Tài liệu Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng trực khuẩn mủ xanh [tt]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch Mã số: 62.72.01.09 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2013 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ VĂN ĐÔNG TS. LÊ THU HỒNG Phản biện 1: GS.TS Văn Đình Hoa – Đại học Y Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Văn Huệ - Học viện Quân y Phản biện 3: PGS.TS. Lê Văn Phủng – Trung tâm Quốc gia kiểm định vắc-xin và sinh phẩm y học Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Học viện Quân y vào ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Viện Thông tin-Thư viện Y học Trung Ương - Thư viện Học viện Quân y -1ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nan giải lớn cần được giải quyết. Trong số các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, trực khuẩn mủ xanh (TKMX) (Pseudomonas aeruginosa) chiếm tỷ lệ cao, thậm chí chiếm tỷ lệ cao nhất ở các nước đang phát triển. Vi khuẩn này có khả năng chịu đựng cao với các yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng. Vì vậy, nhu cầu thực tiễn đòi hỏi cần có các biện pháp điều trị hiệu quả hơn như sử dụng huyết thanh kháng TKMX. Công nghệ chế tạo kháng huyết thanh truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở người thường sử dụng các động vật lớn có vú như ngựa, cừu. Tuy nhiên công nghệ này có nhược điểm là kích thước động vật lớn, đòi hỏi lượng kháng nguyên để gây miễn dịch phải nhiều; để có kháng thể phải lấy máu động vật để tách huyết thanh hoặc huyết tương rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp; việc lấy máu động vật không được thường xuyên, từ đó ảnh hưởng đến sản lượng kháng thể thu được từ mỗi cá thể động vật không nhiều. Loài gà có khả năng sinh kháng thể tương tự như động vật có vú. Trong số các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng, được gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng do chúng đẻ ra là có kháng thể đặc hiệu, từ đó có thể dùng công nghệ này để sản xuất lượng lớn kháng thể với giá thành rẻ dùng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng như cho người. 2. Mục tiêu của đề tài 1) Chế tạo globulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng gà (kháng thể IgY) kháng một số chủng trực khuẩn mủ xanh lưu hành tại Việt Nam bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà mái, thu hoạch kháng thể từ trứng gà. 2) Đánh giá hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh của kháng thể IgY trên in vitro và trên vết thương nhiễm trực khuẩn mủ xanh thực nghiệm. -23. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Đề tài triển khai áp dụng thành công một công nghệ mới, công nghệ chế tạo IgY, phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam và Căm-Pu-Chia, để tạo ra một chế phẩm kháng thể dùng dưới dạng dung dịch rửa hoặc tẩm đắp vết thương để dự phòng và điều trị vết thương, vết bỏng nhiễm TKMX, phục vụ cho công cuộc kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện do loài vi khuẩn này. 4. Cấu trúc luận án Luận án gồm 115 trang, được chia làm các phần: - Đặt vấn đề: 03 trang - Chương 1: Tổng quan 25 trang - Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 trang. - Chương 3: Kết quả 32 trang - Chương 4: Bàn luận 16 trang - Kết luận: 02 trang - Kiến nghị: 01 trang - Tài liệu tham khảo: 16 trang, 116 tài liệu. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TRỰC KHUẨN MỦ XANH TKMX là một vi khuẩn Gram âm thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae, được phát hiện từ năm 1872. TKMX có khả năng chịu đựng cao với các yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng. Do tính kháng đa kháng sinh nên TKMX đang trở thành vấn đề thực sự khó khăn trong việc phòng và điều trị các nhiễm khuẩn thông thường và nhiễm khuẩn huyết (NKH) do loài vi khuẩn này nói chung, nhiễm khuẩn vết thương bỏng nói riêng. Vì vậy, nhu cầu thực tế đang đòi hỏi cần có các biện pháp dự phòng và điều trị hiệu quả hơn đối với nhiễm TKMX. 1.1.1 Đặc điểm hình thể 1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy 1.1.3. Khả năng gây bệnh 1.1.4. Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh -3TKMX có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. Trong môi trường ẩm, không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu đặt ở 50C, chúng sống được hơn 6 tháng. TKMX kháng lại nhiều thuốc sát trùng ở nồng độ thường dùng để diệt vi khuẩn khác. Cetrimit là một hoá chất diệt khuẩn ở nồng độ 0,2gam/lít. Nhưng ở nồng độ này, TKMX kháng lại thuốc vì vậy người ta cho vào Cetrimid môi trường phân lập loại bỏ tạp nhiễm. TKMX là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng khi gây bệnh thường khó điều trị và gây tỉ lệ tử vong cao, một trong những lý do căn bản của việc khó điều trị các nhiễm trùng do TKMX là do tính đa kháng kháng sinh của chúng. TKMX là một trong số các loài vi khuẩn gây bệnh hay gặp có khả năng đề kháng kháng sinh cao nhất. 1.1.5. Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh Phương pháp hay sử dụng nhất là type huyết thanh (serotype). Năm 1957, Habs và cộng sự đã xây dựng một hệ thống định type của TKMX với 12 nhóm huyết thanh. Hệ thống này gọi là IATS (International antigenic typing system). Hệ thống này được Uỷ ban phân loại quốc tế chấp nhận và đề nghị thành 16 nhóm kháng nguyên chịu nhiệt được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16). Có phản ứng ngưng kết chéo giữa các type P2 và P5; P7 và P8; P13 và P14, đồng thời có khoảng 5% số chủng tự ngưng kết. Khoảng 90 - 95% số chủng TKMX có thể xác định được type theo phương pháp này. Sự phân bố các type huyết thanh ở các nước có khác nhau và trong một nước, giữa các vùng cũng có sự khác nhau. 1.2. NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH 1.2.1. Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh Từ cuối thế kỷ 19, người ta đã biết đến một trong những nguyên nhân gây tử vong ở bệnh nhân bỏng là do nhiễm khuẩn. Trong những năm gần đây vai trò của TKMX trong nhiễm khuẩn bỏng càng trở nên quan trọng vì tỷ lệ nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn này không ngừng tăng từ 25 - 30% (1980) đến 40% (1995 - 1997) và sự phối hợp giữa TKMX và S.aureus chiếm tới 30 - 35%; giữa TKMX và E .coli chiếm 40%. Có thể nói nhiễm TKMX được mô tả ở khắp nơi trên thế giới. 1.2.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng Bệnh nhân bỏng thường phải nằm viện lâu ngày với sức đề kháng giảm, chịu tác động của nhiều yếu tố (thay băng, tiêm truyền, hoặc chịu -4các biện pháp can thiệp khác như đặt sonde, catheter, thở máy… ) làm tăng khả năng nhiễm trùng chéo. 1.3. CÁC BIỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH Trong những năm 1997-1999 đã có những thông báo khẩn cấp về tình trạng kháng kháng sinh của TKMX. Do tính đa kháng sinh nên TKMX đang trở thành vấn đề thực sự khó khăn trong việc phòng và điều trị các nhiễm khuẩn thông thường và NKH do loài vi khuẩn này. Trên thế giới hiện nay đang có 3 xu hướng điều trị nhiễm khuẩn do TKMX, đặc biệt là trong nhiễm khuẩn vết bỏng: - Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện. - Tìm kiếm các kháng sinh và các hóa chất diệt khuẩn mới. - Sử dụng các biện pháp miễn dịch trị liệu: miễn dịch chủ động bằng vắc xin; miễn dịch thụ động bằng huyết thanh kháng TKMX. 1.3.1. Vắc xin trực khuẩn mủ xanh Vắc xin TKMX đã được nghiên cứu nhiều ở một số nước trên thế giới. Có thể chia thành 2 loại vắc xin chính: vắc xin toàn tế bào và vắc xin sử dụng các thành phần của tế bào TKMX. 1.3.2. Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh Phương pháp dùng huyết thanh và globulin miễn dịch tạo được miễn dịch nhanh, trước khi có đáp ứng kháng thể sau tiêm vắc xin, đáp ứng được yêu cầu phòng và điều trị trong những trường hợp khẩn cấp cho các đối tượng có nguy cơ bị nhiễm khuẩn hoặc NKH do TKMX, và huyết thanh liệu pháp được xem như là một biện pháp điều trị hỗ trợ có hiệu quả. Tuy nhiên hiệu quả điều trị của huyết thanh và globulin miễn dịch kháng TKMX còn phụ thuộc vào các yếu tố như dùng sớm hay dùng muộn; có dùng kết hợp với kháng sinh còn nhạy cảm với chủng vi khuẩn gây bệnh hay không; chất lượng và liều lượng huyết thanh hoặc globulin miễn dịch dùng cho bệnh nhân. 1.3.3. Kết hợp vắc xin , huyết thanh và kháng sinh trong phòng và điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh Trong số các xu hướng giải quyết các nhiễm khuẩn do TKMX gây nên, xu hướng ưu tiên về các biện pháp miễn dịch là sử dụng vắc xin gây miễn dịch chủ động và xu hướng thứ 2 là dùng huyết thanh hoặc globulin miễn dịch kháng TKMX dạng tẩm đắp, dạng tiêm để phòng và điều trị các nhiễm khuẩn, đặc biệt là NKH do loài vi khuẩn này. -51.4. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ 1.4.1. Hệ thống miễn dịch của gà Gà có 3 lớp kháng thể là IgM, IgA và IgY. Trọng lượng phân tử và đặc điểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà là tương tự như các lớp này ở động vật có vú. So với IgM và IgA của gà, IgY của gà có trọng lượng phân tử thấp hơn, có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng đỏ trứng, từ đó có tên gọi là kháng thể lòng đỏ trứng (egg yolk immunoglobulin: IgY). 1.4.2. Kháng thể IgY 1.4.2.1. Cấu trúc và chức năng Cấu trúc của IgY nói chung cũng giống như cấu trúc của IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-). Trọng lượng phân tử của IgY là 180 kilo-dalton (kDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (159 kDa). Chuỗi nhẹ L của IgY gồm một vùng thay đổi VL (variable region) và một vùng hằng định CL (constant region). Chuỗi nặng H gồm một vùng thay đổi VH và bốn vùng hằng định ký hiệu từ Cν1 đến Cν4, với trọng lượng phân tử là 68 kDa. 1.4.2.2. Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà Thành phần chính của lòng đỏ trứng gà là lipid và protein. Có thể chia các thành phần này thành 2 loại: phần hạt và phần plasma, trong đó phần plasma lại bao gồm phần lipoprotein tỷ trọng thấp và thành phần hòa tan trong nước. IgY nằm trong phần hòa tan trong nước. Có một số cách tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng như phương pháp gây kết tủa phân đoạn bằng các loại muối, bằng đường, bằng ethanol, bằng polyethylene glycon (PEG); các phương pháp sắc ký; hoặc hòa tan bằng nước. Tùy theo mục yêu cầu về độ tinh sạch của kháng thể, qui mô tách chiết, mục đích sử dụng… người ta cân nhắc sử dụng phương pháp nào hoặc phối hợp các phương pháp với nhau. 1.4.3. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY So với công nghệ sản xuất kháng thể IgG từ động vật có vú, công nghệ sản xuất IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ trứng gà có một số ưu điểm vượt trội. Do đặc tính sinh miễn dịch cao, gà có thể sản xuất kháng thể có hoạt tính cao chỉ cần sau 1 lần gây miễn dịch, nhưng để có kết quả tương -6tự như vậy ở cừu thì phải gây miễn dịch 4 lần. Sau khi gây miễn dịch nồng độ IgY trong huyết thanh cao nhất ở ngày 7 - 9 sau tiêm. IgY được tìm thấy trong lòng đỏ trứng từ ngày thứ 4-7 sau khi xuất hiện trong huyết thanh. Vào thời kỳ gà đẻ ổn định, gà đẻ trứng đều đặn khoảng 20 quả/tháng, trong khi đó việc lấy máu số lượng lớn ở động vật có vú không được thường xuyên. Lấy máu, đặc biệt là lấy số lượng lớn, luôn tiềm ẩn các nguy cơ đối với sức khỏe của động vật. Ngoài ra các yêu cầu về điều kiện vô trùng trong quá trình lấy và bảo quản máu tương đối phức tạp hơn so với thao tác với trứng gà. Sản lượng IgY thu được trung bình khoảng 100 mg/quả trứng. Một năm gà đẻ khoảng 300 quả, tổng sản lượng IgY thu được từ 1 gà mái khoảng 30 gam IgY tinh khiết. Lượng IgG thu được từ máu động vật có vú trung bình khoảng 5 mg/mL máu. Tùy theo kích thước của động vật (thỏ, cừu, ngựa…), sản lượng kháng thể mỗi năm thu được khác nhau. Tổng sản lượng kháng thể thu được từ một gà mái trong 1 năm bằng lượng kháng thể từ một con cừu 100 kg hoặc một nửa con ngựa 200 kg tạo ra. Với sản lượng kháng thể tạo ra lớn như vậy người ta thấy giá thành của kháng thể gà rẻ hơn 10 lần so với kháng thể thỏ. 1.5. ỨNG DỤNG CỦA IgY 1.5.1. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán Do IgY có ái lực (affinity) và háo lực (avidity) với kháng nguyên cao, IgY là ứng viên lý tưởng để chế tạo các xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao. Nhờ khoảng cách tiến hóa xa nhau giữa gà và các động vật có vú nên gà có thể tạo ra kháng thể chống lại bất kỳ kháng nguyên nào của động vật có vú, bao gồm cả con người. Hơn thế nữa, do gà có khả năng sinh kháng thể chống lại nhiều loại kháng nguyên khác nhau, bao gồm cả các kháng nguyên có kích thước bé và tính sinh miễn dịch yếu như các hapten, cho phép sử dụng IgY để chế tạo các sinh phẩm dùng trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện các phân tử nhỏ như các thuốc. 1.5.2. Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh Trị liệu miễn dịch thụ động sử dụng kháng thể đặc hiệu đã được thực hiện từ cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX. Cho đến nay, trị liệu bằng kháng thể đặc hiệu mới chủ yếu được thực hiện theo đường tiêm truyền. Nguyên nhân chính cản trở việc sử dụng kháng thể để điều trị bằng các đường khác là giá thành kháng thể đơn clôn và kháng huyết thanh từ động vật có vú có giá thành rất đắt. Nhờ công nghệ sản xuất đơn giản -7cho sản lượng cao và giá thành thấp, IgY là ứng viên tiềm năng để sử dụng điều trị bằng các đường khác như đường tiêu hóa, dung dịch rửa và tẩm đắp vết thương. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Động vật để gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu kháng trực khuẩn mủ xanh 12 gà mái giống Ai Cập, cân nặng từ 1,3 ± 0,2 kg/con, ở độ tuổi chuẩn bị đẻ trứng được cung cấp từ Viện Chăn nuôi Quốc Gia. Toàn bộ gà được nuôi trong cùng điều kiện dư thừa thức ăn và nước uống, thời gian chiếu sáng 12/24 tiếng bằng ánh sáng tự nhiên tại Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y. Hàng ngày gà được vệ sinh chuồng trại, cho ăn uống và theo dõi tình trạng sức khoẻ chung cũng như tình trạng đẻ trứng. Trứng gà khi đẻ được thu hoạch, đánh dấu số gà và ngày đẻ trứng sau đó được bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng. 2.1.2. Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ xanh 16 thỏ đực, cân nặng trung bình 2,0 ± 0,2 kg/con. Thỏ được nuôi trong điều kiện vệ sinh sạch sẽ, đầy đủ thức ăn, nước uống và chiếu sáng tự nhiên tại Trung tâm nghiên cứu y dược học Quân sự, Học viện Quân y trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Trực khuẩn mủ xanh Các chủng TKMX được sử dụng để chế tạo kháng nguyên gây miễn dịch là sản phẩm của các công trình nghiên cứu trước đây do Bộ môn Khoa Vi sinh y học, Học viện Quân y cung cấp, bao gồm 07 chủng có ký hiệu: M 27P11; 6P11; 7P8; 36P8; 79 P16; 9HP13; 1100P2. Đây là các chủng TKMX thuộc 5 type huyết thanh gây bệnh chủ yếu ở các bệnh viện thuộc 3 miền Bắc – Trung – Nam, Việt Nam. Các chủng được bảo quản đông lạnh trong ngân hàng chủng được hoạt hóa, kiểm tra đặc điểm sinh vật học và huyết thanh học trước khi được nuôi cấy tăng sinh sử dụng làm kháng nguyên để chế tạo huyết thanh kháng TKMX bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà. -82.2.2. Hoá chất sinh phẩm - Các môi trường, sinh phẩm: Môi trường nuôi cấy tăng sinh TKMX: BHI broth, Nutrient agar (Biorad). - Các hóa chất, dung môi: Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh, cộng hợp kháng thể gắn enzym peoxidase (anti chicken IgY), cơ chất OPD (Sigma), Protein chuẩn, Acrylamide, APS, TEMED, (NH4)2SO4, Phenol, PBS, BSA (Merck), Kit Bradford (Biorad), ... và các hóa chất dung môi khác đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. - Các dụng cụ vật tư tiêu hao để tách chiết kháng thể IgY từ trứng gà: Cột Sắc ký‎ trao đổi Ion (BioRad), màng thẩm tích, màng lọc Whatman No1, Plate ELISA 96 giếng. 2.2.3. Thiết bị máy móc - Cân điện tử, máy khuấy từ, máy đo pH, pipetman các loại. - Máy ly tâm lạnh (Hiteach, Đức). - Máy đo độ đục chuẩn Mc-Farland của hãng BioMerieux (Pháp). - Máy lắc Vortex của hãng Satorius (Đức). - Máy sắc ký trao đổi ion áp suất thấp Biologic-LP (Bio-Rad, Mỹ). - Máy đo quang phổ DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ). - Máy điện di SDS-PAGE và chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ) - Tủ nuôi cấy vi sinh ( Trung quốc). - Kính hiển vi quang học (Cail Zeiss, Đức). - Tủ Lạnh -20oC (Sanyo, Nhật). - Bộ dụng cụ chuyên dụng để gây bỏng cho thỏ 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chế tạo kháng nguyên tế bào trực khuẩn mủ xanh từ các chủng dự tuyển Kháng nguyên tế bào TKMX được chế tạo theo phương pháp dùng phenol của Sonnenwirth (1970) . 2.3.2. Gây miễn dịch Sau khi nuôi cho gà thích nghi với điều kiện chuồng nuôi mới trong 2 tuần, tiến hành gây miễn dịch theo qui trình gây miễn dịch đã được các tác giả ở Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y thử nghiệm: tiêm 0,5 mL kháng nguyên/gà dưới da ngực chia làm nhiều mũi và tiêm nhắc lại 5 lần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 3 tuần với nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch là: 106 , 107 VÀ 108 vi khuẩn/ gà/ lần tiêm. Mũi gây miễn dịch lần đầu tiên sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh, các -9mũi tiêm sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh theo qui trình đã được Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y đã khảo sát ứng dụng và tối ưu hóa. Ngay trước khi gây miễn dịch mũi 1, lấy máu tĩnh mạch cánh gà tách huyết thanh để làm mẫu chứng trước khi gây miễn dịch. Sau mỗi lần gây miễn dịch 7 ngày, lấy máu tĩnh mạch cánh gà, tách huyết thanh để làm xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu với TKMX trong máu gà. Toàn bộ các trứng do gà đẻ ra trong suốt quá trình làm thí nghiệm đều được thu thập, đánh giá ghi nhận số lượng trứng do mỗi lô gà đẻ ra và mối tương quan giữa số lượng trứng với qui trình gây miễn dịch cũng như xét nghiệm ELISA tìm kháng thể đặc hiệu TKMX trong lòng đỏ trứng. 2.3.3. Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà Bước 1: Loại lipid bằng phương pháp gây kết tủa lạnh lòng đỏ trứng gà với nước cất. Bước 2: Tủa phân đoạn IgY bằng (NH4)2SO4 Bước 3: Tinh sạch IgY bằng sắc ký trao đổi ion 2.3.4. Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên của TKMX và độ tinh sạch của chế phẩm IgY 2.3.5. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà 2.3.6. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trưc khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot 2.3.7. Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn Nghiền tan một khuẩn lạc TKMX trong 50 µL nước muối sinh lý vô trùng rồi trộn đều với 50 µL dung dịch kháng thể ở các nồng độ khác nhau trên lam kính. Quan sát hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường hoặc bằng kính hiển vi sau 3 đến 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng. Mức độ dương tính được lượng giá thành mức độ +, ++, +++, ++++ theo qui ước thường qui chuẩn tại Bộ môn khoa Vi sinh y học, Bệnh viện 103. 2.3.8. Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường đặc Kỹ thuật khuếch tán trên thạch: thực hiện theo qui định của Dược điển Việt Nam III. 2.3.9. Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo quản Chế phẩm IgY được chia lô và bảo quản trong điều kiện khác nhau bao gồm: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, ở 4°C, và ở nhiệt độ -20ºC và được đánh giá hoạt tính phản ứng sau bảo quản bằng xét nghiệm ELISA. - 10 2.3.10. Gây bỏng thỏ thực nghiệm Theo phương pháp của Picado (1965). Mức độ tổn thương được đánh giá theo phân loại độ bỏng của Lê Thế Trung. 2.3.11. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng TKMX chủng 6P11 được nuôi cấy hoạt hóa và tạo sinh khối trong môi trường thạch nutrient aga ở 37ºC trong 24 giờ. Thu hoạch sinh khối vi khuẩn, rửa và hòa loãng khuẩn lạc trong nước muối sinh lý vô trùng tạo hỗn dịch 108 vi khuẩn/mL bằng phương pháp so độ đục Mc-Farland. Sử dụng dung dịch vi khuẩn này gây nhiễm cho vết thương ngày thứ hai sau gây bỏng với liều 0,5 mL (tương ứng với 0,5x108 TKMX)/vết thương, bằng cách nhỏ trực tiếp dung dịch vi khuẩn lên vết bỏng, để 30 phút sau đó băng kín vết thương bằng gạc vô trùng tẩm vaselin. 2.3.12. Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh Vào ngày thứ 2 sau gây nhiễm TKMX (ngày thứ 3 sau gây bỏng), trên lưng mỗi thỏ có 2 vết thương kích thước tương tự nhau đã được gây nhiễm TKMX với liều lượng và phương pháp như nhau đang có biểu hiện vết thương có màu xanh đặc trưng do nhiễm TKMX. Các vết thương được lấy mẫu để xác định số lượng vi khuẩn ở vết thương, sau đó điều trị theo qui ước các vết thương bên phải làm nhóm thí nghiệm và các vết thương bên trái làm nhóm chứng. Hàng ngày các vết thương được thay băng riêng rẽ sau đó nhóm thí nghiệm được đắp gạc tẩm 5 mL dung dịch IgY kháng TKMX nồng độ 1,5 mg/mL pha trong nước muối sinh lý, nhóm chứng được đắp gạc tẩm 5mL nước muối sinh lý. Các vết thương được băng bên ngoài bằng gạc vô trùng tẩm vaselin để giữ độ ẩm cho vết thương. 2.3.13. Xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương Xác định số lượng vi khuẩn trên 1 cm2 diện tích vết bỏng: theo kỹ thuật của Danilova E.G. và Ivanov N.A. (1984). 2.3.14. Xét nghiệm mô bệnh học Vết thương sau khi gây bỏng 1 ngày được sinh thiết xét nghiệm mô bệnh học để đánh giá mức độ tổn thương bỏng trước khi gây nhiễm vi khuẩn. Sau khi điều trị bằng kháng thể IgY được 10 ngày, tiến hành sinh thiết lần 2. Mô sinh thiết được xử lý theo qui trình thường qui với hệ thống xử lý tiêu bản tự động tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện 103. - 11 - Hình 2.7: Sơ đồ nghiên cứu. - 12 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH 3.1.1. Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh 3.1.1.1 Phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà Hình 3.1: Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong máu gà trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm. 3.1.1.2. Phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong trứng gà Hoạt tính kháng thể IgY trong trứng do các gà mái đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 được khảo sát bằng cách tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng được hoàn nguyên về thể tích lòng đỏ ban đầu, sau đó pha loãng với các mức pha loãng khác nhau và tiến hành phản ứng ELISA với hỗn hợp kháng nguyên siêu nghiền của 7 chủng vi khuẩn được thể hiện trong Hình 3.2. - 13 - Hình 3.2: Hoạt tính IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong lòng đỏ trứng gà được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm. 3.1.1.3. Hoạt tính IgY kháng từng chủng trực khuẩn mủ xanh riêng rẽ Hoạt tính IgY kháng đa giá với 7 chủng TKMX khi thử riêng rẽ với từng chủng đều có phản ứng đặc hiệu. Tuy nhiên mức độ phản ứng không giống nhau giữa các chủng TKMX đã được sử dụng để làm kháng nguyên gây miễn dịch. Mức độ phản ứng mạnh nhất với các chủng 1100P2 và 36P8; Mức độ phản ứng trung bình với các chủng 6 P11, 9HP13, 79P16 và 7P8; và thấp nhất đối với chủng M27P11. Chế phẩm IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà nuôi trong cùng điều kiện nhưng không gây miễn dịch với kháng nguyên TKMX cho kết quả âm tính. 3.1.1.4. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng thuật kỹ thuật Western blot Hoạt tính kháng thể kháng các thành phần protein của từng chủng TKMX riêng rẽ đã được phân tách bằng phương pháp điện di SDSPAGE được thể hiện trong Hình 3.4. - 14 - Hình 3.4: Kết quả phân tích hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với các kháng nguyên của từng chủng trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot. Chủ thích: Từ 1-7: Các chủng TKMX M27P11; 6P11; 79P16; 9HP13; 7P8; 1100 P2; 36P8; M: Protein marker. 3.1.2. Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 3.1.2.1. Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY - 15 Trong các điều kiện để tách chiết IgY được khảo sát, tỷ lệ pha loãng lòng đỏ trứng 1:9 trong nước cất lạnh là thu được kháng thể IgY với hoạt tính cao nhất. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY Chế phẩm IgY thu được với hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,0. 3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY Kết tủa IgY bằng muối sulphat amoin ở nồng độ 40% bão hoà cho hoạt tính kháng thể thu được là mạnh nhất. 3.1.2.4. Phân tích và tinh sạch sản phẩm IgY bằng sắc ký trao đổi ion Sắc ký đồ sắc ký trao đổi ion của chế phẩm kháng thể thu được sau kết tủa với sulphat amoni được trình bày trong Hình 3.8. Hình 3.8: Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni. Sắc ký đồ ở Hình 3.8 cho thấy có 2 đỉnh protein. Đỉnh 1 là các protein không bám vào cột và được đẩy ra cùng với dung dịch đệm ở giai đoạn nạp mẫu và rửa cột với dung dịch đệm A có nồng độ muối thấp. Đỉnh 2 là phân đoạn protein được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch đệm B có nồng độ muối cao. - 16 3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau Kháng thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng hoạt tính giảm nhanh. Sau 3 ngày hoạt tính IgY giảm còn gần một nửa, sau 5 ngày hoạt tính của kháng thể giảm rõ rệt, gần như mất hết hoạt tính. Kháng thể bảo quản ở 4ºC, sau 2 tuần hoạt tính kháng thể hầu như không thay đổi. Các lần lấy mẫu tiếp theo, hoạt tính của kháng thể có chiều hướng giảm dần. Sau 16 tuần, hoạt tính kháng thể giảm còn khoảng 75% so với lần lấy mẫu đầu tiên. Điều này cho thấy: khi bảo quản kháng thể ở 4°C, kháng thể được giữ ổn định và còn giữ được hoạt tính tốt nhất trong khoảng từ 2 đến 3 tuần đầu.. Kháng thể được bảo quản ở -20ºC hoạt tính không thay đổi nhiều. Thể hiện bằng các đường biểu diễn trên biểu đồ không có sự chênh lệch. Như vậy để bảo quản được ở thời gian dài, kháng thể cần phải được bảo quản ở điều kiện âm sâu (-20ºC) để giữ được hoạt tính mạnh. 3.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC 3.2.1. Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro 3.2.1.1. Hoạt tính gây ngưng kết trực khuẩn mủ xanh Bảng 3.2: Hoạt tính ngưng kết từng chủng trực khuẩn mủ xanh của IgY kháng trực khuẩn mủ xanh Chủng số Hoạt tính ngưng kết 6P11 M27P11 79P16 9HP13 1100P2 7P8 36P8 (+++) (++) (++) (++) (+) (+) (+) Kháng thể có hoạt tính ngưng kết mạnh nhất đối với các chủng có ký hiệu P11 (6P11 và M27P11) và ngưng kết yếu hơn với các chủng 7P8, T1100P2, 36 P8. - 17 3.2.1.2. Hoạt tính ức chế trực khuẩn mủ xanh trên môi trường thạch đặc (A) (C) (B) (D) Hình 3.15: Kháng thể IgY ức chế trực khuẩn mủ xanh trên môi trường đặc. Chú thích: A) Chủng 27P11 (27 mm) B) Chủng 79P16 (28 mm) C) Chủng 9HP13 (26 mm) D) Chứng âm, chủng 27P11 (10 mm) Kết hợp hai thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn và tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường thạch đặc cho thấy bước đầu thử nghiệm in vitro - 18 đã cho thấy sản phẩm kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà có tác dụng ức chế đặc hiệu với TKMX. 3.2.2. Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm trực khuẩn mủ xanh bằng chế phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 3.2.2.1. Kết quả gây bỏng thực nghiệm trên thỏ 3.2.2.2. Kết quả gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh lên vết thương bỏng Kết quả lấy mẫu trước khi gây nhiễm không có vết bỏng nào có TKMX mọc. Sau khi gây nhiễm 24 giờ với số lượng 0,5x108 vi khuẩn/vết bỏng, cả 32/32 (100%) vết bỏng đều có TKMX phát triển. Tuy nhiên, số lượng TKMX ở một số vết thương thấp dưới 2x107 vi khuẩn/cm2. Những thỏ có ít nhất 1 vết thương có số lượng TKMX dưới 2x107 vi khuẩn/cm2 bị loại ra khỏi nhóm nghiên cứu, kết quả chỉ còn 13 thỏ với 26 vết thương gây nhiễm đạt yêu cầu với số lượng trung bình (1,79 ± 1,43)x109/cm2 bề mặt vết bỏng. 3.2.2.3. Số lượng trực khuẩn mủ xanh trên vết bỏng gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh trước và sau điều trị Hình 3.17: Biến động số lượng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh ở vết bỏng trước và sau điều trị. Số lượng vi khuẩn trung bình của TKMX ở nhóm các vết bỏng trước khi được điều trị bằng chế phẩm IgY là (1,76 ± 1,67)x109/cm2 và trước