Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất chống oxy hóa từ củ tỏi phan rang (allium sativum l) theo cách tiếp cận công nghệ xanh và thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit trong cơ thịt cá nục xay

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA SAU ĐẠI HỌC -------- NGUYỄN THỊ YẾN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHẤT CHỐNG OXY HÓA TỪ CỦ TỎI PHAN RANG (Allium sativum L) THEO CÁCH TIẾP CẬN CÔNG NGHỆ XANH VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPIT TRONG CƠ THỊT CÁ NỤC XAY LUẬN VĂN THẠC SỸ KHÁNH HÒA - 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA SAU ĐẠI HỌC -------- NGUYỄN THỊ YẾN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHẤT CHỐNG OXY HÓA TỪ CỦ TỎI PHAN RANG (Allium sativum L) THEO CÁCH TIẾP CẬN CÔNG NGHỆ XANH VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPIT TRONG CƠ THỊT CÁ NỤC XAY LUẬN VĂN THẠC SỸ Ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540101 Quyết định giao đề tài: Số 369/QĐ-ĐHNT ngày 5/5/2016 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 26/04/2017 Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS. VŨ NGỌC BỘI Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Học viên Nguyễn Thị Yến Phượng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi đến Ban Giám hiệu - Trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, đã tận tâm hướng dẫn, động viên và truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức quý báu về khoa học, những kinh nghiệm thực tế cũng như những kỹ năng làm việc trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn thầy: PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm, các Thầy Cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ trong các phòng thí nghiệm: Công nghệ Sinh học, khu công Nghệ cao, Chế biến Thủy sản Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Xin ghi nhận tình cảm và sự giúp đỡ nhiệt tình của chị Trần Thị Loan, học viên cao học lớp CHCNTP-2014 và các bạn sinh viên trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên cỗ vũ tinh thần để tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt thời gian vừa qua. Khánh Hòa, ngày 26 tháng 04 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến Phượng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ I LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. II DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... VI DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... VII DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... VIII MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................4 1.1. Tổng quan về tỏi ......................................................................................................4 1.1.1. Tên gọi và lịch sử ..............................................................................................4 1.1.2. Phân loại và thành phần trong tỏi .....................................................................5 1.1.3. Hợp chất phenol và flavonoid ...........................................................................7 1.1.4. Tình hình nghiên cứu về Tỏi ở Việt Nam và trên thế giới...............................12 1.1.5. Cách tiếp cận công nghệ xanh ........................................................................13 1.1.6. Phương pháp tách chiết các hợp chất .............................................................24 1.2. Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa ..............................................................28 1.2.1. Quá trình oxy hóa.............................................................................................28 1.2.2. Chất chống oxy hóa ........................................................................................28 1.2.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến .29 1.3. Quá trình oxy hóa chất béo .....................................................................................32 1.3.1. Phân loại..........................................................................................................32 1.3.2. Ảnh hưởng của quá trình oxy hóa chất béo đến chất lượng thực phẩm .........33 1.4 . Các vấn đề oxy hóa chất béo trong thịt cá ............................................................33 1.4.1. Vấn đề oxy hóa chất béo thịt cá ......................................................................33 1.4.2. Hạn chế oxy hóa chất béo thịt cá ....................................................................35 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......37 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và phương pháp phân tích.............................................37 2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................37 2.1.2. Hóa chất ...........................................................................................................38 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................41 2.2.1. Phương pháp tiếp cận các nội dung của đề tài và sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ....................................................................................................................................41 iii 2.2.2. Phân tích thành phần hóa thực vật nhận diện các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa từ củ tỏi Phan Rang ......................................................................................43 2.2.3. Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi .......................................................................................................................43 2.2.4. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết ....................49 2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ củ tỏi ...............................................................................................................56 2.2.6. Ảnh hưởng của phương pháp làm khô đến hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết tỏi ........................................................................................................................57 2.2.7. Nghiên cứu thử nghiệm chống oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục xay ..........60 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................61 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................62 3.1. Thành phần hóa thực vật của củ tỏi phan rang .......................................................62 3.2. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi ..... 62 3.2.1. Đánh giá sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi dựa vào hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ...........................................................................................64 3.2.2. Đánh giá sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi dựa vào tổng năng lực khử theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman 65 3.2.3. Đánh giá sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi dựa vào hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2 theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ....................................67 3.2.4. Đánh giá sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi dựa vào hàm lượnghợp chất phenol tổng số theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ........................................................................................................70 3.2.5. Đánh giá sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi dựa vào hàm lượng flavonoid tổng số theo thiết kế thí nghiệm PlackettBurman.......................................................................................................................71 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi ........73 3.3.1. Ảnh hưởng của chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ............................73 3.3.2. Xác định nồng độ dung môi chiết Ethanol ....................................................78 3.3.3. Xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết .....................................................83 iv 3.3.4. Xác định nhiệt độ chiết ...................................................................................86 3.3.5. Xác định thời gian chiết ..................................................................................89 3.3.6. Xác định số lần chiết .......................................................................................92 3.3.7. Đề xuất qui trình chiết xuất ở điều kiện thích hợp để thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ củ tỏi ......................................................................................95 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ củ tỏi ...........................................................................................................................96 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp làm khô đến hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết củ tỏi .................................................................................................................................100 3.6. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục xay .................107 3.6.1. Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết từ củ tỏi đến sự biến đổi chỉ số peroxyde trong cơ thịt cá nục xay theo thời gian bảo quản lạnh .............................................107 3.6.2. Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết củ tỏi đến sự biến đổi chỉ số TBARS của các mẫu cá nục xay theo thời gian bảo quản lạnh ...................................................108 3.6.3. Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết từ củ tỏi đến sự biến đổi hàm lượng TVB-N trong cơ thịt cá nục xay theo thời gian bảo quản lạnh .............................................110 Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết từ củ tỏi đến sự biến đổi hàm lượng TVB-N trong cơ thịt cá nục xay theo thời gian bảo quản lạnh được trình bày ở hình 3.44. ..........110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................114 PHỤ LỤC ....................................................................................................................123 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHA : Butylhidroxitoluen BHT : Butylhidroxianizol DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl GAE : Gallic Acid Equivalent MAD : Malonaldehyde QE : Quercetin Equivalent SD : Standard Deviation SFE : Super Critical Fluid Extraction TCA : Acid Trichloracetic TPC : Total Phenolic Compounds ĐC : Đối chứng N9% : Nước cất 9% T3% : Dịch chiết tỏi 3% T6% : Dịch chiết tỏi 6% T9% : Dịch chiết tỏi 9% C9% : Vitamin C 400ppm 9% CKTH : Chân không thăng hoa ĐKTH : Điều kiện thích hợp Ngl/dm: Nguyên liệu/dung môi IC50 : Nồng độ của mẫu có thể ức chế 50% gốc tự do vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học của củ tỏi (Allium sativum) .................................................5 Bảng 1.2. Giá trị dinh dưỡng trong 100g tỏi tươi ..............................................................6 Bảng 1.3. Phân loại khoa học của cá nục thuôn ..............................................................34 Bảng 1.4 . Thành phần khối lượng (%) của cá nục thuôn................................................... 35 Bảng 1.5. Thành phần hóa học (%)của cá nục thuôn ......................................................35 Bảng 2.1. Các biến trong ma trận thí nghiệm sàng lọc theo thiết kế Plackett-Burman...44 Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hường đến chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi theo thiết kế Plackett-Burman..............................45 Bảng 2.3. Ma trận bố trí các thí nghiệm đầy đủ theo thiết kế Plackett-Burman .............46 Bảng 3.1. Thành phần hóa thực vật của củ tỏi Phan Rang ..............................................62 Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến chiết hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ..............................63 Bảng 3.3. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính khử gốc tự do bắt gốc DPPH của dịch chiết từ củ tỏi ........................................65 Bảng 3.4. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử của dịch chiết từ củ tỏi ...................67 Bảng 3.5. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa hóa lipid bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2 của dịch chiết từ củ tỏi ............................................................................................69 Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số của dịch chiết từ củ tỏi....................................71 Bảng 3.7. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng flavonoid tổng số của dịch chiết từ củ tỏi .......................................................73 Bảng 3.8. Khối lượng dịch củ tỏi sau làm khô (g) .......................................................100 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của một số hợp chất phenol trong tự nhiên ............................................8 Hình 1.2. Cấu trúc của hợp chất flavonoid trong tự nhiên ............................................11 Hình 1.3. Sơ đồ cơ bản đề xuất sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên .................................................................................................................14 Hình 1.4. Những thay đổi trong hệ thống phân cấp phòng chống lãng phí ..................15 Hình 1.5. Docetaxel thay thế paclitaxel .....................................................................17 Hình 1.6. (-) - alpha-Bisabolol ( trái ) và artemisinin ( bên phải ). .........................18 Hình 1.7. Công nghệ tách hoạt chất sinh học từ thực vật (Chemat và cộng sự, 2012) ........19 Hình 1.8. Phân tích vòng đời của quá trình khai thác các sản phẩm tự nhiên...............23 Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH .....................29 Hình 1.10. Sơ đồ ảnh hưởng của sự oxy hóa chất béo đến chất lượng thực phẩm. ......33 Hình 2.1. Củ tỏi Phan Rang được dùng trong nghiên cứu này......................................37 Hình 2.2. Cá nục thuôn (Decapterus macrosoma) dùng trong nghiên cứu này ............37 Hình 2.3. Sơ đồ tiếp cận tổng quát các nội dung đề tài .................................................41 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ..................................................................42 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích thành phần hóa thực vật nhận diện các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa từ củ tỏi Phan Rang ......................................43 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết các hợp chất chứa hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết củ tỏi theo phần mềm mã hóa các biến độc lập ...................................................................................47 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình chiết ..................................................................................................................49 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung môi chiết ............................50 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết ..............51 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết ..........................................52 Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết .........................................53 Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết ..............................................54 Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ củ tỏi ở ở điều kiện chiết thích hợp ..................................................................55 viii Hình 2.14. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết...................................................................56 Hình 2.15. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của phương pháp làm khô đến hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết tỏi ........................................................................58 Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipid trên thịt cá nục xay .....60 Hình 3.1. Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ củ tỏi .......................................................64 Hình 3.2. Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử của dịch chiết từ củ tỏi ................................66 Hình 3.3. Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa hóa lipid bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2 của dịch chiết từ củ tỏi ...................................................................................................68 Hình 3.4. Pareto ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số của dịch chiết từ củ tỏi ...................................................................................70 Hình 3.5. Pareto ảnh hưởng của các yếu tố chiết xuất đến hàm lượng flavonoid tổng số của dịch chiết từ củ tỏi ...............................................................................72 Hình 3.6. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của dịch chiết xuất từ củ tỏi với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (SA) và không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (KSA). Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) ...........................................................................................74 Hình 3.7. Hàm lượng hợp chất phenol tổng số (a), hàm lượng flavonoid tổng số (b) của dịch chiết xuất từ củ tỏi với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (SA) và không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (KSA). Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ...................................................................................75 Hình 3.8. Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) với hàm lượng hợp chất phenol có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết củ tỏi ..........................................................................................................................77 Hình 3.9. Mối tương quan giữa hàm lượng flavonoid với khả năng khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của dịch chiết từ củ tỏi ............................78 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) ............................................................................................79 ix Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi.Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ............................................................................................................80 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ........................................................................81 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ................................................................................82 Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). .................................................................................................................83 Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi.Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). .............84 Hình 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0.05). ............................................................................................85 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). .................................................................................................................85 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0.05). ...........................................................................................................87 Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi. ..........................................................................................................................87 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ............................................................................................88 Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ......................................................................................................89 x Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi.Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ...........................................................................................................90 Hình 3.23. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi.Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). .90 Hình 3.24. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ................................................................................91 Hình 3.25. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ......................................................................................................92 Hình 3.26. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi.Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ...........................................................................................................93 Hình 3.27. Ảnh hưởng của số lần chiết đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ..............93 Hình 3.28. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ............................................................................................94 Hình 3.29. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ......................................................................................................94 Hình 3.30. Qui trình chiết xuất ở điều kiện thích hợp thích hợp để thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ củ tỏi .....................................................................96 Hình 3.31. Ảnh hưởng của phương pháp bảo phương pháp bảo quản thường và phương pháp bảo phương pháp bảo quản lạnh đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi.Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ........................................................................98 Hình 3.32. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản thường và phương pháp bảo phương pháp bảo quản lạnh đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ....98 xi Hình 3.33. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản đông đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p <0,05). .........................................................................98 Hình 3.34. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản đông đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ..........................................................................................100 Hình 3.35. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp làm khô với dịch chiết ở điều kiện thích hợp đến khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). ....................102 Hình 3.36. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp làm khô với dịch chiết ở điều kiện thích hợp đến tổng năng lực khử trong dịch chiết củ tỏi. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)...............................102 Hình 3.37. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp làm khô với dịch chiết ở điều kiện thích hợp đến hàm lượng hợp chất phenol tổng số. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ........................................104 Hình 3.38. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp làm khô với dịch chiết ở điều kiện thích hợp đến hàm lượng flavonoid tổng số. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p <0,05). .................................................104 Hình 3.39. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp làm khô với dịch chiết ở điều kiện thích hợp đến hoạt tính chống oxy hóa hóa lipid bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). ..............................................................................105 Hình 3.40. Quy trình đề xuất làm khô dịch chiết tỏi ...................................................106 Hình 3.41. Sự biến đổi chỉ số peroxyde trong cơ thịt cá nục xay theo thời gian trong quá trình bảo quản lạnh. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). .........................................................................................107 Hình 3.42. Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết củ tỏi đến sự biến đổi chỉ số TBARS trong cơ thịt cá nục xay theo thời gian bảo quản lạnh. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ............................................109 Hình 3.43. Ảnh hưởng của bổ sung dịch chiết củ tỏi đến hàm lượng TVB-N của các mẫu cá Nục xay trong quá trình bảo quản lạnh. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). ....................................................110 xii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Củ tỏi (Allium sativum L.) chiếm một vị trí nổi bật trong số các loại thực phẩm của con người, không chỉ như một thứ gia vị, mà còn do tính chất chữa bệnh của nó, với sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiện nay, tỏi được trồng phổ biến trên 90 quốc gia ở Châu Á, Châu Mỹ, Châu Âu và Châu Đại Dương với tổng sản lượng hàng năm khoảng 17 triệu tấn và năng suất đạt từ 4,4 - 30,0 tấn/ha. Tại Việt Nam, tỏi được du nhập khá lâu và được trồng phổ biến trong cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở các vùng như: Hải Dương, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Lý Sơn-Quảng Ngãi và Phan Rang - Ninh Thuận. Trong thực phẩm, lipid là một trong những thành phần quan trọng và quá trình oxy hóa lipid là nguyên nhân chính dẫn đến quá trình hư hỏng làm giảm giá trị dinh dưỡng và chất lượng cảm quan của thực phẩm. Để ngăn ngừa hiện tượng oxy hóa lipid trong thực phẩm, nhiều giải pháp đã được áp dụng, trong đó sử dụng các chất chống oxy hóa từ tự nhiên được quan tâm nhiều nhất. Trong những năm gần đây, xu hướng thế giới quan tâm về phát triển bền vững: hoá học sạch, công nghệ xanh. Việc khai thác các sản phẩm tự nhiên theo hướng tiếp cận công nghệ xanh nhằm bảo vệ môi trường và sức khỏe người tiêu dùng. Chính vì vậy, đề tài này đã tiến hành:“Nghiên cứu chiết xuất chống oxy hoá từ củ tỏi Phan Rang (Allium sativum L.) theo cách tiếp cận công nghệ xanh và thử nghiệm khả năng chống oxy hoá lipit trong cơ thịt cá nục xay”. Mục tiêu của đề tài : (1) Thiết lập quy trình chiết xuất chất chống oxy hoá từ củ tỏi Phan Rang theo hướng tiếp cận của công nghệ xanh. (2) Đánh giá khả năng chống oxy hoá lipid trong cơ thịt cá nục của dịch chiết từ củ tỏi Phan Rang. Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết các hợp chất chứa hoạt tính chống oxy hóa trong củ tỏi Phan Rang theo thiết kế Plackett-Burman. Đem đánh giá hoạt tính khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử, hàm lượng hợp chất phenol tổng số, hàm lượng flavonoid tổng số và hàm lượng MDA bằng phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2. Phân tích nhận diện các nhóm hợp chất sinh học có trong củ tỏi. Xác định chỉ số TBARS, chỉ số peroxyde và hàm lượng TVB-N trong cơ thịt cá nục để đánh xiii giá khả năng chống oxy hóa lipid của dịch chiết. Áp dụng các phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả đảm bảo yêu cầu khách quan về độ chính xác cho phép với sự hỗ trợ của phần mềm thống kê R phiên bản Ri3863.3.3.0 với sự kiểm định TukeyHSD kiểm tra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa  = 0,05, phần mềm Design expert 10, Microsoft Excel 2007. Kết quả thu được: Các hợp chất trong củ tỏi Phan Rang được nhận diện chứa nhiều nhất là nhóm hợp chất phenol, flavonoid tiếp theo là nhóm hợp chất phytosterol, glycoside, tanin, saponin và alkaloid. Từ các kết quả nghiên cứu sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết các hợp chấ chứa hoạt tính chống oxy hóa trong củ tỏi Phan Rang cho thấy, các nhân tố như dung môi, tỷ lệ chiết, thời gian chiết, đồng hóa, siêu âm, số lần chiết đều ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa cũng như hàm lượng hợp chất phenol và flavonoid tổng số. Xác định được điều kiện chiết thích hợp dịch tỏi với thông số là: dung môi chiết là nước, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 1/10 (g/ml), nhiệt độ chiết là 30oC và thời gian chiết là 15 phút, đồng hóa là 120 giây, số lần chiết là 2, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở tần số 37 kHz. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa theo các phương pháp bảo quản cho thấy phương pháp bảo quản đông -20oC thì bảo quản dịch chiết củ tỏi tốt nhất có thể kéo dài vài tháng, tiếp đến bảo quản lạnh 0-4 oC thời gian bảo quản kéo dài hơn ở nhiệt độ bảo quản thường. Đã đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp làm khô của dịch chiết từ củ tỏi Phan Rang cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử, hàm lượng hợp chất phenol tổng số, hàm lượng flavonoid và hàm lượng MDA bằng phản ứng fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2 tương ứng lần lượt với các phương pháp làm khô như sau: sấy chân không > cô quay chân không > dịch chiết ở điều kiện thích hợp (ĐKTH) > sấy chân không thăng hoa (CKTH). Khối lượng dịch tỏi sau sấy CKTH, sấy chân không (80 oC) và cô quay chân không (80oC), với thể tích dịch chiết là 50 ml tương ứng là 1,27± 0,05g; 1,53 ± 0,03g và 1,89 ± 0,05g. Bước đầu đã thử nghiệm chống oxy hóa lipid của thịt cá nục bảo quản lạnh bằng cách dùng dịch chiết củ tỏi . Thịt cá nục vẫn giữ được chất lượng tươi nguyên trong thời xiv gian bảo quản lạnh đến 7 ngày và chỉ số biểu hiện khả năng oxy hóa của chất béo thịt cá nục ( -PV, TBARS, TVB-N)- giảm đi đáng kể so với mẫu đối chứng không xử lý dịch chiết. Từ khóa: hoạt tính chống oxy hóa, Allium sativum L., công nghệ xanh, cá nục. xv MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Tỏi có tên khoa học là Allium sativum L., thuộc họ Alliaceae và đặc tính có lợi của tỏi đã được công nhận trong hơn 5000 năm (Amagase và cộng sự, 2001). Tỏi thường được sử dụng làm gia vị thực phẩm ở nhiều nền văn hóa khác nhau trên thế giới và tác dụng chữa trị bệnh của nó đã được biết đến từ thời cổ đại. Trong y học, tỏi được dùng làm dược liệu ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt ở các nước thuộc Châu Á. Công dụng chữa trị bệnh của tỏi đã được nhà sinh lý học La Mã Dioscoride ghi lại vào thế kỷ thứ nhất trước công nguyên. Thời xa xưa người cổ đại Ai cập đã biết dùng tỏi làm 22 vị thuốc quý chữa bệnh đau đầu, suy nhược cơ thể và u thanh quản. Theo y học cổ truyền tỏi có vị cay, mùi hắc, tính ẩm, hơi độc (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trong lịch sử tỏi được dùng để điều trị cảm lạnh, ho, hen suyễn và những nghiên cứu gần đây cho thấy tỏi có tác dụng làm tăng cường hệ thống miễn dịch (Lawrence, 2011). Ngoài ra tỏi còn có tác dụng chữa được một số bệnh như hạ thấp mức cholesterol trong máu (Yeh, 1994), tiểu cầu tập hợp (Steiner và cộng sự, 1996), hoạt động chống viêm (Baek và cộng sự, 2001) và ức chế sự tổng hợp cholesterol (Piscitelli và cộng sự, 2002). Tỏi từ lâu được biết đến có khả năng kháng khuẩn (Rees và cộng sự, 1993 ; Sasaki và cộng sự, 1999 ; Shobana và cộng sự, 2009), kháng nấm (Pai và Platt, 1995), chống ung thư (Unnikrishnan và Kuttan, 1990 ; Kaschula và cộng sự, 2010), chống oxy hóa (Galano và Francisco-Marquez, 2009) và kháng virus (Weber và cộng sự, 1992). Vì vậy, tỏi được coi là một trong những loại thực phẩm phòng ngừa bệnh tốt nhất, nhờ tác động tiềm năng và đa dạng của nó (Amagase, 2006). Nhiều nghiên cứu cho thấy các đặc tính chống oxy hóa của tỏi có liên quan đến các hợp chất phenol và flavonoid có trong tỏi (Miller và cộng sự, 2000) ; (Nuutila và cộng sự, 2003 ; Lawrence, 2011). Chung (2006) báo cáo rằng tỏi và dịch chiết từ đều có chất chống oxy hóa hoạt động bảo vệ chống lại các tác hại do gốc tự do gây ra trong cơ thể. Các dược tính của tỏi có liên quan chặt chẽ với sự hiện diện của hợp chất phenol (phenol, flavonoid), polysaccharide và protein (Bianchini và Vainio, 2001; Nishimura và cộng sự, 2004). Tỏi có chứa một số hợp chất lưu huỳnh và phenol có hoạt tính chất chống oxy hóa và kháng khuẩn cao (Corzo-Martinez và cộng sự, 2007; Lanzotti, 2006). Các hợp chất chứa lưu huỳnh đặc trưng trong tỏi là alliin, allicin, acid amin. Trong đó, alliin là hợp chất lưu huỳnh đại diện chứa nhiều nhất 1 trong tỏi tươi và được chuyển hóa sang allicin bởi alliinase khi tỏi nghiền nát (Itakura và cộng sự, 2001). Hơn nữa, allicin phản ứng thì ngay lập tức bị phân hủy các hợp chất lưu huỳnh khác, chẳng hạn như: sulfide dimethyl, dimethyl disulfide, disulfide dially, dithiine và ajoene (Ali và cộng sự, 2000).Tuy nhiên, tỷ lệ các thành phần bị ảnh hưởng đáng kể bởi các phương pháp chuẩn bị trong sản xuất, kết quả hoạt động dược lý khác nhau (Amagase và cộng sự, 2001; Kasuga và cộng sự, 2001). Tỏi đặc biệt quan trọng trong dinh dưỡng và trong y học, nó có chứa các hợp chất của lưu huỳnh (alliin, allicin, sulfide diallyl, ajoene, lectin…) nước, cellulose, các axit amin, chất béo, dầu etheric, fructosans (carbohydrate), saponosides steroid, acid hữu cơ, các chất khoáng (Mg, Zn, Se, germanium), vitamin (C, A, B), men,… (Kovacevic và cộng sự, 2000) tác dụng của tỏi là rất đa dạng. Trong công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm, các chất oxy hoá được sử dụng rộng rãi để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. Mặc dù, có một số chất chống oxy hóa tổng hợp như Butylated Hydroxyl Anisol (BHA) và Butylated Hydroxyl Toluene (BHT), tuy nhiên người tiêu dùng đang lo ngại về sự an toàn của phụ gia thực phẩm tổng hợp. Mối quan tâm này đã làm dấy lên một mối quan tâm lớn trong các chất phụ gia tự nhiên (Pokorny, 1991). Ngoài ra, người tiêu dùng cũng có xu hướng không muốn sử dụng các chất chống oxi hóa tổng hợp, do lo ngại những ảnh hưởng xấu của chúng đến sức khỏe. Lipid là một trong những thành phần quan trọng của thực phẩm, tuy nhiên trong quá trình chế biến và bảo quản, lipid dễ bị phân hủy do các phản ứng oxy hóa. Peroxide, các sản phẩm bậc I của quá trình tự oxy hóa, bị phân hủy thành các sản phẩm bậc II như aldehyde, cetone, các acid hữu cơ mạch ngắn, ... Những hợp chất này giảm giá trị dinh dưỡng và chất lượng cảm quan của thực phẩm như màu vàng hoặc nâu sẫm, mùi ôi khét, vị đắng. Để ngăn ngừa hiện tượng oxy hóa lipid trong thực phẩm, nhiều giải pháp đã được áp dụng, trong đó sử dụng các chất chống oxy hóa được quan tâm nhiều nhất. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên, trong đó có tỏi. Trong những năm gần đây, xu hướng thế giới quan tâm về phát triển bền vững: hoá học sạch, công nghệ xanh. Việc khai thác các sản phẩm tự nhiên theo hướng tiếp cận công nghệ xanh là một khái niệm mới để đáp ứng những thách thức của thế kỷ 21. Nhằm bảo vệ môi trường và người tiêu dùng, trong thời gian đó tăng cường cạnh tranh của các ngành công nghiệp về sinh thái, sáng tạo và kinh tế. 2 Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất chống oxy hoá từ củ tỏi (Allium sativum L) theo cách tiếp cận công nghệ xanh và thử nghiệm khả năng chống oxy hoá lipit trong cơ thịt cá nục” là cần thiết. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI (1) Thiết lập quy trình chiết xuất chất chống oxy hoá từ củ tỏi Phan Rang theo hướng tiếp cận của công nghệ xanh. (2) Đánh giá khả năng chống oxy hoá lipid trong cơ thịt cá nục xay của dịch chiết từ củ tỏi Phan Rang 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Phân tích hóa thực vật để nhận diện các hợp chất chống oxy hóa có trong củ tỏi Phan Rang. (2) Nghiên cứu sàng lọc ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết và xác định điều kiện thích hợp để chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa từ củ tỏi Phang Rang. (3) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ củ tỏi. (4) Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện làm khô đến hoạt tính chống oxy hóa của cao dịch chiết từ củ tỏi. (5) Thử nghiệm khả năng chống oxy hoá lipit thịt cá nục bằng dịch chiết củ tỏi trong bảo quản lạnh. (6) Thiết lập quy trình chiết xuất chất chống oxy hoá từ củ tỏi theo hướng tiếp cận của công nghệ xanh. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Phát triển phương pháp chiết xuất theo hướng tiếp cận của công nghệ xanh nhằm tạo ra các chế phẩm sinh học an toàn, làm giảm ô nhiễm môi trường theo xu hướng phát triển bền vững của thế giới. 4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI (1) Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao giá trị sử dụng của củ tỏi Phan Rang. (2) Ứng dụng dịch chiết từ củ tỏi vào bảo quản thịt cá nục để ngăn ngừa sự oxy hóa lipit và góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm thịt cá nục, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng và doanh nghiệp sản xuất sản phẩm thịt cá nục. 3