Tài liệu Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở sapa, việt nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TUYỂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG CỦ TAM THẤT TRỒNG Ở SAPA, VIỆT NAM VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 62540101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. HÀ DUYÊN TƢ 2. PGS.TS. ĐẶNG NGỌC QUANG Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu công bố trong luận án này là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học với sự đồng ý của đồng tác giả, phần còn lại chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội: 2017 Tác giả luận án NCS: Nguyễn Quang Tuyển LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả lòng kính trọng và biết ơn của mình, tôi vô cùng cảm tạ cố GS.TS.Hà Duyên Tƣ ngƣời đã trực tiếp đƣa dẫn tôi đến công trình nghiên cứu khoa học này. Đồng thời, bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi đến PGS.TS. Đặng Ngọc Quang, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, góp ý và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Hồng Sơn, PGS.TS. Nguyễn Thị Minh Tú và các thầy cô trong Bộ môn Quản lý Chất lƣợng, các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các đồng nghiệp thuộc các đơn vị sau: - Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế - Trung tâm Kiểm nghiệm dƣợc, Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế - Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia - Phòng Hóa Sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Bộ môn Hóa Phân tích, Bộ môn Hóa Hữu cơ, Bộ môn Hóa sinh và Tế bào học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã đóng góp ý kiến quý báu và kịp thời, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn các em học viên cao học, sinh viên tại khoa Hóa học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội và Bộ môn Quản lý Chất lƣợng, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian làm luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể Cán bộ và Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Bách khoa Hà Nội, Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Sƣ phạm Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, ngƣời thân và gia đình hai bên nội ngoại, đặc biệt vợ tôi Lê Thị Cẩm Tú và hai con Nguyễn Quang Dƣơng, Nguyễn Lê Huệ Minh đã động viên cổ vũ tôi, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi đƣợc học tập, hoàn thành công việc nghiên cứu này. MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của luận án .............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................. 4 1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY TAM THẤT .............................................................................. 4 1.1.1. Tên gọi và nguồn gốc cây tam thất .......................................................................... 4 1.1.1.1. Đặc điểm tam thất thuộc chi Panax L. ............................................................. 4 1.1.1.2. Phân loại các loài trong chi Panax L. .............................................................. 5 1.1.2. Phân loại các loài tam thất ở Việt Nam ................................................................... 6 1.1.3. Giới thiệu về 3 loài tam thất trồng phổ biến ở Sapa, Việt Nam ............................... 6 1.1.3.1. Tam thất Trung Quốc ........................................................................................ 6 1.1.3.2. Vũ diệp tam thất ................................................................................................ 7 1.1.3.3. Tam thất hoang ................................................................................................. 8 1.1.4. Phân bố .................................................................................................................... 9 1.1.5. Trồng trọt và thu hái ................................................................................................ 9 1.1.6. Chế biến và bảo quản ............................................................................................... 9 1.1.7. Tình hình sản xuất tam thất trên thế giới và ở Việt Nam ......................................... 9 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY TAM THẤT ........................................ 10 1.2.1. Thành phần hoá học tinh dầu tam thất ................................................................... 10 1.2.2. Các hợp chất saponin trong thực vật ...................................................................... 11 1.2.2.1. Định nghĩa, phân loại ..................................................................................... 11 1.2.2.2. Cấu trúc hoá học saponin ............................................................................... 12 1.2.2.3. Các nghiên cứu về saponin từ chi Panax L. ................................................... 16 1.2.3. Hợp chất polyacetylen ........................................................................................... 20 1.2.4. Hợp chất phenol thực vật ....................................................................................... 22 1.2.5. Hợp chất flavonoid ................................................................................................ 22 1.2.6. Protein và amino axit ............................................................................................. 23 1.2.7. Lipid và axit béo .................................................................................................... 24 1.2.8. Carbohydrate .......................................................................................................... 24 1.2.9. Chất khoáng ........................................................................................................... 24 1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SAPONIN ............................................................. 25 1.3.1. Khả năng kháng nấm của saponin ......................................................................... 25 1.3.2. Khả năng kháng vi khuẩn của saponin .................................................................. 26 1.3.3. Khả năng kháng vi rút của saponin ........................................................................ 26 1.3.4. Tác dụng kháng viêm và cầm máu ........................................................................ 26 1.3.5. Tác dụng lên hệ thần kinh ...................................................................................... 27 1.3.6. Tác dụng của saponin steroid dùng để tổng hợp các nội tiết tố steroid ................. 27 1.3.7. Tác dụng sinh dục .................................................................................................. 28 1.3.8. Hoạt tính chống oxy hóa - quét gốc tự do DPPH .................................................. 28 1.3.9. Tác dụng chống ung thƣ ........................................................................................ 28 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYACETYLEN ............................................... 29 1.5. ỨNG DỤNG MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI PANAX TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM ................................................................................................................ 29 1.5.1. Thực phẩm chức năng ............................................................................................ 29 1.5.2. Cơ sở khoa học cho việc bổ sung hoạt chất của tam thất trong thực phẩm ........... 31 1.5.2.1. Sự dung nạp saponin....................................................................................... 31 1.5.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến sự chuyển hóa saponin ................. 32 1.5.3. Thực phẩm chức năng từ một số loài thuộc chi Panax L. ..................................... 33 1.5.4. Liều dùng và cách dùng ......................................................................................... 34 1.6. CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH POLYACETYLEN .................................................. 34 1.7. CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH SAPONIN ................................................................ 34 1.7.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết tách saponin ........................................ 35 1.7.2. Nghiên cứu trên thế giới về công nghệ chiết tách saponin .................................... 36 1.7.3. Các phƣơng pháp chiết tách saponin ..................................................................... 37 1.7.3.1. Phương pháp thẩm tích (làm giầu saponin) ................................................... 37 1.7.3.2. Dùng cột sephadex LH-20 .............................................................................. 37 1.7.3.3. Thủy phân tách sapogenin và đường .............................................................. 38 1.7.4. Các nghiên cứu trong nƣớc về công nghệ chiết tách saponin ................................ 39 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 41 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 41 2.1.1. Nguyên liệu thực vật .............................................................................................. 41 2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ............................................................................................... 41 2.1.3. Vi sinh vật và các chủng thử nghiệm ..................................................................... 41 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................................. 42 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 42 2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất.......................................................................................... 42 2.2.2. Xác định hàm lƣợng protein .................................................................................. 43 2.2.3. Xác định hàm lƣợng lipid ...................................................................................... 44 2.2.4. Xác định hàm lƣợng carbohydrate ......................................................................... 44 2.2.5. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng phenol tổng ..................................................... 45 2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid tổng ................................................. 46 2.2.7. Các phản ứng đặc trƣng để phát hiện saponin ....................................................... 47 2.2.7.1. Phản ứng tạo bọt: ........................................................................................... 47 2.2.7.2. Phản ứng Liberman Burchard ........................................................................ 48 2.2.7.3. Phản ứng Salkowsky ....................................................................................... 48 2.2.7.4. Phản ứng màu:................................................................................................ 48 2.2.8. Các phƣơng pháp phân tích chất và các hợp chất .................................................. 48 2.2.8.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .................................................................. 48 2.2.8.2. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS ............................................. 51 2.2.8.3. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS/AES-GFA . ................................... 53 2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm ......................................................................................... 54 2.2.10. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính sinh học ..................................................... 56 2.2.10.1. Hoạt tính chống oxy hóa - quét gốc tự do DPPH ......................................... 56 2.2.10.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định .......................................................... 56 2.2.10.3. Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin ....................................................... 57 2.2.10.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư......................... 58 2.2.11. Các phƣơng pháp sắc ký để tách, tinh chế các thành phần tinh khiết .................. 58 2.2.11.1. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 58 2.2.11.2. Sắc ký bản mỏng (TLC- Thin Layer Chromatography) ................................ 59 2.2.11.3. Sắc ký lỏng điều chế (Preparative HPLC).................................................... 59 2.2.12. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thu đƣợc .......................... 59 2.2.12.1. Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Impact 410-Nicolet FT-IR .................... 59 2.2.12.2. Các phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). ..................................... 59 2.2.13. Phƣơng pháp thử độc tính cấp trên chuột - xác định liều an toàn ............................... 60 2.2.14. Phƣơng pháp phân tích cảm quan ........................................................................ 61 2.2.15. Phân tích thống kê kết quả thí nghiệm ................................................................. 61 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 62 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA NGUYÊN LIỆU TAM THẤT ....... 62 3.1.1. Hàm lƣợng protein ................................................................................................. 62 3.1.2. Hàm lƣợng lipid ..................................................................................................... 62 3.1.3. Hàm lƣợng carbohydrate ....................................................................................... 63 3.1.4. Hàm lƣợng các amino axit ..................................................................................... 63 3.1.5. Thành phần axit béo ............................................................................................... 65 3.1.6. Nghiên cứu về thành phần các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng ............................. 66 3.1.7. Hàm lƣợng phenol tổng ......................................................................................... 66 3.1.8. Hàm lƣợng flavonoid tổng ..................................................................................... 67 3.1.9. Phát hiện saponin bằng các phản ứng định tính đặc trƣng: ................................... 66 3.1.10. Xác định saponin trong tam thất bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......... 68 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH CAO TỔNG TỪ CỦ TAM THẤT HOANG (Panax stipluleanatus) ...................................................................................... 69 3.2.1. Nghiên cứu khảo sát các phƣơng pháp chiết tách thu cao tổng. ............................ 69 3.2.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ƣu hoá phƣơng pháp chiết siêu âm ........................ 72 3.2.3. Tối ƣu hoá quá trình chiết cao tổng thành phần tam thất....................................... 77 3.2.3.1. Thiết lập mô hình ............................................................................................ 77 3.2.3.2. Tối ưu hóa ....................................................................................................... 81 3.2.3.3. Kết quả kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa ......................................................... 81 3.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT XUẤT TỪ CỦ TAM THẤT HOANG .................................................................................................... 83 3.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa - khả năng quét gốc tự do DPPH ................................... 83 3.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật .................................................................................... 84 3.3.3. Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin ................................................................ 85 3.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ .............................................................................. 87 3.4. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT TAM THẤT HOANG ................................. 89 3.4.1. Chiết các phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang ...................................... 89 3.4.2. Phân lập một số thành phần hóa học trong cao chiết củ tam thất hoang ............... 90 3.4.2.1. Phân lập các hợp chất từ cao n-hexane của củ tam thất hoang ..................... 90 3.4.2.2. Phân lập các hợp chất từ cao n-butanol của củ tam thất hoang .................... 92 3.4.3. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao n-hexane .................................... 93 3.4.3.1. Hợp chất H3C2 (T1) ....................................................................................... 93 3.4.3.2. Hợp chất H5A1 (T2) ....................................................................................... 94 3.4.3.3. Hợp chất H6A1 (T3) ....................................................................................... 95 3.4.3.4. Hợp chất H6A2 (T4) ..................................................................................... 100 3.4.4. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao chiết n-butanol ......................... 104 3.4.4.1. Hợp chất HAB2A3 (T5) ................................................................................ 104 3.4.4.2. Hợp chất HAB2C3 (T6) ................................................................................ 107 3.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn và độc tính tế bào của chất sạch ..................................... 112 3.4.5.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chất sạch..................................................... 112 3.4.5.2. Hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư của chất sạch ...................................... 113 3.5. ĐỘC TÍNH TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM – LIỀU AN TOÀN ........................... 114 3.6. ỨNG DỤNG TAM THẤT HOANG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM.......... 115 3.6.1. Qui trình sản xuất bánh qui (cookie) tam thất ..................................................... 115 3.6.2. Qui trình sản xuất nƣớc tam thất mật ong ............................................................ 120 3.6.3. Qui trình sản xuất kẹo cứng tam thất ................................................................... 123 3.6.4. Qui trình sản xuất trà tam thất hoa cúc ................................................................ 125 KẾT LUẬN........................................................................................................................ 129 ĐỀ XUẤT NGHIÊN CỨU TIẾP TỤC.............................................................................. 131 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............................. 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 133 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 1 AAS Atomic Absorption Spectrometric Quang phổ hấp thụ nguyên tử 1. ACTH Adrenocorticotropic hormon Hormone tuyến thƣợng thận 2. AES-GFA 3. ATCC 4. B16 - BL-6 Human lung cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ phổi 5. Caco-2 Human colon adenocarcinoma cell line Dòng tế bào ung thƣ trực tràng 6. CC Column Chromatography Sắc kí cột 7. C: M 8. C: M: H2O 9. DEPT 10. DMSO Dimethyl sulfoxide 11. DNEM Dulbecco's modified eagle medium 12. DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrrazyl 13. EI-MS Electron Impact –Mass Spectrometry 14. Et 15. EtOAc Ethyl acetat Etylaxetat 16. EtOH Ethanol Etanol 17. FBS Fetal bovine serum Huyết thanh phôi bò 18. GC-MS Gas chromatography mass spectrometry 19. HCT-116 Human colon adenocarcinoma cell line Dòng tế bào ung thƣ trực tràng 20. HDL-C High-density lipoprotein cholesterol Cholesterol-lipoprotein tỉ trọng cao 21. HepG2 Human hepatocyte carcinoma cell line Dòng tế bào ung thƣ gan 22. HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 23. HPLC High pressure liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao 24. HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ hai chiều, tƣơng tác trực tiếp Correlation C–H Phổ phát xạ nguyên tử - lò graphit American type culture collection Ngân hàng giống Mỹ Hệ dung môi chloroform: methanol Hệ dung môi chloroform: methanol: nƣớc Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản Phổ khối va chạm electron Nhóm C2H5- Phƣơng pháp sắc kí khí/ khối phổ liên hợp Phổ hai chiều, tƣơng tác gián tiếp C–H Hệ dung môi n-hexane: ethyl acetat 25. H: E 26. IC50 Haft - maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% 27. Int-407 Human embryonic intestinal cell Dòng tế bào ung thƣ ruột 28. IR Fourrier Transtormation InfraRed Phổ hồng ngoại 29. KB Human epidermic carcinoma cell line Dòng tế bào ung thƣ biểu mô 30. L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylanaline 31. LD0 32. LD50 Lethal dose, 50 % Liều chết 50% động vật 33. LU Human lung cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ phổi 34. MCF-7 Human breast adenocarcinoma cell line Dòng tế bào ung thƣ vú 35. Me 36. MeOH Methanol 37. MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu 38. MS Mass Spectrum Phổ khối lƣợng 39. M: H2O Methanol: H2O Hệ dung môi methanol: nƣớc 40. MPA Meat-Peptone-Agar Môi trƣờng MPA 41. MTT 42. NOTO Panax notoginseng Tam Thất Trung Quốc 43. PBS Phosphate-buffered saline Đệm phosphate Prep. Preparative High Performance Liquid HPLC Chromatography 44. Liều dƣới liều chết nhóm CH3- 3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 Diphenyltrazolium bromide Sắc kí lỏng điều chế 45. SK-MEL 2 Human melanoma cell line Dòng tế bào ung thƣ sinh sắc tố 46. SVD Panax bipinnatifidus Sâm vũ diệp 47. TLC Thin-Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng 48. TTH Panax stipuleanatus Tam thất hoang 49. UV-Vis Ultraviolet–visible spectroscopy Phổ tử ngoại - khả kiến 50. 1 Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ proton 51. 13 Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ cacbon 13 52. 26M31 Human colon adenocarcinoma cell line H NMR C NMR Dòng tế bào ung thƣ trực tràng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax L ..................................................... 5 Bảng 1.2. Dẫn xuất saponin của 20 (S)-protopanaxadiol ................................................... 16 Bảng 1.3. Dẫn xuất saponin của 20 (S)-protopanaxatriol .................................................. 17 Bảng 1.4. Tác dụng của một số loại saponin quan trọng nhất ............................................ 17 Bảng 1.5. Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài thuộc chi Panax L. ........................ 21 Bảng 1.6. Hàm lượng protein của một số loài thuộc chi Panax L. ..................................... 23 Bảng 1.7. Hàm lượng amino axit của một số loài thuộc chi Panax L. (mg/g) .................... 23 Bảng 1.8. Hàm lượng carbohydrate của một số loài thuộc chi Panax L. ........................... 24 Bảng 1.9. Hàm lượng khoáng trong một số loài thuộc chi Panax L. .................................. 25 Bảng 1.10. Ảnh hưởng của Panaxytriol trên các dòng ung thư .......................................... 29 Bảng 2.1. Chương trình chạy dung môi theo thời gian trên HPLC ..................................... 49 Bảng 2.2. Chất chuẩn saponin thành phần và nguồn gốc xuất xứ ...................................... 50 Bảng 3.1. Hàm lượng protein trong củ 3 loài tam thất ....................................................... 62 Bảng 3.2. Hàm lượng lipid trong củ 3 loài tam thất............................................................ 63 Bảng 3.3. Hàm lượng carbohydrate trong củ 3 loài tam thất ............................................. 63 Bảng 3.4. Thành phần các amino axit trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô) ............. 64 Bảng 3.5. Thành phần các axit béo có trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô) ............ 65 Bảng 3.6. Thành phần các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong củ tam thất (mg/kg trọng lượng khô) ............................................................................................................................ 66 Bảng 3.7. Hàm lượng phenol tổng trong cao chiết và bột ba loại củ tam thất ................... 67 Bảng 3.8. Hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết và bột ba loại củ tam thất ............... 67 Bảng 3.9. Kết quả định tính phát hiện saponin trong bột ba loài tam thất ......................... 68 Bảng 3.10. Định lượng saponin trong bột củ ba loài tam thất ............................................ 68 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát các phương pháp chiết tách và nồng độ dung môi chiết ....... 70 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tới việc thu nhận cao chiết tổng.72 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới việc thu nhận cao chiết tổng ................. 73 Bảng 3.14. Ảnh hưởng thời gian chiết rung siêu âm tới việc thu nhận cao chiết tổng........ 75 Bảng 3.15. Khảo sát nhiệt độ chiết có hỗ trợ rung siêu âm ................................................ 76 Bảng 3.16. Giá trị mã hoá và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm ............................. 77 Bảng 3.17. Các thí nghiệm tiến hành và kết quả ................................................................. 78 Bảng 3.18. Kết quả phân tích hồi quy - cao chiết tổng........................................................ 79 Bảng 3.19. Kết quả chiết tách cao chiết tổng theo điều kiện tối ưu .................................... 81 Bảng 3.20. Định lượng saponin thu được trong cao chiết ethanol của tam thất hoang ..... 82 Bảng 3.21. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang ........... 83 Bảng 3.22. Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang trên môi trường thạch.................................................................................................................. 84 Bảng 3.23. Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang trên môi trường lỏng ............................................................................................................ 85 Bảng 3.24. Hoạt tính ức chế tyrosinase của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang ...... 86 Bảng 3.25. Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang ..................................................................................................................... 86 Bảng 3.26. Hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang ............................................................................................................................ 87 Bảng 3.27. Khối lượng cặn chiết từ củ tam thất hoang so với cao tổng ............................ 90 Bảng 3.28. Khối lượng các phân đoạn H1 - H8 .................................................................. 91 Bảng 3.29. Một số giá trị phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) đặc trưng của hợp chất T1 so sánh với phổ của Stigmasterol ............................................................................................. 94 Bảng 3.30. Các giá trị phổ của hợp chất T3 ........................................................................ 99 Bảng 3.31. Các giá trị phổ 1 H NMR, 13 C NMR, HMBC của T4 so sánh với tài liệu tham khảo ........................................................................................................................... 103 Bảng 3.32. Các dữ liệu phổ NMR của T5 và so sánh với tài liệu tham khảo .................... 107 Bảng 3.33. Các dữ liệu phổ của T6 và Panaxytriol trong tài liệu tham khảo ................... 111 Bảng 3.34. Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của chất tinh sạch trong các cao phân đoạn củ tam thất hoang trên môi trường lỏng ............................................................................ 112 Bảng 3.35. Kết quả kháng dòng tế bào KB của các chất sạch trong củ tam thất hoang ...... 113 Bảng 3.36. Kết quả thử độc tính trên chuột thí nghiệm của mẫu bột củ tam thất hoang ........ 114 Bảng 3.37. Các công thức làm bánh cookie ...................................................................... 115 Bảng 3.38. Kết quả phân tích thị hiếu các công thức bánh C1, C2, C3 ............................ 117 Bảng 3.39. Kết quả phép thử so sánh cặp với sản phẩm bánh cookie tam thất ................ 118 Bảng 3.40. Kết quả phân tích thị hiếu sản phẩm bánh cookie tam thất ............................ 119 Bảng 3.41. Kết quả cảm quan thị hiếu nước mật ong - đường pha loãng ......................... 120 Bảng 3.42. Kết quả cảm quan phép thử so hàng sản phẩm nước tam thất mật ong ......... 121 Bảng 3.43. Điểm thị hiếu trung bình sản phẩm nước tam thất mật ong ............................ 121 Bảng 3.44. Kết quả kiểm tra vi sinh sản phẩm nước tam thất mật ong ............................. 122 Bảng 3.45. Kết quả phép thử so sánh cặp đôi với sản phẩm kẹo cứng tam thất ............... 124 Bảng 3.46. Kết quả phân tích thị hiếu với sản phẩm kẹo cứng tam thất ........................... 124 Bảng 3.47. Kết quả phép thử so sánh cặp đối với trà tam thất hoa cúc ............................ 126 Bảng 3.48. Kết quả phân tích thị hiếu sản phẩm trà tam thất hoa cúc ............................. 126 Bảng 3.49. Kết quả định lượng saponin trong 4 sản phẩm bằng HPLC ........................... 127 Bảng 3.50. Phần trăm (%) saponin hao hụt trên sản phẩm .............................................. 128 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây, củ tam thất Trung Quốc ............................................................................... 7 Hình 1.2: Cây, củ sâm vũ diệp .............................................................................................. 7 Hình 1.3: Cây, củ tam thất hoang .......................................................................................... 8 Hình 1.4: Khung genin tìm được trong 3 nhóm chính của saponin ..................................... 11 Hình 1.5: Saponin monodesmosidic..................................................................................... 12 Hình 1.6: Những nhóm chính của sapogenin triterpen ....................................................... 13 Hình 1.7: Các nhóm phổ biến của các sapogenin steroid ................................................... 15 Hình 1.8: Hai nhóm của sapogenin steroid alkaloid ........................................................... 16 Hình 1.9: Cấu trúc saponin triterpenoid ............................................................................. 19 Hình 1.10: Cấu trúc saponin khung dammaran .................................................................. 20 Hình 1.11: Bộ khung carbon của polyacetylen .................................................................... 20 Hình 1.12: Qui trình chiết tách saponin bằng dung môi ethanol ........................................ 39 Hình 2.1: Qui trình thực nghiệm chiết tách các phân đoạn ................................................ 42 Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn D-glucose ............................................................................ 45 Hình 2.3: Đồ thị đường chuẩn axit galic ............................................................................. 46 Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn quercetin ............................................................................. 47 Hình 2.5: Sắc ký đồ saponin mẫu chuẩn phân tích trên HPLC ........................................... 50 Hình 2.6: Qui trình xử lý mẫu phân tích, xác định amino axit bằng HPLC ........................ 51 Hình 2.7: Qui trình xử lý mẫu phân tích axit béo ................................................................ 52 Hình 3.1: Khảo sát các phương pháp chiết tách cao chiết tổng .......................................... 71 Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m) ........................................................... 73 Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol (%) ............................................................. 74 Hình 3.4: Khảo sát thời gian chiết (thời gian rung siêu âm) ............................................... 75 Hình 3.5: Khảo sát nhiệt độ chiết ........................................................................................ 76 Hình 3.6: Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết tách cao chiết tổng ..................... 79 Hình 3.7: Bề mặt đáp ứng của cao chiết tổng ..................................................................... 80 Hình 3.8: Mức độ đáp ứng sự mong đợi quá trình chiết tách cao chiết tổng ..................... 81 Hình 3.9: Qui trình công nghệ chiết tách cao chiết tổng từ tam thất .................................. 82 Hình 3.10: Qui trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang ................ 90 Hình 3.11: Qui trình phân lập các chất từ cao chiết n-hexane ........................................... 91 Hình 3.12: Kết quả chạy cột sắc kí từ cao chiết n-butanol .................................................. 92 Hình 3.13: Kết quả phân lập chất sạch từ 2 phân đoạn HAB2 và HAB3 ............................ 92 Hình 3.14: Phổ 1H NMR của hợp chất T1 ........................................................................... 93 Hình 3.15: Cấu trúc của hợp chất T1 (Stigmasterol) .......................................................... 94 Hình 3.16: Phổ 1H NMR của hợp chất T2 ........................................................................... 95 Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất T2 (axit 5-dodecenoic) .................................................. 95 Hình 3.18: Phổ 1H NMR của hợp chất T3 ........................................................................... 96 Hình 3.19: Phổ 13C NMR của hợp chất T3 .......................................................................... 97 Hình 3.20: Phổ HMBC của hợp chất T3.............................................................................. 98 Hình 3.21: Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol ................................................................. 99 Hình 3.22: Phổ 1H NMR của hợp chất T4 ......................................................................... 100 Hình 3.23: Phổ 13C NMR của hợp chất T4 ........................................................................ 101 Hình 3.24: Phổ HMBC của hợp chất T4............................................................................ 102 Hình 3.25: Cấu trúc của stipudiol (T4).............................................................................. 103 Hình 3.26: Phổ 1H-NMR của hợp chất T5 ......................................................................... 104 Hình 3.27: Phổ 13C-NMR của hợp chất T5 ........................................................................ 105 Hình 3.28: Phổ HSQC của hợp chất T5 ............................................................................ 105 Hình 3.29: Phổ HMBC của hợp chất T5............................................................................ 106 Hình 3.30: Cấu trúc 5-hydroxymetylfurfural ..................................................................... 107 Hình 3.31: Phổ 1H-NMR của hợp chất T6 ......................................................................... 107 Hình 3.32: Phổ 13C-NMR của hợp chất T6 ........................................................................ 108 Hình 3.33: Phổ HSQC của hợp chất T6 ............................................................................ 109 Hình 3.34: Phổ HMBC của hợp chất T6............................................................................ 110 Hình 3.35: Cấu trúc chất Panaxytriol ............................................................................... 111 Hình 3.36: Giải phẫu chuột thử nghiệm độc tính cấp ....................................................... 114 Hình 3.37: Qui trình sản xuất bánh Cookie bổ sung cao tam thất hoang ......................... 116 Hình 3.38: Sản phẩm bánh cookie tam thất ....................................................................... 120 Hình 3.39: Qui trình sản xuất nước mật ong bổ sung cao tam thất hoang ....................... 120 Hình 3.40: Sản phẩm nước tam thất mật ong .................................................................... 123 Hình 3.41: Quy trình sản xuất kẹo cứng bổ sung cao tam thất hoang .............................. 123 Hình 3.42: Sản phẩm kẹo cứng tam thất ............................................................................ 125 Hình 3.43: Qui trình sản xuất trà tam thất hoa cúc túi lọc bổ sung bột tam thất hoang ... 125 Hình 3.44: Sản phẩm trà tam thất hoa cúc ........................................................................ 127 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Tam thất là cây thuộc chi Panax L., họ nhân sâm (Araliaceae) trong thực tế có rất nhiều loài thuộc các họ cây khác nhau đều có tên là tam thất. Việc phân loại tam thất trên thị trƣờng còn có nhiều sự nhầm lẫn do chỉ dựa vào kinh nghiệm và tên gọi. Ở Việt Nam hiện nay cây tam thất thuộc họ nhân sâm là loài dƣợc liệu quí, chúng có chứa các hoạt chất nhƣ saponin, polyacetylen…mặt khác các loại tam thất đƣợc bán trên thị trƣờng rất đa dạng và có nguồn gốc xuất xứ khác nhau: Trung Quốc, Ấn Độ, Nêpan, Nhật Bản và Triều Tiên… để xác định đƣợc tên, loài và phân loại tam thất cần dựa vào tên khoa học của chúng. Nhờ vào sự phát triển của khoa học và công nghệ các phƣơng pháp nghiên cứu hiện đại, tiên tiến đƣợc ứng dụng làm công cụ nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy trong cây tam thất có chứa hàm lƣợng lớn các chất saponin và polyacetylen. Các hoạt chất này có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng, ức chế và tiêu diệt quá trình phát triển của tế bào ung thƣ, kháng nấm và kháng khuẩn, tăng khả năng tuần hoàn máu, hạn chế tác dụng phụ do tia xạ. Chính vì vậy việc nghiên cứu chiết tách các hoạt chất trong cây tam thất so sánh với các loại tam thất khác là việc làm cần thiết nhằm mục tiêu nâng cao giá trị kinh tế của cây tam thất Việt Nam, tạo tiền đề cho việc ứng dụng các hoạt chất có trong cây để sản xuất thực phẩm chức năng cũng nhƣ ngành công nghiệp khác… Ở nƣớc ta, có nhiều vùng trồng tam thất và tam thất mọc tự nhiên nhƣ: Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác và sử dụng tam thất trong nƣớc còn hạn chế vì chƣa có nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh về thành phần hoá học các hoạt chất, tác dụng sinh học của tam thất, đặc biệt là loài tam thất hoang của Việt Nam. Tam thất Việt Nam chủ yếu đƣợc khai thác để xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung Quốc làm thuốc chữa bệnh. Nƣớc ta chủ yếu nhập khẩu Tam thất trồng ở Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) về làm thuốc chữa bệnh, pha chế mĩ phẩm và làm thực phẩm bổ dƣỡng cơ thể. Chính vì vậy đã làm thất thoát nguồn tài nguyên lớn của đất nƣớc. Nếu có những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, hàm lƣợng các hoạt chất trong cây tam thất Việt Nam, từ đó có giải pháp trồng và khai thác để góp phần ổn định nguồn nguyên liệu, chắc chắn nâng cao đƣợc vị thế của cây dƣợc liệu quí này giúp cải thiện đáng kể về kinh tế cho đất nƣớc. Cho tới nay, việc khai thác hoạt chất saponin và polyacetylen trong củ tam thất đã và đang đƣợc nghiên cứu theo các phƣơng pháp chiết tách khác nhau, phƣơng pháp nghiên 2 cứu chiết tách với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm cho lƣợng chất tổng số lớn với đầy đủ các hoạt chất nhờ vào phƣơng pháp sắc ký hiện đại mà sản phẩm chất tách ra có độ tinh khiết cao từ đó biết đƣợc những hoạt chất có hoạt tính sinh học mở ra khả năng ứng dụng trong công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt hơn với chất lƣợng cao hơn. Xuất phát từ thực tế và sự cấp thiết trên, đề tài:“Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” đã đƣợc lựa chọn để nghiên cứu với mục tiêu và nội dung sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu, xác định các loài tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam. - Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dƣỡng, đồng thời đánh giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học của cao chiết từ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai. - Đánh giá khả năng ứng dụng củ tam thất trong một số sản phẩm công nghệ thực phẩm. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ba loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng. - Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loại củ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai, Việt Nam: protein, lipid, carbohydrate, thành phần amino axit, axit béo, nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng, phenol tổng, flavonoid tổng, polyacetylen và saponin). Từ đó đánh giá chất lƣợng củ tam thất hoang của Việt Nam (Panax stipuleanatus). - Xác lập qui trình thu nhận cao tam thất từ củ tam thất hoang bằng phƣơng pháp chiết tách với ethanol, xác định cấu trúc các hoạt chất và hoạt tính sinh học các chất trong cao chiết tam thất hoang (Panax stipuleanatus). - Nghiên cứu ứng dụng tam thất hoang vào sản phẩm trong ngành công nghệ thực phẩm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học - Đã nghiên cứu thành phần hoá học trong củ của 3 loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) đƣợc nghiên cứu đầy đủ về thành phần và hoạt tính sinh học là những đóng góp đáng tin cậy, làm phong phú thêm nguồn tƣ liệu khoa học về cây tam thất đặc thù của Việt Nam. - Đã xây dựng đƣợc qui trình công nghệ chiết tách hoạt chất trong củ tam thất hoang, tối ƣu hoá qui trình chiết tách. - Phân lập và xác định đƣợc 6 hợp chất có trong củ loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus) trồng ở Sapa, Việt Nam, trong đó đã tìm ra 1 chất mới thuộc nhóm polyacetylen. 3 - Đã xác định đƣợc tác dụng sinh học của chất phân lập (chất tinh sạch): Tác dụng chống ung thƣ trên các dòng tế bào ung thƣ LU-1, HepG2, SK-MEL2, MCF7, KB; tác dụng kháng sinh. - Xác định đƣợc liều gây độc tính cấp của bột củ tam thất hoang trên chuột thí nghiệm. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Dựa vào kết quả xác định đƣợc lƣợng cao chiết tổng, hoạt tính sinh học của cao phân đoạn trong củ tam thất giúp định hƣớng bảo tồn và khai thác một cách hợp lý tam thất theo các mục đích khác nhau nhằm đạt hiệu quả cao nhất. - Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xây dựng cơ sở cho việc sản xuất các sản phẩm giàu hoạt chất có tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. - Với qui trình chiết tách thu nhận cao tam thất đƣợc nghiên cứu thu đƣợc chế phẩm có hàm lƣợng cao. - Sản phẩm thực phẩm: bánh cookie tam thất, nƣớc tam thất mật ong, kẹo cứng tam thất và trà tam thất hoa cúc là những sản phẩm thực phẩm tốt, có thể xem nhƣ là loại thực phẩm chức năng có giá trị với sức khỏe, điều này sẽ hấp dẫn ngƣời sử dụng. - Tài liệu tham khảo, cũng nhƣ các kết quả nghiên cứu đầy đủ về cây, củ tam thất và các sản phẩm từ tam thất là một tài liệu tham khảo khoa học tốt cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này. 4.3. Những điểm mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dƣỡng (protein, lipid, carbohydrate, thành phần amino axit, axit béo, nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng, phenol tổng, flavonoid tổng và saponin) của ba loại củ tam thất ở Lào Cai (Việt Nam). Đặc biệt các hoạt chất sinh học của củ tam thất hoang đƣợc nghiên cứu. Từ đó đánh giá đƣợc chất lƣợng củ tam thất hoang (Panax stipuleanatus) so với hai loài tam thất khác (Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng). - Thiết lập đƣợc qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ tam thất hoang, hàm lƣợng cao thu đƣợc là 15,00 ± 0,02%. Từ cao chiết tổng đã tinh sạch và xác định cấu trúc của 6 hợp chất trong củ tam thất hoang là stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic (T2), stipudiol (T4), 5hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6) và đặc biệt có một chất mới là Heptadeca-8en-4,6-diyne-3,10-diol (T3). Trong đó, T3, T4 và T6 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB. - Từ chế phẩm bột và cao chiết tổng của củ tam thất hoang đã tạo ra đƣợc một số sản phẩm thực phẩm nhƣ: bánh cookie tam thất, nƣớc tam thất mật ong, kẹo cứng tam thất và trà tam thất hoa cúc có tính chất cảm quan hấp dẫn ngƣời tiêu dùng. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY TAM THẤT 1.1.1. Tên gọi và nguồn gốc cây tam thất 1.1.1.1. Đặc điểm tam thất thuộc chi Panax L.[11],[24], [25], [70], [146] Tam thất còn gọi là sâm tam thất. Cây tam thất ở Việt Nam thuộc chi Panax L., họ ngũ gia bì (nhân sâm) (Araliaceae). Tất cả các loài thuộc chi này đều có giá trị làm thuốc, đặc biệt là tam thất. Cây tam thất có chứa nhiều hoạt chất quí có tác dụng sinh học tốt nhƣ nhóm chất saponin, polyacetylen và nhiều axit amin không thay thế. Ở Việt Nam, hiện có 5 loài thuộc chi Panax L.. Trong đó có 3 loài mọc tự nhiên là sâm Vũ diệp (Panax bipinnatifidus), tam thất hoang (Panax stipuleanatus) và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis). Hai loài nhập trồng là tam thất (Panax pseudoginseng Wall) và nhân sâm (Panax ginseng Meyer). Cây đƣợc tìm thấy nhiều ở vùng núi cao từ 1200 - 2400 m có khí hậu mát và độ ẩm cao. Theo Linnaeus (1753), chi Panax gồm nhiều loài dựa trên hình thái học của hoa, trong đó sâm Mỹ (Panax quinquefolius) đƣợc dùng làm chuẩn. Những nghiên cứu sau này (Candolle, 1830) mô tả nhiều loài thuộc họ nhân sâm trong Panax. Seemann (1868) thu hẹp định nghĩa Panax thành nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt có răng cƣa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa năm lá đài, bầu nhuỵ có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín có màu đỏ hoặc cam, có 2 - 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ thuộc năm sinh trƣởng. Khái niệm này đƣợc chấp nhận bởi các công trình nghiên cứu sau này [148]. Nghiên cứu di truyền học tế bào cho thấy P. ginseng, P. japonicus và P. quinquefolius là tứ bội 4n = 48, trong khi P. pseudoginseng, P. notoginseng và P. trifolius là lƣỡng bội 2n = 24. Vùng phân bố của chi này ở Bắc Bán Cầu, từ Himalaya đến Đông Bắc Trung Quốc, vùng Viễn Đông nƣớc Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Sâm có tác dụng tốt và đƣợc nhiều ngƣời ƣa dùng, cho nên một số loài Nhân sâm đã đƣợc trồng hàng nghìn hec ta tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Bắc Mỹ. Sâm Mỹ (Panax quinquefolius), ngoài mọc hoang tại vùng Đông Bắc, từ miền Nam Quebec đến Minnesota và miền Nam từ Oklahoma đến bang Georgia, hiện nay còn đƣợc trồng nhiều tại Ontario và British Colombia (Canada) và khắp Nhật Bản. Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis), còn gọi là sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5) hay cây thuốc giấu, là loại sâm quý đƣợc tìm thấy tại miền Trung Trung Bộ Việt Nam, mọc tập trung ở các huyện miền núi Ngọc Linh thuộc huyện Đăk Tô tỉnh Kon Tum, huyện Trà My tỉnh Quảng Nam. Các nhà khoa học đang thử nghiệm di thực và trồng sâm Việt Nam ở vùng núi cao từ 1700 - 2200 m so với mực nƣớc biển. 5 1.1.1.2. Phân loại các loài trong chi Panax L. [11], [32], [33], [70], [146] Chi Panax thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa (Magnoliophyta), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Nhân sâm (Araliaceae). Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu nhất định về các loài thuộc chi Panax. Kể từ năm 1942 cho đến thời gian gần đây, sự phân loại đã có những thay đổi đáng kể. Trong đó, hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11 loài và 1 thứ loài của chi Panax L. [147]. Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax L H. L. Li (1942) P. schinseng Nees P. pseudoginseng Wall H. Hara (1970) P. ginseng C. A. Mey P. pseudoginseng Wall P. subsp. Pseudoginseng P. subsp. Japonicas C. Hoo (1973) P. ginseng C. A. Mey P. pseudoginseng Wall P. var. pseudoginseng p.var.notoginseng (Burk) Hoo et Tseng P.var. japonicus C. Y. Wu (1978) P. ginseng C. A. Mey P. pseudoginseng Wall P. ginseng C. A. Mey P. pseudoginseng Wall P. notoginseng (Burk) Chen P. notoginseng (Burk) Chen P. japonicus C. A. Mey P. japonicus C. A. Mey P.var. wangianus (Sun) Hoo et Tseng P. var. major (Burk) Li P.var. angustifolius (Burk) Li Jun Wen (2001) P. wangianus S. C. Sun P.var. angustatus (Makino) Hara P. subsp. P. var. elagantior P. var. major Himalaycus Hara (Burk) Wu et Feng (Burk) P. bipinnatifidus Seem P.var.angustifolius (Burk) Jun Wen P. stipuleanatus Tsai et Feng P. zingiberensis C. Y. Wu et K. M. Feng P. stipuleanatus Tsai et Feng P. zingiberensis C. Y. Wu et K. M. Feng P. trifolius L. P. quinquefolius L. P. vietnamensis Ha et Grushv