ngọt là steviosid và rebaudiosid A. 12 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Nguyên liệu, thiết bị 1.1.1. Nguyên liệu - Nguồn gốc: Cỏ ngọt được trồng tại xã Hải Phong, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định và thu hái vào tháng 12 năm 2013. - Mô tả nguyên liệu: Lá hình trái xoan hẹp, màu xanh lục vàng, dài từ 2,5 cm đến 4,0 cm, rộng 1,0 cm đến 1,8 cm. Hai mặt đều có lông mịn, mép lá khía răng cưa. Mặt trên lá có 3 gân nổi rõ cùng xuất phát từ cuống lá; gân phụ phân nhánh. Vị rất ngọt. Đặc điểm hình thái nguyên liệu phù hợp với mô tả trong Dược Điển Việt Nam IV [11]. - Xử lí dược liệu: Dược liệu được sấy ở 50 trong 3 giờ và được xay nhỏ rồi bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng. - Hàm ẩm nguyên liệu xác định được là 7,2 %. 1.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 1.1.2.1. Hóa chất TT Tên hóa chất Tiêu chuẩn, nguồn gốc 1 Vôi bột Việt Nam 2 Acid citric Việt Nam 3 Acid phosphoric Trung Quốc 4 Acid acetic Trung Quốc 5 Ethanol 96% Việt Nam 6 Methanol Trung Quốc 7 n-Buthanol Trung Quốc 8 Natri sulfat khan Trung Quốc 9 10 Nhựa cationit (Purolite, C100E) Nhựa anionit (Trilite) England Korea