Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ------****------ MEAS PISAL NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ CÂY THANH CAO HOA VÀNG BẰNG DUNG MÔI ISOPROPANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ------****------ MEAS PISAL NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ CÂY THANH CAO HOA VÀNG BẰNG DUNG MÔI ISOPROPANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Trần Ngọc Bảo Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược HàNội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: DS. Trần Ngọc Bảo Người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian qua, giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức và phương pháp luận để hoàn thành khoa luận tốt nghiệp. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng dẫn và cung cấp tài liệu cho tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo bộ môn Công nghiệp dược, các anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học tập tại trường. Cuối cùng cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, người thân và bạn bè – những người luôn dành cho tôi sự chia sẻ, quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình. Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Meas Pisal MỤC LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về artemisinin ......................................................................................2 1.1.1. Công thức hóa học, tính chất ..........................................................................2 1.1.2. Nguồn gốc artemisinin ....................................................................................2 1.1.3. Tác dụng dược lý và chỉ định của artemisinin ................................................2 1.2. Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng .....................................................................3 1.2.1. Cây thanh cao hoa vàng ..................................................................................3 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng.............................................3 1.2.3. Phân bố ...........................................................................................................4 1.2.4. Bộ phận dùng và chế biến ...............................................................................4 1.2.5. Thành phần hóa học ........................................................................................5 1.2.6. Công dụng .......................................................................................................6 1.3. Một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng .................6 1.3.1. Chiết bằng dung môi n-hexan .........................................................................6 1.3.2. Chiết bằng ethanol ..........................................................................................7 1.3.3. Chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn ...........................................................7 1.3.4. Chiết bằng dung dịch ion lỏng ........................................................................7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 10 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị ...................................................................10 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................10 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................10 2.1.3. Máy móc, thiết bị .........................................................................................10 2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................11 2.2.1. Phương pháp định lượng...............................................................................11 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin ...........................................12 2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất với dung môi IPA ............................................12 2.2.2.2. Phương pháp tinh chế .............................................................................13 2.3.1. Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết ....................................13 2.3.1.1. Số lần chiết .............................................................................................13 2.3.1.2. Thời gian chiết ở nhiệt độ phòng ...........................................................14 2.3.1.3. Thời gian chiết khi tăng nhiệt độ............................................................14 2.3.2. So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng dung môi n-hexan………. .............................................................................14 2.3.2.1. So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan .......................................................................................................14 2.3.2.2. So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng ..................................................................................................15 2.3.2.3. So sánh hiệu suất chiết khi tăng nhiệt độ ...............................................16 2.3.2.4. Tính chọn lọc giữa 2 dung môi ..............................................................16 2.3.3. Phương pháp tinh chế artemisinin ................................................................16 2.3.3.1. Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan .17 2.3.3.2. Phương pháp kết tinh trong dung môi ethyl acetat ................................17 2.3.3.3. Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan ......................................17 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 18 3.1. Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng ...........................18 3.2. Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết ...........................................18 3.2.1. Khảo sát số lần chiết .....................................................................................18 3.2.2. Khảo sát thời gian chiết xuất ở nhiệt độ phòng ............................................19 3.2.3. Khảo sát thời gian chiết khi tăng nhiệt độ ....................................................20 3.3. So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng dung môi n-hexan .......................................................................................................21 3.3.1. So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan…................................................................................................................21 3.3.2. So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng…….. ..............................................................................................22 3.3.3. So sánh hiệu suất chiết xuất giữa 2 dung môi IPA và n-hexan ở nhiệt độ 40 ± 5°C ..................................................................................................................23 3.3.4. Tính chọn lọc giữa 2 dung môi .....................................................................24 3.4 . Xây dựng phương pháp tinh chế ........................................................................25 3.4.1. Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan.........25 3.4.2. Phương pháp tinh chế bằng kết tinh artemisinin trong dung môi ethyl acetat……. ..............................................................................................................27 3.4.3. Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan ............................................28 3.4.4. So sánh về các phương pháp tinh chế ...........................................................30 3.4.5. Đề xuất phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin bằng dung môi IPA ................................................................................................................................31 KẾT LUẬN ..................................................................................................................33 TÀI LIỆU THAM KHẢO STT Chữ viết tắt CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Giải thích 1 DĐVN Dược điển Việt Nam 2 DL Dược liệu 3 DM Dung môi 4 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) 5 IPA Isopropanol 6 P Tinh khiết (Pure) 7 STT Số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung bảng Trang Độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng Bảng 1.1 N, N – dimethylethanolammonium octanoate và bis 8 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide) Bảng 1.2 So sánh dung môi chiết artemisinin về hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết, chi phí vận hành, chi phí đầu tư 8 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Tên và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm Kết quả đo quang của dung dịch artemisinin 10 18 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin tại 4 lần chiết 19 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết tại 3 thời gian chiết xuất khác nhau 19 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Hiệu suất chiết xuất artemisinin bằng dung môi IPA ở nhiệt độ 40 ± 5°C tại 5 thời gian chiết Độ tan của artemisinin trong 2 dung môi IPA và n-hexan Hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng 20 21 22 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết bằng 2 dung môi khi tăng nhiệt độ đến 40 ± 5°C 23 Bảng 3.8 Kết quả so sánh độ chọn lọc giữa 2 dung môi IPA và n-hexan 24 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu Bảng 3.9 suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong hỗn hợp dung 25 môi ethyl acetat và n-hexan Bảng 3.10 Bảng 3.11 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong dung môi ethyl acetat Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong dung môi n-hexan 27 28 Bảng 3.12 So sánh các phương pháp tinh chế theo các tiêu chí DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Danh mục các hình ảnh, đồ thị STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 1.1: Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng Hình 1.2: Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất artemisinin bằng dung môi IPA tương ứng với 5 thời gian chiết khác nhau ở nhiệt độ 40 ± 5°C Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết giữa dung môi IPA và dung môi n-hexan khi dùng nhiệt độ 40 ± 5°C Hình3.4: Sản phẩm thô của artemisinin trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat và n-hexan Hình 3.5: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat: n-hexan Hình3.6: Sản phẩm thô của artemisinin trong dung môi ethyl acetat Hình 3.7: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong dung môi ethyl acetat Hình 3.8: Sản phẩm thô của artemisinin kết tinh trong dung môi n-hexan Hình 3.9: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan Hình 3.10: Quy trình chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA 30 Trang 3 5 20 22 23 26 26 27 27 29 29 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt rét là một bệnh phổ biến trên thế giới, trong đó có cả ở Đông Nam Á, đặc biệt ở biên giới giữa Campuchia và Thái Lan là nơi tập trung bệnh sốt rét nhiều nhất. Ký sinh trùng sốt rét có khả năng kháng thuốc rất nhanh, vì vậy con người luôn cố gắng tìm ra biện pháp để điều trị bệnh có hiệu quả. Người ta đã phát hiện artemisinin là một hoạt chất có tác dụng tốt với thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt với sốt rét thể não do chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã kháng cloroquin. Từ trước đến hiện nay, artemisinin đã được chiết từ lá của cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.). Trên thế giới, đã có nghiên cứu chiết xuất artemisinin bằng nhiều dung môi như: n-hexan, ethanol, ion lỏng, scCO2 (CO2 siêu tới hạn), HFC-134a (Hydrofluocacbon)… Ở Việt Nam, phương pháp chiết xuất artemisinin được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp ngâm với dung môi n-hexan. Dung môi isopropanol đã được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm do nó có khả năng hòa tan tốt nhiều chất và nguy cơ cháy nổ thấp hơn dung môi n-hexan và một số dung môi khác. Dựa trên ưu điểm này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol” với mục đích góp phần tìm ra phương pháp chiết artemisinin có hiệu quả và an toàn. Đề tài gồm các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA. 2. So sánh hiệu quả chiết xuất của dung môi IPA và n-hexan (độ tan, tính chọn lọc, hiệu suất). 2 1.1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Tổng quan về artemisinin 1.1.1. Công thức hóa học, tính chất CH3 H O CH3 O Công thức phân tử: C15H22O5 H H CH3 Công thức cấu tạo: O Khối lượng phân tử: 282,33 Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR) – Octahydro – 3,6,9 – trimethyl – 3,12 – epoxy – 12H – pyrano [4,3-j] – 1,2 – benzodioxepin – 10(3H) – one [15] Tính chất: Artemisinin là tinh thể hình kim không màu hoặc bột kết tinh trắng, tan nhiều trong ethanol, aceton, cloroform, ethyl acetat, ít tan trong n-hexan, benzen, toluen và hầu như không tan trong nước, nó dễ bị thủy phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên, artemisinin khá bền vững trong các dung môi không phân cực [3]. Nhiệt độ nóng chảy: 156 – 157°C Năng suất quay cực: [ ]D17= +66,3 1.1.2. Nguồn gốc artemisinin Artemisinin được tìm thấy trong cây thanh cao hoa vàng, hàm lượng cao nhất trong phần lá ở ngọn (50cm từ phần ngọn trở xuống) và ở thời điểm trước khi cây ra hoa. Mặc dù cây thanh cao hoa vàng mọc ở Trung Quốc được công bố có hàm lượng artemisinin đến 0,9% nhưng nói chung cây thanh cao hoa vàng mọc ở nơi khác chỉ có hàm lượng artemisinin khoảng 0,1% [7]. 1.1.3. Tác dụng dược lý và chỉ định của artemisinin Đến hiện nay, artemisinin vẫn được dùng để điều trị sốt rét do có khả năng diệt thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt rét đặc biệt tốt với sốt rét thể não do chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã kháng cloroquin. Artemisinin có tác dụng diệt giao bào, có tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, thời gian tác dụng ngắn [13]. 3 Ngoài việc dùng artemisinin để điều trị sốt rét, artemisinin đang được nghiên cứu sử dụng trong điều trị ung thư [13]. Qua nghiên cứu, người ta cho rằng tế bào ung thư rất cần ion sắt để phát triển nên chúng hấp thu lượng ion sắt lớn hơn tế bào thường. Khi artemisinin vào tế bào ung thư, ion sắt xúc tác tạo phản ứng cắt cầu nối peroxyd (R-O-O-R) của phân tử và tạo thành các gốc tự do. Chính các gốc tự do có tính oxy hóa mạnh này có tác dụng phá hủy màng tế bào ung thư. Đối với tế bào bình thường thì độc tính của artemisinin là tương đối thấp do lượng ion sắt không cao [12]. 1.2. Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 1.2.1. Cây thanh cao hoa vàng Thanh cao hoa vàng (tên khoa học là Artemisia annua L.), là cây thuộc họ Cúc (Asteraceae). Ngoài ra, cây còn có tên khác là Thanh hao hoa vàng, ngải hoa vàng, ngải si, ngải hôi, nhả ngải bẩu slay (Tày),…[4]. Các thầy thuốc Trung Quốc đã sử dụng nước sắc của cây thanh cao hoa vàng để điều trị sốt. Ở Việt Nam, vào thế kỳ XIV, Tuệ Tĩnh cũng đã dùng thanh cao hoa vàng trong điều trị và đến những năm 1990 bắt đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học và phương pháp chiết xuất. 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng Hình 1.1: Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng 4 Cây thảo mọc đứng, sống hàng năm, phân nhiều cành. Thân hình trụ có rãnh dọc, màu lục hoặc hơi tím, cao 0,5 – 2,0m. Lá kép mọc so le, lá ở giữa thân thường xẻ 3 lần lông chim thành những thủy nhỏ và sâu, lá ở giữa ngọn lúc cây sắp ra hoa thường hẹp, xẻ 1 – 2 lần lông chim, mặt trên có lông lục nhạt, cả hai mặt đều có lông nhỏ mịn [4], [7]. Cụm hoa hình đầu, cuống rất ngắn, đường kính 1,5cm, các đầu tụ hợp thành chùy ở ngọn thân và đầu cành, tổng bao gồm các lá bắc hình sợi chỉ thuôn không lông, xếp thành 2 – 3 hàng, hoa màu vàng, dạng ống, dài không quá 1mm, phía ngoài là hoa cái, bên trong là hoa lưỡng tính, tràng của hoa cái có tuyến ở trong ống, ống tràng hơi loe ở đỉnh, rồi chia thành 4 thùy nhọn, vòi nhụy xẻ; tràng của hoa lưỡng tính rộng và xẻ thành 5 thùy; nhị 5, bao phấn ngắn . Quả bế, hình trái xoan hoặc hình trứng ngược, có vân dọc, dài 0,4 – 0,5mm, có tinh dầu. Toàn thân và lá vò ra có mùi thơm đặc biệt. Mùa hoa quả vào tháng 9 – 11 [7]. 1.2.3. Phân bố Trên thế giới, thanh cao hoa vàng phân bố rải rác ở vùng ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới Bắc bán cầu, bao gồm một số nước ở Đông Âu, Bắc Mỹ, Tây –Nam Á và Đông Á [2], [7]. Ở Việt Nam, thanh cao hoa vàng mọc tự nhiên ở bốn tỉnh: Lạng Sơn, Cao Bằng, Quang Ninh và Bắc Giang. Do việc phát triển trồng từ năm 1990 đến nay, thanh cao hoa vàng còn được trồng ở các tỉnh trung du và đồng bằng Bắc Bộ như Vĩnh Phúc, Phú Thọ (Thanh Sơn), Tuyên Quang, Bắc Ninh,… [4], [7]. 1.2.4. Bộ phận dùng và chế biến Bộ phận dùng là lá, được thu hái ở cây sắp ra hoa, tốt nhất là vào mùa hè, phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở nhiệt độ 30 – 40°C đến khô [7]. Lá có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn, dễ vụn nát, mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng. Dược liệu đem chiết xuất có thể lẫn một ít cành hoặc ngọn non. 5 1.2.5. Thành phần hóa học Thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng phần trên mặt đất chứa artemisinin (thành phần chính), acid artemisinic, artenuin (qinghaosu I), artenuin B (qinghaosu II), desoxyartemisinin (qinghaosu III), Qinghaosu IV, artenuin E (qinghaosu V), artemisininlacton (artenuin F), artemisiten (dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester [7]. Ngoài các thành phần hóa học trên, cây thanh cao hoa vàng còn chứa lipid, flavonoid, coumarin, polyacetylen, tinh dầu sterol. Hàm lượng artemisinin trong lá cây thanh cao hoa vàng đạt từ 0,01% đến 0,9% [7]. Ở Việt Nam hiện nay, artemisinin và artesunat (thành phần tổng hợp từ artemisinin) được sử dụng rộng rãi nhất. Một số thành phần chính có trong cây thanh cao hoa vàng ngoài artemisinin [7]: CH3 CH3 H CH3 H H O CH3 O CH3 O O O H H H H3C H O CH2 H CH3 O HO2C O Artemisiten Desoxyartmisinin (Qinghaosu III) CH2 Acid artemisinic CH3 CH3 CH3 H CH3 H H H H3C H3C H3C H3C OH H H O O H CH2 HO2C H2C CH2 Acid epoxyartmisinic COOCH3 O Acid artemisinic methylester Arteannuin E CH3 CH3 CH3 H H H O H3C O H3C H3C O O H O O H H O O O CH3 CH3 O CH2 Arteannuin C O Artemisinin G O Qinghaosu IV O O Arteannuin E 6 Hình 1.2: Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng 1.2.6. Công dụng Thanh cao hoa vàng có vị đắng, tính hàn, quy vào 2 kinh can và đởm, có tác dụng chữa mồ hôi trộm, sốt rét và mụn nhọt. Đông y cho rằng dùng thanh cao hoa vàng lâu ngày không có hại mà còn làm cho ăn ngon cơm, chóng tiêu, chữa mệt mỏi về cơ thể và trí não. Ngoài ra thanh cao còn có tác dụng cầm máu, chữa chảy máu cam, đại tiện ra máu, dùng ngoài da có tính chất sát trùng, chữa mụn nhọt lở ngứa [4], [7]. Trong y học hiện đại, thanh cao hoa vàng là nguồn nguyên liệu để chiết xuất artemisinin dùng trong điều trị sốt rét [2], [3], [4], [6]. 1.3. Một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng trong mục đích lựa chọn dung môi có ưu điểm nhất về hiệu suất chiết, an toàn, chi phí thấp ... Các phương pháp chiết artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng : 1.3.1. Chiết bằng dung môi n-hexan Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, người ta sử dụng dung môi n-hexan để chiết xuất artemisinin. Phương pháp chiết bằng dung môi n-hexan được coi là một phương pháp truyền thống. Lá thanh cao hoa vàng được phơi khô, xay thô và nạp vào nồi chiết. Tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, chiết ở nhiệt độ 30 – 50°C, thời gian chiết 3 giờ. Chiết 3 lần, dịch chiết lần 3 sử dụng làm dung môi chiết lần 1 của mẻ khác. Sau đó gộp dịch chiết lại, cô thu hồi dung môi rồi rút ra để kết tinh ít nhất 24 giờ, artemisinin sẽ kết tinh lẫn với sáp. Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng nhiệt độ và xăng nóng thu được artemisinin thô không lẫn sáp. Có thể kiểm tra đã loại sáp hết bằng cách hòa tan artemisinin thô trong aceton, nếu dung dịch trong là đã loại sáp. Artemisinin thô đã loại hết sáp được hòa tan trong cồn sôi, thêm than hoạt và đun sôi 20 phút với sinh hàn hồi lưu, lọc nóng loại than hoạt và để kết tinh ở nhiệt độ thường tối thiểu 24 giờ. Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C [5]. 7 Dung môi n-hexan là dung môi khá chọn lọc, quá trình chiết đơn giản nhưng hiệu suất chiết thấp và dễ cháy nổ. 1.3.2. Chiết bằng ethanol Albert Fleming và cộng sự đã nghiên cứu lựa chọn được các thông số để tiến hành chiết artemisinin bằng ethanol như sau: - Ethanol: 96% - Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ phòng. - Tỷ lệ DL/DM (Kg/L): 1/7,5. - Thời gian chiết: 3,5 giờ. - Chiết 2 lần, sau mỗi lần chiết có khoảng 1,5L (20%) dịch chiết còn lại trong dược liệu nên người ta cần rửa và ép lấy dịch chiết. Gộp lại dịch chiết, cất thu hồi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn bằng hỗn hợp dung môi n-hexan – ethyl acetat (85:15), lọc. Dịch lọc cô đến đậm đặc rồi để kết tinh. Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C [14]. Ethanol 96% là một dung môi ít độc, dễ kiếm, nhưng dễ cháy nổ, chi phí lại cao và artemisinin kém ổn định trong ethanol 96%. 1.3.3. Chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn Marcel Kohler và cộng sự đã khảo sát phương pháp chiết xuất artemisinin bằng dung môi CO2 siêu tới hạn, kết hợp với phân tích dịch chiết bằng kỹ thuật HPLC. Tác giả tìm ra điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất là: áp suất khí đẩy dòng CO2 là 15 mPa, nhiệt độ chiết 50°C, chất cho thêm là methanol với nồng độ 3%, thời gian chiết là 20 phút, tốc độ dòng CO2 là 2ml/phút. Ưu điểm của phương pháp là thân thiện với môi trường, có thể áp dụng cho dược chất không bền, khả năng hòa tan tốt một số chất và có thể tái sử dụng. Nhược điểm là yêu cầu phải có thiết bị chuyên dụng, giá thành đắt; điều kiện tối ưu để chiết thành công [14]. 1.3.4. Chiết bằng dung dịch ion lỏng Nhiều nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng dung dịch ion lỏng để chiết xuất artemisinin trong mục đích thay thế dung dịch ion lỏng với các dung môi đang sử 8 dụng. Artemisinin tan tốt trong nhiều dung dịch ion lỏng, đặc biệt độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng N, N – dimethylethanolammonium octanoate (DMEA oct) và bis 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide) (BMOEA bst) cao hơn độ tan của artemisinin trong n-hexan và ethanol [14]. Bảng 1.1: Độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng N, N – dimethylethanolammonium octanoate và bis 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide) Độ tan của artemisinin g/l Dung dịch ion lỏng DMEA oct 82 BMOEA bst 110 Qua nhiều thực nghiệm, người ta chứng minh được rằng hiệu suất chiết artemisinin bằng 2 dung dịch trên cao hơn hiệu suất chiết bằng n-hexan và ethanol, thời gian chiết xuất ngắn hơn, chi phí đầu tư cũng thấp hơn so với chiết bằng nhiều dung môi khác (bảng 1.2). Dựa trên dữ liệu đã nghiên cứu được, nhà nghiên cứu có thể so sánh về hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết, chi phí trong quá trình chiết… giữa các dung môi như bảng 1.2: Bảng 1.2: So sánh dung môi chiết artemisinin về hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết, chi phí vận hành, chi phí đầu tư [14]: n-hexan Ethanol Ion lỏng scCO2 Trong đó: Hiệu suất chiết suất (%) 69 73 79 82 Thời gian chiết (giờ) 8 – 10 7 2,5 – 6 3–6 Chi phí vận hành (€/Kg của artemisinin) 28 47 22 42 Chi phí đầu tư cho 2,5.106Kg dược liệu/năm (m€) 0,7 1,0 0,3 – 1,0 4,1 - Hiệu suất chiết xuất: Là tỷ lệ giữa khối lượng artmisinin thu được so với artemisinin có trong dược liệu. - Thời gian chiết: Là thời gian để chiết kiệt artmisinin từ trong dược liệu. - Chi phí vận hành: bao gồm các chi phí điện và chi phí cho quá trình chiết khác. 9 - Chi phí đầu tư: bao gồm chi phí trang thiết bị, chi phí chiết xuất, hàng tồn kho và dung môi. Nhận thấy IPA là một alcol có khả năng hòa tan và một số tính chất như ethanol, IPA rẻ hơn ethanol. Hơn nữa IPA có loại khan nước nên có thể artemisinin sẽ ổn định trong IPA hơn trong ethanol 96%. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA với mong muốn tìm được dung môi chiết an toàn và có hiệu suất cao. 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu: Lá thanh cao hoa vàng được trồng ở vùng Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc, lá được thu hái vào tháng 4 năm 2012. 2.1.2. Hóa chất : Bảng 2.1: Tên và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm: STT Tên hóa chất Nguồn gốc 1 Artemisinin chuẩn 99% 2 Cloroform 3 Ethanol 96% Việt Nam 4 Ethyl acetat Trung Quốc 5 Isopropanol 99% Trung Quốc 6 n-hexan Trung Quốc 7 Xăng công nghiệp 2.1.3. Máy móc, thiết bị - Máy cất quay Buchi B480 (Thụy Sỹ) - Máy khuấy từ IKA RH basic KT/C - Máy đo quang phổ UV-VIS Hitachi (Mỹ) - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức) - Máy HPLC Shimadzu SPD-M10 Avp với detetor UV (Nhật) - Tủ sấy Mermert (Đức) - Các trang thiết bị thí nghiệm khác. Việt Nam Trung Quốc Việt Nam 11 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp định lượng a) Định lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng: Định lượng theo DĐVN IV, sử dụng phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng [1]. Cách tiến hành như sau: - Bản mỏng: silica gel G. - Hệ dung môi: n-hexan : ethyel acetat (70:30) - Dung dịch thử: Cân chính xác 1g dược liệu, chiết với ether dầu hỏa (30 - 60°C) trong bình soxhlet dung tích 50ml trên cách thủy trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi lấy cắn. Hòa tan cắn trong 1ml cloroform và cho vào bình định mức 10ml, tráng cốc đựng cắn bằng ethanol 96% rồi thêm cùng dung môi cho đến vạch. Lọc qua giấy lọc, bỏ 0,5 đến 1ml dịch lọc đầu, lấy khoảng 2ml dịch lọc tiếp theo. - Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác 0,010g artemisinin chuẩn, hòa tan trong 10ml ethanol 96% (pha dùng trong ngày). - Bản silica gel G (20cm×20cm) đã được hoạt hóa ở 110°C trong 2 giờ được chia vạch thành 5 băng, chấm lần lượt mỗi băng 0,1ml các dung dịch thử (băng 1 và 2) và dung dịch đối chiếu (băng 3 và 4) chấm thành vạch dài 2cm, rộng 0,3cm ; băng 5: chấm 0,1ml ethanol 96% làm mẫu trắng. - Tiến hành sắc ký, sau khi triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 18cm , lấy bản mỏng ra, để khô dung môi ngoài không khí trong 1 giờ. Phun nước cất làm ướt bản mỏng để xác định các vùng có artemisinin. Các vết artemisinin chuẩn sẽ xuất hiện màu trắng đục trên sắc ký đồ. Vạch đường ngay ở phía trên và phía dưới vết artemisinin đã được xác định sao cho cách đều hai mép của vết 0,5cm đến 0,7cm. Cạo riêng biệt các vùng có artemisinin của vết 1, 2, 3 và 4. Cạo vùng không chứa artemisinin của vết 5 làm mẫu trắng, cho vào mỗi mẫu bột silica gel cạo được nói trên 1ml ethanol 96%, lắc kỹ. Thêm 9ml dung dich NaOH 0,05N, lắc kỹ, cho vào tủ ấm 50°C trong 30 phút. Lấy ra để nguội 15 phút, lọc lấy dịch lọc trong và đo độ hấp thụ của các dung dịch so với