Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước tiên tôi xin gửi đến Ban giám hiệu_Trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua. Lời cảm ơn sâu sắc xin được giành cho cô Th.S Nguyễn Thị Mỹ Trang_Bộ môn Đảm bảo Chất lượng và An toàn Thực phẩm và Th.S Đặng Xuân Cường_ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đồ án này. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm, các cán bộ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua. Xin giành lòng biết ơn đến cha mẹ đã tạo điều kiện cho tôi được học tập trong suốt thời gian qua. Xin cảm ơn bạn bè đã chia sẽ cùng tôi những khó khăn trong quá trình học tập tại trường. Nha Trang, ngày tháng năm 2012 Người thực hiện Nguyễn Thị Minh Trang ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN----------------------------------------------------------------------------------i MỤC LỤC--------------------------------------------------------------------------------------ii DANH MỤC BẢNG-------------------------------------------------------------------------iv DANH MỤC HÌNH--------------------------------------------------------------------------vi LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. --1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................ --3 1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) ................................................................. --4 1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô..................................................................... --4 1.1.2. Đặc tính trồng trọt................................................................................... --5 1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới .............................................. --5 1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng.................................... --8 1.2.1. Đặc tính của chlorophyll ......................................................................... --8 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll............................................................... --8 1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll...................................... --9 1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll.......................................... -----11 1.2.5. Tác dụng của chlorophyll........................................................ -------------13 1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường: ................................... --14 1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới.................. --16 1.3.1. Trong nước ........................................................................................... --16 1.3.2. Trên thế giới ......................................................................................... --16 1.4. Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm ...... --22 1.4.1. Các phương pháp chiết tách chlorophyll ............................................... --23 1.4.2. Các phương pháp xác định chlorophyll ................................................. --26 1.5. Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken .............................................. --28 1.5.1. Cơ sở lý thuyết...................................................................................... --28 1.5.2. Các bước tiến hành ............................................................................... --30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU-----------------32 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................. --33 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... --33 2.2.1. Phương pháp định lượng....................................................................... --33 2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa .................................... --34 2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... --34 2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. --35 2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa--------------------------------------------------------41 2.3. Dụng cụ và hóa chất-------------------------------------------------------------------42 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... --43 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll............................................................................................... --44 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll ........................................................................................ --46 iii 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll ................................................................................. --48 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau chlorophyll ............................................................................ --50 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll ..................................................................................................... --53 3.6. Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa.................... --55 3.7. Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp------------61 3.8. Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp--63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ --64 iv DANH MỤC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG 1 Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế 6 giới (1961-2007) 2 Bảng 1.2. Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007) 7 3 Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử 10 chlorophyll. 4 Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực 41 5 Bảng 2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực 41 sử dụng mô hình Box-Behnken 6 Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55 7 Bảng 3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và 56 F của các yếu tố 8 Bảng 3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của hai hàm mục tiêu 56 v DANH MỤC HÌNH STT 1 TÊN HÌNH Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển (mg chl m ). Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll. 10 Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường 15 Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu 17 3 chlorophyll. Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 35 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi 36 5 6 chiết Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung 7 8 8 -3 2 4 TRANG 37 môi chiết Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/ 38 nguyên liệu 9 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết 39 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiết độ chiết 40 Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng 44 10 11 chlorophyll Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính 12 chống oxy hóa của chlorophyll Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm 13 46 lượng chlorophyll Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt 14 44 46 vi tính chống oxy hóa chlorophyll Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu đến 15 hàm lượng chlorophyll Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến 16 53 chlorophyll Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính 20 51 chống oxy hóa của chlorophyll Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng 19 50 chlorophyll Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính 18 49 hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng 17 48 54 chống oxy hóa của chlorophyll 21 Hình 3.11. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y1 57 22 Hình 3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2 58 Hình 3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố 58 23 lên hàm mục tiêu Y1 Hình 3.13b. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố 24 lên hàm mục tiêu Y2 Hình 3.14. Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục 25 26 27 28 58 59 tiêu Y1 và Y2 Hình 3.15. Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61 Hình 3.16. Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết 63 Hình 3.17. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau 63 mỗi lần chiết 1 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay sự biến đổi khí hậu và môi trường toàn cầu đang ở mức đáng báo động cao. Con người luôn có thể phải tiếp xúc với phóng xạ, các bức xạ năng lượng cao, ngộ độc, nhiễm độc thức ăn, nấm mốc, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc diệt cỏ (dioxin), tia tử ngoại, khói thuốc lá (mỗi hơi thuốc lá sản sinh khoảng 114 gốc tự do), stress, dư thừa chất béo…. Chính các yếu tố trên đã làm tăng nhanh quá trình lão hóa và mắc bệnh cho con người, như ung thư, Alzehmer,…. Chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và khoa học gia từng đoạt giải Nobel, Bác Sĩ Hans Frischer, đã khám phá ra cấu trúc của hồng huyết cầu rất giống như cấu trúc của Chlorophyll. Trong cơ thể con người, hồng huyết cầu có nhiệm vụ chuyển tải dưỡng khí cho cơ thể với chất sắt (Fe) là nhân tố của hồng huyết cầu trong khi magnesium (Mg) là nhân tố của Chlorophyll. Chính điều này giúp cơ thể chúng ta biến đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu làm gia tăng chỉ số hồng huyết cầu trong cơ thể, bổ gan, hoá giải các độc tố và tiêu trừ các chất độc trong máu. Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất chống oxy hoá của cơ thể, có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá (khả năng: quét các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion, khử sắt, tạo phức chelat với các iôn hóa trị, oxy hóa lipid), ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương… Cây bắp là một trong năm loại cây lương thực chủ đạo trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Năm 2009 chỉ tính riêng huyện Khánh Vĩnh, trong tổng số 2.680 ha cây lương thực, diện tích trồng bắp trên địa bàn huyện đạt hơn 1.500 ha với năng suất 32 – 35 tạ/ ha. Ở nước ta cây bắp chủ yếu được trồng để lấy hạt, còn thân cây, lá cây, vỏ bắp và lụa bắp chủ yếu được làm thức ăn gia súc hoặc tồn tại ở dạng phế liệu nông nghiệp gây ô nhiễm môi trường. Từ lá bắp, vỏ bắp,…thu nhận chlorophyll, sau vẫn có thể sử dụng phần còn lại để sản xuất nhiên liệu sinh học từ bã chiết. Do vậy, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang phân công nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy 2 hóa từ lá bắp”, với mục đích tận dụng lá bắp để thu nhận chlorophyll dùng trong thực phẩm. Nội dung đề tài: 1) Xác định một số thông số cho quá trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp: loại và nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian và nhiệt độ chiết; 2) Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp; 3) Sơ bộ đánh giá hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp; Do thời gian nghiên cứu có hạn và lần đầu làm quen với nghiên cứu chlorophyll. Do vậy đồ án này chắc hẳn sẽ còn có những hạn chế. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thấy cô và bạn bè để nghiên cứu này thêm hoàn thiện. Xin chân thành cảm ơn. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) Ngô, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L. ssp. mays) là loại cây lương thực thuần canh bắt nguồn ở Trung Mỹ, sau đó được trồng phổ biến ở châu Mỹ. Cuối thế kỷ 15 đầu thế kỷ 16, khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ, bắp đã được trồng phổ biến trên toàn thế giới. 1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô [39] Một vài giống ngô có thể cao tới 7m, còn chiều cao các giống ngô thương phẩm chỉ khoảng 2,5m và ngô ngọt (Zea mays var. rugosa hay Zea mays var. saccharata) thường thấp hơn. Cây ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50 – 100cm, rộng 5 - 10cm; thân thẳng, thường cao 2–3 m, nhiều mấu, với các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Bắp ngô ôm sát thân cây và nằm dưới lá. Khi còn non chúng dài ra khoảng 3cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ. Thân cây ngô có đốt với các khớp (mấu hay mắt), các khớp cách nhau khoảng 20 – 30cm, trông tương tự thân cây tre. Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một số lớp lá, và bao chặt vào thân. Chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô màu vàng hung từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đuôi sóc hình chùy chứa các hoa đực, được gọi là cờ ngô. Mỗi râu ngô đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô trên bắp. Các bắp ngô non có thể dùng làm rau ăn với toàn bộ lõi và râu, nhưng khi bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngô trở nên cứng và râu thì khô đi nên không ăn được. Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thường ở họ Hòa thảo (Poaceae), gần giống loại quả phức về cấu trúc, ngoại trừ là các hạt riêng biệt không bao giờ hợp nhất thành một khối. Hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối đều xung quanh một 5 lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25cm, có khoảng 200 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng, khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì. Tuy nhiên, chúng không có gluten như lúa mì nên có độ trương nở nhỏ hơn khi sử dụng cho các thức ăn dạng nướng [39]. 1.1.2. Đặc tính trồng trọt [39] Ngô cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trong môi trường phù hợp với nhiệt độ lớn hơn 10°C (50°F) và biên độ ảnh hưởng này được quyết định theo di truyền và được điều chỉnh bởi hệ thống sắc tố thực vật. Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị sai lệch đối với các giống cây trồng ở khu vực nhiệt đới (thời gian ban ngày kéo dài làm cho cây phát triển rất cao và không đủ thời gian ra hoa, tạo hạt trước khi bị chết vì sương giá). Tuy nhiên, đặc tính này hữu ích khi sử dụng ngô làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học Do ngô chịu lạnh kém nên ở khu vực ôn đới, ngô thường được trồng vào mùa xuân. Hệ thống rễ nông, nên phụ thuộc nhiều vào độ ẩm của đất. Là một loại thực vật C4 (thực vật có cơ chế quang hợp C4), nên chúng sử dụng nước hiệu quả hơn so với thực vật C3 như (cỏ linh lăng hay đậu tương). Chúng nhạy cảm nhất với khô hạn khi trổ bắp, lúc hoa (râu) ngô đã sẵn sàng cho việc thụ phấn. Tại Hoa Kỳ, vụ thu hoạch bội thu theo truyền thống được dự đoán là khi ngô "cao ngang đầu gối vào ngày 4 tháng 7", mặc dù các giống lai ghép hiện nay nói chung đều vượt quá tỷ lệ phát triển này. Ngô sử dụng để làm cỏ ủ chua được thu hoạch khi cây còn non và bắp chưa già. Ngô ngọt được thu hoạch khi hạt ở "giai đoạn sữa", sau khi thụ phấn nhưng trước khi hình thành tinh bột, ở Mỹ là vào khoảng cuối mùa hè, đầu đến giữa mùa thu [39]. 1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới [38]  Trên thế giới Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (riêng tại Hoa Kỳ, sản lượng là khoảng 270 triệu tấn/ năm). Các giống ngô lai được ưa chuộng hơn so với các giống ngô thông thường, do năng suất cao. 6 Ngành sản xuất ngô trên thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỉ 20 đến nay, nhất là trong hơn 40 năm gần đây, ngô là cây trồng có tốc độ tăng trưởng về năng suất là cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu. Năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ chưa đến 20 tạ/ha, năm 2004 đã đạt 49,9 tạ/ha. Năm 2007, theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), diện tích ngô đã vượt qua lúa nước với 157 triệu ha, năng suất 4.9 tấn/ha và sản lượng đạt kỉ lục với 766,2 triệu tấn. Kết quả trên có được trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi lý thuyết ưu thế lai trong chọn tạo giống, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác. Đặc biệt, từ 10 năm nay, cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống lai nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với công nghệ sinh học thì việc ứng dụng công nghệ cao trong canh tác ngô đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên trên lúa mì và lúa nước. Với 52% diện tích trồng bằng giống được tạo ra bằng công nghệ sinh học, năng suất ngô nước Mỹ năm 2005 đạt hơn 10 tấn/ha trên diện tích 30 triệu hecta. Năm 2007, diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới đã đạt 35,2 triệu ha, riêng ở Mỹ đã lên đến 27,4 triệu ha, chiếm 73% trong tổng số hơn 37,5 triệu ha ngô của nước này [38]. Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới (1961-2007) Năm 1961 2004-2005 2005-2006 2006-2007 2007-2008 Diện tích (1000 ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (1000 tấn) 104,8 145,0 145,6 148,6 157,0 2,0 4,9 4,8 4,7 4,9 204,2 714,8 696,3 704,2 766,2  Trong nước Năng suất ngô của Việt Nam những năm 1960 chỉ đạt trên 1 tấn/ha, với diện tích hơn 200 ngàn hecta. Đến đầu những năm 1980, năng suất cũng chỉ đạt 1,1 tấn/ha và sản lượng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô địa phương với kĩ 7 thuật canh tác lạc hậu. Từ những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm cải tạo Ngô và Lúa mì Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở nước ta, góp phần nâng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990. Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô ở nước ta thật sự có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống ngô lai ra sản xuất, đồng thời cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác theo đòi hỏi của giống mới. Năm 1991, diện tích trồng ngô lai chưa đến 1% trên hơn 400.000 hecta trồng ngô. Năm 2007, giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta. Năng suất ngô nước ta tăng nhanh liên tục với tốc độ cao hơn trung bình thế giới trong suốt hơn 20 năm qua. Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung bình thế giới (11/32 tạ/ha), năm 1990 bằng 42% (15,5/37 tạ/ha), năm 2000 bằng 60% (25/42 tạ/ha), năm 2005 đạt 73% (36/49 tạ/ha) và năm 2007 đã đạt 81% (39,6/49 tạ/ha). Năm 1994, sản lượng ngô của Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn, năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007, chúng ta đạt diện tích, năng suất và sản lượng cao nhất từ trước tới nay. Diện tích là 1.072.800 ha, năng suất là 39,6 tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn là 4.250.900 tấn [38]. Bảng 1.2. Sản xuất ngô của Việt Nam (1961-2007) Năm 1961 1975 1990 1994 2000 2005 2007 229,20 267,00 432,00 534,60 730,20 1052,6 1072,8 260,10 280,60 671,00 1143,9 200,.9 3787,1 4250,9 15,5 21,4 25,1 36,0 39,6 Diện tích (1000 ha) Sản lượng (1000 tấn) Năng suất 11,4 (tạ/ha) 10,5 8 1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng 1.2.1. Đặc tính của chlorophyll Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll) là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam. Lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc vào lượng sinh khối [25]. Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng. Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng. Do đó, màu các mô chứa chlorophyll có màu xanh lá cây [30]. Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển (mg chl m-3) 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll Chlorophyll được phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre Joseph Pelletier vào năm 1817 [6]. Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời. Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt 9 trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ được năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể. Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940 và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn. 1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll  Cấu trúc chlorophyll Cấu trúc chung của chlorophyll được làm sáng tỏ bởi Hans Fischer vào năm 1940. Năm 1960, hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến, Robert Burns Woodward đã xuất bản một tổng hợp tổng số về phân tử. Năm 1967, việc giải thích lập thể còn lại cuối cùng đã được hoàn thành bởi Ian Fleming [9]. Chlorophyll f được công bố tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả năng hình thành stromatolites, năm 2010 [5]. Chlorophyll có công thức phân tử là C55H70O6N4Mg và cấu trúc 2-formyl-chlorophyll đã được phân tích dựa trên NMR, quang học và phổ khối [24]. Chlorophyll có nhân porphyrin. Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol liên kết nhau qua cầu nối ethyl tạo thành vòng kín với tâm là Mg. Bên cạnh đó còn có vòng phụ thứ 5. Nhân porphyrin có 2 gốc rượu methanol (CH3OH) và fythol (C20H39OH) nối nhau tại vị trí C10 và C7, và 10 nối đôi tạo cơ sở cho quá trình quang hóa. Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm -CH3, còn ở chlorophyll b là nhóm -CHO [33]. 10 Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau: Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll Diệp lục tố Diệp lục tố Diệp lục tố a Diệp lục tố b Diệp lục tố d c1 c2 Công thức C55H72O5N4 phân Mg tử C55H70O6N4 Mg C35H30O5N4 Mg C35H28O5N4 Mg C54H70O6N4 Mg Nhóm -CH=CH2 C3 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO Nhóm -CH3 C7 -CHO -CH3 -CH3 -CH3 Nhóm -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3 11 C8 Nhóm CH2CH2COO CH2CH2COO CH=CHCOO CH=CHCOO CH2CH2COO C17 -Phytyl -Phytyl H H -Phytyl Liên kết Đơn C17C18 Đơn Tần suất Vi khuẩn lam Đa số thực Các loại tảo Các loại tảo (cyanobacteri vật khác nhau khác nhau a) Phổ biến Kép Đơn Kép  Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll Ở thực vật, chlorophyll có thể được tổng hợp từ succinyl-CoA và glycine, mặc dù tiền chất trước đó để hình thành chlorophyll a và b là protochlorophyllide. Trong thực vật hạt kín, bước cuối cùng trong quá trình chuyển đổi protochlorophyllide thành chlorophyll, có sự phụ thuộc vào ánh sáng và thực vật có màu nhạt nếu được trồng trong bóng tối. Thực vật không mạch và các loại tảo xanh, có một enzyme bổ sung không phụ thuộc vào ánh sáng và phát triển màu xanh ngay cả trong bóng tối. Chlorophyll được gắn kết với protein và có thể chuyển năng lượng hấp thụ theo hướng yêu cầu [13]. 1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll Chlorophyll và các dẫn xuất của nó được biết đến là các chất có hoạt động chống oxy hóa. Việc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của nó như chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thư. Vì vậy, việc áp dụng một chế độ ăn uống giàu chlorophyll có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn sự khởi đầu của một số bệnh như ung thư, đó là các biểu hiện lão hóa được gây ra bởi các gốc tự do.Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng, các dẫn xuất của 12 chlorophyll, như chlorophyllin, đã cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là như vitamin C. Các chức năng của chlorophyll đối với động vật được biết đến là giúp ức chế quá trình peoroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi sự hư hại gây ra bởi các gốc tự do khác nhau và các loại phản ứng oxy hóa khác. Chlorophyllin cũng được báo cáo là giúp ngăn chặn các bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể [37]. Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được đánh giá. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng khả năng của mỗi hợp chất sau đây trong việc nhặt gốc tự do như 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6sulfonate) (ABTS +) . Hoạt động Antimutagenic đã được khảo nghiệm với một chủng vi khuẩn vi hình gây đột biến đảo ngược, bằng cách sử dụng vi khuẩn Salmonella typhimurium TA100 và benzo[a]pyrene như một chủng thử nghiệm và gây đột biến tương ứng. Các chất dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b. Hơn nữa, các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll như chlorins, pheophytins, và pyropheophytins cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim loại như Mg-chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytina, and Cu-chlorophyllins. Những kết quả này đã chứng minh rằng các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống ở cả hai loại thực phẩm tươi và thực phẩm chế biến, chế độ ăn uống bổ sung có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic [22]. Nghiên cứu về chlorophyll từ bột Spirulina (Spirulina sp.) đã được thực hiện để xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái và suy thoái động học của chlorophyll a và chiết xuất thô, cũng như điều tra sự khác biệt của hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll khi có chiếu xạ hoặc không có chiếu xạ. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được xác định bằng cách phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được tăng lên sau 60 phút chiếu xạ [28]. 13 Hoạt động của chất chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh hoặc trà có nguồn gốc polyphenol đã được nghiên cứu rộng rãi. Tuy nhiên, hoạt động của chất chống oxy hóa trong các phần không có polyphenolic của trà xanh thì ít được phân tích. Trong nghiên cứu này, họ đã phân tích hoạt động chống oxy hóa của các phần không chứa polyphenolic của phần trà xanh còn lại (Camellia sinensis) sau khi chiết xuất bằng nước nóng bằng việc sử dụng phương pháp clorua nhôm. Phần không chứa polyphenolic của trà xanh còn lại gây ra sự ức chế đáng kể đối với hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic theo cách phụ thuộc vào liều. Khi tập trung các phần không chứa polyphenolic được áp dụng cho tấm silicagel TLC và phát triển, sáu điểm màu đã được quan sát, chúng được cho là chlorophyll a và b, pheophytins a và b, carotenoid, như beta-carotene và lutein. Mặc dù tất cả các sắc tố đều biểu hiện hoạt động của các chất chống oxy hóa quan trọng, mức độ của hoạt động ức chế chống lại hydroperoxide của chlorophyll a> lutein> pheophytin a> chlorophyll b> beta-carotene > pheophytin b. Những kết quả này cho thấy rằng phần không chứa polyphenolic trong phần trà xanh còn lại, có hoạt tính ức chế mạnh chống lại hệ hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic, nó có nguồn gốc từ hoạt động chống oxy hóa của chlorophyll a và b, pheophytins a và b, beta-carotene và lutein. Phát hiện này cũng có nghĩa là sự kết hợp của các phần polyphenol tan trong nước với các sắc tố chống oxy hóa có trong phần không chứa polyphenolic của trà xanh, sẽ có hiệu quả hơn để ngăn chặn các bệnh mãn tính [14]. 1.2.5. Tác dụng của chlorophyll Chlorophyll được đăng kí như một phụ gia thực phẩm ( chất nhuộm màu) và số E của nó là E140. Các đầu bếp sử dụng chlorophyll để tạo màu sắc đa dạng cho thực phẩm và các loại đồ uống có màu xanh lá cây như mì ống và absinthe [2].. Chlorophyll không tan trong nước nên đầu tiên nó được trộn với một lượng nhỏ dầu thực vật để có được những giải pháp mong muốn. Chiết xuất chlorophyll lỏng được coi là không ổn định và luôn luôn biến đổi cho đến năm 1997, khi Frank S.& Lisa Sagliano sử dụng việc làm đông khô chlorophyll lỏng tại trường đại học tại Florida, ổn định nó ở dạng bột, bảo quản và để sử dụng trong tương lai. 14 Ngoài ra, chlorophyll còn có nhiều tác dụng trong y học [36] : - Giúp cải thiện tính năng tinh lọc máu tự nhiên của cơ thể. - Chống thiếu máu ,vi chất trong quá trình tạo hemoglobin. - Tăng số tế bào hồng cầu, làm các tế bào mạnh thêm. - Tăng lượng máu. - Tăng cường các phản ứng miễn dịch chủ yếu trong cơ thể. - Chống lại các chất độc tố/ Chống lại chất gây ung thư. - Giúp cơ thể thải loại các chất cặn bã. - Ngăn ngừa sự suy hô hấp. - Làm dịu thấp khớp. - Giúp phòng chống các bệnh tim mạch, các dấu hiệu sớm tuổi già. - Tăng cường chức năng thận và bàng quan. - Giảm giãn tĩnh mạch. - Tăng cường chức năng tiêu hoá. - Chống táo bón bằng việc tăng cường sự lưu thông của đường mật. - Cải thiện tình trang đái tháo đường. - Chống các bệnh về tuyến giáp. - Tăng cường chức năng gan và cải thiện vấn đề gan. - Giảm chóng mặt. - Chống mất ngủ. - Giảm thiếu máu não. 1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường:  Chlorophyll Fibersol Plus: Diệp lục trong sản phẩm Chlorophyll Fibersol Plus được lấy từ cỏ linh lăng. Trong tiếng Arab cỏ linh lăng nghĩa là "cha của thực phẩm", vì nó tốt cho sức khỏe, rễ