Tài liệu Nghiên cứu chiết tác enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Đàm Thanh Xuân 2. DS. Đinh Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Đinh Thu Hương, những người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Đinh Thị Thanh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 2 1.1. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật.............. 2 1.1.1. Enzym vi sinh vật ........................................................................................ 2 1.1.2. Chiết xuất và thu nhận enzym từ vi sinh vật ................................................ 3 1.1.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym........................................................ 6 1.1.4. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus ................................................................................................. 6 1.2. Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto .......................................................................................................... 9 1.2.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis natto ........................................................... 9 1.2.2. Đặc điểm của protease ngoại bào của B. subtilis natto .............................. 10 1.2.3. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto ........ 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ......................................................................... 14 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ..................................................................................... 14 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng ................................................................... 14 2.1.3. Môi trường ................................................................................................. 14 2.1.4. Máy móc và dụng cụ .................................................................................. 14 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 15 2.2.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto ........................................ 15 2.2.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được ............. 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu …........................................................................ 15 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto ........................ 15 2.3.2. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym ..................................... 16 2.3.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease .... 17 2.3.4. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protease ............................................ 17 2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease ............ 19 2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE ............................................................. 21 2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin ........................................ 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN............................. 22 3.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto………… .......................... 22 3.1.1. Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto ................................................................................................................... 22 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B. subtilis natto ............................................................................................... 23 3.1.3. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis natto ................................................................................................... 26 3.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được................ 32 3.2.1. Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75 ......... 32 3.2.2. Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế .......................................... 36 3.2.3. Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu ........................... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS : Amoni sulfat bh : bão hòa CM : Carboxymethyl Sắc kí trao đổi ion CM : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi là cation carboxymethyl CMC : Carboxy methyl cellulose DEAE : Diethylaminoethyl Sắc kí trao đổi ion DEAE : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi là anion diethylaminoethyl E : Enzym FU : Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu) kDa : kilo Dalton mBar : mili Bar N0 : Lần thí nghiệm nKat : nano Katal pI : Điểm đẳng điện của protein Quy mô PTN : Quy mô phòng thí nghiệm SDS : Sodium dodecyl sulfat (Natri dodecyl sulfat) SDS – PAGE : Sodium dodecyl sulfat – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di SDS – PAGE : Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri dodecyl sulfat TLPT : Trọng lượng phân tử t – PA : Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen ở mô) UF : Mảng siêu lọc Ultra Filtration DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Các phương pháp sắc kí 5 Bảng 1.2: Các loại gel Sephadex 5 Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus 7 Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto 8 12 Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất 14 Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng 15 Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzym trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease của dịch trong Bảng 3.3: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ 22 24 26 Bảng 3.4: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng 27 độ amoni sulfat bão hòa khác nhau Bảng 3.5: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym khi chiết xuất với các 29 nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau Bảng 3.6: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ protease của các dịch enzym thu được theo quy 31 trình kết tủa phân đoạn Bảng 3.7: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân đoạn thu được sau tinh chế 33 Bảng 3.8: Đánh giá sự có mặt của α – amylase và cellulase trong các phân đoạn 34 Bảng 3.9: Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease 35 Bảng 3.10: Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease Hình 1.2: Năng suất và mức tinh sạch của protease chiết xuất từ môi trường nuôi cấy B. subtilis Hình 1.3: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto Hình 3.1: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein tại các giá trị pH khác nhau Hình 3.2: Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret Trang 6 9 9 10 24 26 Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni 28 sulfat bão hòa khác nhau Hình 3.4: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzym protease của các phân đoạn và thể tích rửa giải (Ve ) Hình 3.5: Kết quả điện di SDS – PAGE 34 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả tốt. Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin, tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. [55] Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym protease có khả năng phân giải fibrin [53]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [31], elastase [62], bacillopeptidase F [64]… Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.3. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 1.3.1. Enzym vi sinh vật Enzym là các chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có bản chất là protein; có ở trong tất cả các tế bào sống và có thể duy trì được hoạt tính xúc tác sau khi tách ra khỏi cơ thể sống (ở những điều kiện nhất định). [2],[8],[14] Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzym bằng phương pháp hóa học (các synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzym hiện nay vẫn được chiết tách từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật. [3],[8] Vi sinh vật là nguồn thu enzym rất phong phú trong đó có những enzym mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể tác động vào vi sinh vật để thu được enzym theo ý muốn. Mặt khác enzym vi sinh vật thường có hoạt tính mạnh. [14],[17],[36] Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ yếu:  Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật  Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym  Chiết tách và thu nhận enzym  Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến nạp, tải nạp, tiếp hợp gen). [14],[17],[36] Quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc phương pháp nuôi cấy chìm. Cần lựa chọn thành phần môi trường dinh dưỡng (đặc biệt là các chất cảm ứng); kiểm soát các thông số 3 của quá trình nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, chế độ cấp khí… để quá trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật được diễn ra trong điều kiện tối ưu. [14],[17],[36] 1.3.2. Chiết tách và thu nhận enzym từ vi sinh vật Các bước của quá trình chiết tách và tinh sạch enzym từ vi sinh vật được tiến hành như sau: a) Phá vỡ tế bào Thực hiện với các enzym tập trung chủ yếu ở trong tế bào vi sinh vật (enzym nội bào). Đối với các enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường nuôi cấy (enzym ngoại bào) có thể bỏ qua bước này. Các phương pháp hay được sử dụng để phá vỡ tế bào: phương pháp cơ học (sử dụng sóng siêu âm, máy đồng hóa cao áp…); các phương pháp khác (sốc thẩm thấu, xử lý kiềm, sử dụng các chất tẩy rửa, dung giải bằng enzym, phương pháp “tự phân”…). Đối với những enzym tồn tại ở dạng gắn chặt vào màng tế bào thì phải sử dụng các chất tẩy không phân cực để tách enzym ra khỏi màng. [6],[14],[26],[36] b) Chiết tách enzym Sử dụng dung môi để chiết tách enzym như: nước, acid, kiềm loãng, dung dịch đệm, dung môi hữu cơ. Nếu dịch chiết enzym có nồng độ thấp có thể cô đặc để tăng nồng độ enzym. Thông thường, người ta hay dùng các dung dịch đệm có lực ion và pH thích hợp để chiết tách enzym [3],[14]. Sau khi chiết tách tiến hành các bước sau: Tách các phần tử không hòa tan: Dùng kỹ thuật li tâm, lọc. [6],[14],[36] Loại các thành phần không phải protein: Chất phân tử lượng thấp (thẩm tích, lọc gel, siêu lọc); acid nucleic (thủy phân bằng nuclease, protease); lipid (sử dụng dung môi hữu cơ). [6] Tách phân đoạn protein và enzym: Tùy theo đặc tính của enzym như trọng lượng phân tử, điện tích hay tính ổn định mà có các kỹ thuật tách chiết và tinh chế khác nhau [3],[14]. Các nhóm phương pháp cụ thể thường được sử dụng bao gồm:  Kết tủa enzym: Do đa số các enzym có bản chất là protein nên có thể sử dụng các yếu tố như pI, lực ion, trọng lượng phân tử… để kết tủa enzym từ dịch 4 chiết. Phương pháp thường được sử dụng để kết tủa enzym là phương pháp diêm tích và phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. [5],[6],[36] Phương pháp diêm tích: Enzym có thể được kết tủa bằng muối do hiện tượng “salting out” (tính tan của protein enzym giảm mạnh ở nồng độ muối cao). Mỗi enzym có một khoảng nồng độ muối mà enzym đó bị kết tủa hoàn toàn gọi là khoảng nồng độ muối tách; do đó nên tiến hành kết tủa phân đoạn nhằm thu được enzym mong muốn [6],[14],[26]. Các loại muối được dùng để kết tủa enzym theo phương pháp này bao gồm: amoni sulfat, magnesi sulfat, natri sulfat… trong đó amoni sulfat hay được sử dụng nhất do có một số ưu điểm sau: + Amoni sulfat có mức độ hòa tan rất cao trong nước (720g/l ở 250C). + Ít làm mất hoạt tính enzym, có thể có tác dụng làm bền enzym. + Có khả năng kết tủa chọn lọc protein enzym khi bổ sung từ từ muối vào dịch chiết enzym thô [3]. Một ưu điểm khác của amoni sulfat là giá thành thấp [5]. Tuy nhiên, kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat còn có một số nhược điểm như: mất nhiều thời gian; nồng độ muối sử dụng thường cao nên tỷ trọng của dung môi lớn, để thu được protein enzym cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp. Mặt khác, cần tiến hành tinh chế loại muối ra khỏi tủa enzym bằng phương pháp thẩm tích hoặc sắc kí lọc gel. [3],[26] Phương pháp kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: Dung môi hữu cơ (có khả năng trộn lẫn với nước) được thêm vào dịch chiết enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết tủa. Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol. Để hạn chế ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của enzym cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới 0 0C). [5],[6],[14] Ngoài ra khi kết tủa enzym còn sử dụng các phương pháp khác như: kết tủa enzym tại điểm đẳng điện, sử dụng các chất trợ (tinh bột, lactose) để cho tủa enzym tạo thành ở dạng hạt hay sử dụng dung dịch polymer để kết tủa enzym. [14]  Phương pháp sắc kí: Nguyên tắc của sắc kí trong chiết tách và tinh sạch enzym là tách các enzym khác nhau từ dịch chiết dựa vào bản chất các liên kết của 5 phân tử enzym đó. Các enzym khác nhau sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và enzym; do đó có thể tách riêng được enzym. Một số loại sắc kí và nguyên lí tách được trình bày trên bảng 1.1. [5],[6],[14],[17],[26],[36] Bảng 1.1: Các phương pháp sắc kí Loại sắc kí Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Lọc gel Ái lực Kị nước Đồng hóa trị Tạo vòng kim loại Tương tác đặc hiệu sinh học Nguyên lí Liên kết bề mặt Cân bằng phân bố Liên kết ion Khuếch tán lỗ Hấp phụ đặc hiệu Tương tác kị nước Liên kết đồng hóa trị Tạo phức Tương tác sinh học đặc hiệu (enzym – cơ chất) Tách theo Ái lực bề mặt Tính phân cực Điện tích Kích thước, hình dạng phân tử Cấu trúc phân tử Cấu trúc phân tử Tính phân cực Cấu tạo phân tử Cấu trúc phân tử Quá trình chiết tách và tinh chế enzym thường sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel (sắc kí lọc rây phân tử). Mỗi loại gel thường có khả năng tách và tinh chế các enzym có trọng lượng phân tử nằm trong một khoảng giới hạn thích hợp. Gel được sử dụng rộng rãi nhất là gel Sephadex. Gel Sephadex có đặc điểm là trung hòa về điện tích nên không có tương tác anion và cation. Dựa vào kích thước mắt lưới của mạng lưới rây phân tử và phạm vi phân tách các chất theo trọng lượng phân tử, Sephadex được chia thành 5 loại theo bảng 1.2. Chỉ số càng nhỏ thì kích thước mắt lưới gel càng nhỏ. [14],[17],[36],[42] Bảng 1.2: Các loại gel Sephadex Loại gel Sephadex G – 25 G – 50 G – 75 Phạm vi phân tách theo TLPT (kDa) 0,1 – 5 5 – 10 10 – 50 Loại gel Sephadex G – 100 G – 200 Phạm vi phân tách theo TLPT (kDa) 50 – 100 100 – 200  Các phương pháp khác để tách chiết và tinh chế enzym như: phương pháp kết tinh; phương pháp phân tách lỏng – lỏng; phương pháp gây biến tính chọn lọc protein sử dụng acid, kiềm hoặc nhiệt độ; phương pháp siêu li tâm; phương pháp 6 điện di không gây biến tính protein. Sau khi tách chiết và tinh chế, dịch enzym thu được có thể được cô đặc bằng phương pháp siêu lọc, đông khô hoặc cô chân không. [3],[14] 1.3.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym Điện di trên gel polyacrylamid biến tính có mặt SDS (SDS – PAGE): là phương pháp hay được sử dụng nhất. Phương pháp này sử dụng gel và đệm có chứa SDS. Dưới tác dụng của SDS, các protein enzym sẽ bị duỗi thẳng, tích điện âm và di chuyển về phía cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của protein enzym. Dựa vào các băng điện di xuất hiện trên điện di đồ sau khi nhuộm màu để kiểm tra mức độ tinh sạch của chế phẩm. [14] Ngoài ra có thể dùng một số phương pháp khác như: phương pháp phối hợp điện di với sắc kí lọc gel; điện di gel hoạt tính; kỹ thuật phân tích khối phổ hay xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzym. [3],[6],[14] 1.3.4. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus Hiện nay, các enzym vi sinh vật được sử dụng ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực; trong số đó có các enzym nhóm protease. a) Khái niệm về protease Nhóm enzym protease là các enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid (– CO – NH –) giữa các L – acid amin trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các L – acid amin (hình 1.1). Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. [12] H2O H2N – CH – CO – NH – CH – CO – …. – NH – CH – COOH R1 R2 Rx Protease H2N – CH – COOH + H2N – CH – CO … NH – CH – COOH R1 R2 Rx Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzym [2]. Có nhiều cách phân loại protease: 7 + Phân loại theo pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzym, protease được chia thành 3 nhóm: protease acid (pH hoạt động từ 2 – 4); protease trung tính (pH hoạt động từ 7 – 8); protease kiềm (pH hoạt động từ 9 – 11). [12] + Phân loại theo vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease được chia thành hai loại: endopeptidase (protease thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid) và exopeptidase (protease phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid) [12]. Các endoprotease có nhóm OH của Ser đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác được gọi là protease serin. Trong protease serin có hai họ được nghiên cứu nhiều là: chymotrypsin và subtilisin. Đa số protease họ subtilisin có nguồn gốc từ vi khuẩn như: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN ... [12],[55] b) Protease ngoại bào của chi Bacillus và các phương pháp chiết tách Chi Bacillus là chi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp; sản lượng protease trên 100 tấn/năm [14],[36]. Các sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus và một số ứng dụng của chúng được đưa ra trong bảng 1.3. Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus [55] Nhà sản xuất Tên thương mại Nguồn vi sinh vật Rohm, Đức Corolase 7089 Bacillus subtilis Nagase Biochemicals, Nhật Bản Bioprase concentratre Cryst. Protease Cryst. Protease Bioprase B. subtilis (K2) B. subtilis (bioteus) B. subtilis Bioprase SP – 10 B. subtilis Alcalase Savinase Durazym Nue B. licheniformis Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Novo Nordisk, Đan Mạch B. subtilis Ứng dụng Công nghiệp thực phẩm Mỹ phẩm, dược phẩm Nghiên cứu khoa học Nghiên cứu khoa học Chất tẩy rửa Công nghiệp thực phẩm Chất tẩy rửa Công nghiệp dệt may Chất tẩy rửa Công nghiệp thuộc da Hiện nay, quy trình chiết tách protease ngoại bào của chi Bacillus vẫn được nghiên cứu cả trên quy mô PTN và quy mô công nghiệp. 8  Quy mô PTN: Quy trình chiết tách protease ngoại bào của loài Bacillus subtilis thuộc chi Bacillus được nghiên cứu nhiều (bảng 1.4). Phương pháp chiết tách hay được sử dụng là kết tủa bằng amoni sulfat 40 – 80% bão hòa; tinh chế bằng phương pháp thẩm tích và sắc kí. Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis Trích dẫn 1. E. M. El - Safey (2004) [30] Phương pháp chiết tách Tủa enzym: AS 40% bh 2. Sadia Almas (2009) [23] Tủa enzym: AS 70% bh 3. Ishtiaq Ahmed (2011) [22] Kết tủa loại protein tạp: AS 40% bh Tủa enzym: AS 70% bh Tủa enzym: AS 50% bh 4. Ravi Sankar (2012) [59] 5. F. Mashayekhi Mazar (2012) [43] 6. Do Thi Bich Thuy (2011) [27] Hệ 2 pha: PEG 10.000 22%; citrat 18% Tủa enzym: Ethanol 75% Tinh chế và xác định TLPT Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 200 Thẩm tích Sắc kí trao đổi ion (DEAE) Sắc kí kị nước Phenyl Sepharose Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100 Điện di SDS – PAGE Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100 Sắc kí trao đổi ion (DEAE) Điện di SDS – PAGE Điện di SDS – PAGE Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Điện di SDS – PAGE Hiệu quả và mức tinh sạch của chế phẩm enzym so với dịch chiết enzym thô ban đầu của một số quy trình chiết tách protease theo thứ tự trong bảng 1.4 (từ quy trình 1 đến 5) được thể hiện trên đồ thị hình 1.2. Nhìn chung, hiệu quả của quy trình chiết tách trên quy mô PTN sử dụng phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat (thứ tự từ 1 đến 4) thường nhỏ hơn 10%. [30],[23],[22],[59],[43],[27] Ở Việt Nam, ngoài nghiên cứu của Do Thi Bich Thuy, Trần Thị Hồng Nghi bước đầu đã nghiên cứu khả năng ứng dụng protease của B. subtilis làm chất thủy phân phụ phẩm trong công nghiệp thủy sản với kết quả khả quan. [9] 9 Giá trị 45 39.7 40 35 30 Hiệu suất quy trình (%) 25 20 15 10.52 13.7 11.18 Mức tinh sạch của chế phẩm (lần) 10 5 8 7.87 3.11 4.8 7.3 1.49 0 0 1 2 3 4 5 Các nghiên cứu theo 6 thứ tự bảng 1.4 Hình 1.2: Hiệu quả và mức tinh sạch của protease chiết tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis  Quy mô công nghiệp: Quy trình chiết tách một enzym ngoại bào họ subtilisin của Bacillus sp. theo phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat trên quy mô công nghiệp được thể hiện trên hình 1.3. Trong quy trình này, mầm kết tinh được thêm vào để tủa tạo thành dưới dạng tinh thể. Sản phẩm là subtilisin dưới dạng muối halogen. [17],[36],[55] Lên men Nước rửa Mầm kết tinh Muối Siêu lọc, cô đặc Tách tế bào, thu dịch trong Kết tinh Dung môi Lọc ép Sản phẩm Chất thải Hình 1.3: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen 1.4. Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 1.4.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis natto Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus subtilis var. natto Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905. [57] 10 a) Phân loại khoa học Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29]. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto. [29],[57] Khi mới được phát hiện ra, Bacillus natto được coi như là một loài vi sinh vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. nato và B. subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [61],[65]; các khóa phân loại đã xếp B. subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [57]. Trong dòng B. subtilis natto còn có nhiều loại như B. subtilis natto B – 12 [67], B. subtilis natto OK2 [24] … b) Đặc điểm của B. subtilis natto B. subtilis natto là trực khuẩn hình que, dị dưỡng, hiếu khí, bắt màu Gram (+), nội bào tử hình que có kích thước dưới 1µm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi (hình 1.4). B. subtilis natto phát triển tối ưu trong khoảng nhiệt độ từ 37 – 430C, pH trung tính. Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế bởi nhiệt độ lớn hơn 55 0C và pH ≤ 4,5. B. subtilis natto có khả năng sinh bào tử và nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 400C. [57] Bào tử Tế bào vi khuẩn Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto [75] 1.4.2. Đặc điểm của protease ngoại bào của B. subtilis natto Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzym γ– transpeptidase theo Noda năm 1989 [50] và Ogawa năm 1991 [70]; amylase theo K. Yamane năm 1974 [40]; phytase theo M. Shimizu năm 1992 [58]; cellulase theo 11 Sun Yan năm 2011 [63]; và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease. [31],[39],[44],[64],[67],[71] B. subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis. Protease ngoại bào của loài B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử. Hai protease chính được sản xuất trong thời gian này là protease serin kiềm (subtilisin) và protease trung tính. [52],[56] Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis natto như sau:  Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7kDa đến 29kDa; pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 – 10, nhiệt độ <500C; được hoạt hóa bởi Zn2+; bị bất hoạt bởi điều kiện pH <5, nhiệt độ ≥700C và các ion Fe3+, Al3+. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp. Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – pNA. [31],[67]  Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7 [62]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50 0C; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại. [44]  Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His, Asp. [64]  Protease serin có TLTP 90kDa: có TLPT khoảng 90kDa; pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym là 10 và 55 0C, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser 259. [39],[71] 1.4.3. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B. subtilis natto trên quy mô PTN được nêu ra trong bảng 1.5. Phương pháp chiết tách hay dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa. Tinh chế bằng cách kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Nhìn chung hiệu quả và mức tinh sạch enzym 12 sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto đã cho thấy vi khuẩn này có nhiều tiềm năng ứng dụng sản xuất protease phục vụ cho công nghiệp dược phẩm. [57] Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto Trích dẫn Phương pháp chiết tách Tetsuya Kato Tủa enzym: AS 65% bh (1992) [39] Fujita M. (1993) [31] Sumi H. (1999) [62] Muramatsu K. (2000) [44] Huang Jun (2005) [35] Tách lấy E thô: NaCl 0,9% Kết tủa loại tạp: AS 25% bh Tủa enzym: AS 60% bh Tách lấy E thô: NaCl 0,9% Kết tủa enzym ở pI = 8,7 Tủa enzym: AS 60% bh Tủa enzym: AS 60% bh S. Tokudome Tách lấy E thô: nước (2005) [64] Loại tạp: siêu lọc Làm giàu protein: cô dưới áp suất giảm. Cong Wang Tủa enzym: AS 30 – 60% (2009) bh [67] Xiaoyan Zu (2010) [73] Guang C. (2012) [32] Tách lấy E thô: NaCl 0,9% Kết tủa enzym: Ethanol 95%; AS 20% bh Tủa enzym: AS 30 –70% bh Phương pháp tinh chế Sắc kí trao đổi ion Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl, Butyl – toyopearl HW – 50F Sắc kí lỏng hiệu năng cao Thẩm tích Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl Sắc kí trao đổi ion CM – toyopearl Sắc kí lọc gel Sephadex G – 50 Sắc kí lọc gel Điện di SDS – PAGE Thẩm tích; Sắc kí trao đổi ion Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Hiệu quả: 10%. Mức tinh sạch: 46,5 Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Sắc kí trao đổi ion Hiệu quả: 77%. Mức tinh sạch: 6,27 Sắc kí kị nước Butyl – Toyopearl Quá trình tinh chế được lặp lại nhiều lần Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Sắc kí kị nước Phenyl Sepharose Hiệu quả: 43,2%. Mức tinh sạch: 56,1 Siêu lọc qua màng UF-1, UF-5 OPS Đông khô thu chế phẩm enzym. Hiệu quả: 0,18% Sắc ký lọc gel Sephadex G – 50 Hiệu quả: 42,1%. Mức tinh sạch: 19