Tài liệu Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện hiv bằng dot blot với các protein gp120, gp41, p24 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT …………..o0o………….. NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT …………..o0o………….. NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN Mở đầu-----------------------------------------------------------------------------------1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới -------------------------------------1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS. ---------------------------------------1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới. ------------------------------------1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cƣ́u HIV ở Việt Nam. ------------1.3 Đặc điểm của HIV----------------------------------------------------------------1.3.1 Giới thiệu chung. -----------------------------------------------------------------1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV.----------------------------------------------1.4 Phân loại HIV. --------------------------------------------------------------------1.4.1 HIV-1-------------------------------------------------------------------------------1.4.2 HIV-2-------------------------------------------------------------------------------1.5 Đặc điểm sinh vật học của HIV. -----------------------------------------------1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tƣợng cảm thụ HIV. ----------------------------1.7 Các phƣơng thức lây truyền của HIV------------------------------------------1.8 Sƣ̣ xâm nhập tế bào và nhân lên của HIV. -----------------------------------1.9 Đáp ƣ́ng miễn dị ch của cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS. ----------------------1.9.1 Nhƣ̃ng thay đổi miễn dị ch khi nhiễm HIV. ----------------------------------1.9.2 Suy giảm miễn dị ch do nhiễm HIV. -------------------------------------------1.9.3 Diễn biến huyết thanh ngƣời nhiễm HIV/AIDS. -----------------------------1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV trong cơ thể. -------------------------------------1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV. ---------------------------------------1.10.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV. --------------------------------------------1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV. --------------------1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV. -------------------------------------1.10.5 Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV. -------------------------------------------1.10.6 Nghiên cƣ́u các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán. ------------------1.11 Điều trị HIV/AIDS----------------------------------------------------------------- 3 5 5 7 8 10 10 10 15 15 18 18 19 19 20 23 23 24 26 28 28 29 30 31 34 35 37 40 Đối tƣợng, vật liệu. --------------------------------------------------------------- 40 Đối tƣợng. -------------------------------------------------------------------------- 40 Các sinh phẩm---------------------------------------------------------------------- 40 Hóa chất vật liệu-------------------------------------------------------------------- 40 Dung dị ch và môi trƣờng---------------------------------------------------------- 40 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U------ 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Luận văn cao họcK12 2.1.5 Thiết bị và máy móc--------------------------------------------------------------2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u--------------------------------------------------------2.2.1 Phƣơng pháp điện di trên gel và polyacrylamide. ----------------------------2.2.2 Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21. -----2.2.3 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin. -----------------2.2.4 Phƣơng pháp Western blot-------------------------------------------------------2.2.5 Đị nh lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford-----------------------------2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp120-------------------2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp41---------------------2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp p24. ---------------------2.2.9 Phƣơng pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV------------------------CHƢƠNG III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC------------------------------------------------3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp gp120. -------------------------------------------3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp. -----------------------------------------------------3.3 Nghiên cƣ́u khả năng phản ƣ́ng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng western blot. ------------------------3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE. ----3.4.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và xác đị nh trạng thái gp41 tái tổ hợp. ---3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp--------------------------------------------------------3.5 Kiểm tra khả năng phát hiện khá ng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng western blot. ----------------------------------------------------------3.6 Biểu hiện và tinh sạch protein p24----------------------------------------------3.7 Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. ---------------------------3.8 Kết quả nghiên cƣ́u chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV. ----------------KẾT LUẬN --------------------------------------.----------------------------------------KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------------------PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------ 44 45 45 46 47 50 50 53 53 54 55 57 57 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO---------------------------------------------------------------- 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh 59 61 61 62 65 66 66 66 68 75 77 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Luận văn cao họcK12 MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chƣa có vacxin phòng bệnh và chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cƣớp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội làm ảnh hƣởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia. Theo báo cáo của Tổ chức phòng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO), đến năm 2008 trên thế giới có 33,4 triệu ngƣời đang sống chung với HIV, mỗi năm có 2,7 triệu ngƣời nhiễm mới và 2 triệu ngƣời tử vong do AIDS. Tại Việt Nam, từ khi ca nhiễm đầu tiên đƣợc thông báo vào năm 1990 ở thành phố Hồ Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang ngày càng tăng lên. Tính đên 31/3/2009, toàn quốc có 144.483 ngƣời nhiễm HIV, 30.996 ngƣời đã chuyển sang giai đoạn AIDS còn sống, 42.447 ngƣời đã tử vong vì AIDS . Có hai type HIV gây bệnh ở ngƣời là HIV-1 và HIV-2. Tuy nhiên, HIV-2 chỉ lƣu hành ở châu Phi, còn HIV-1 thì lƣu hành rộng rãi và gây bệnh chủ yếu ở tất cả các châu lục. Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm M, N và O. Các nhóm này có thể đƣợc chia ra thành các phân type, mỗi phân type lại có phân vùng địa lý khác nhau. Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn [41]. Hiểu đƣợc sự lƣu hành của các phân type HIV cũng nhƣ các thể tái tổ hợp của chúng ở mỗi vùng địa lý khác nhau không chỉ có ý nghĩa quyết định cho việc nghiên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Luận văn cao họcK12 cứu và triển khai vắc xin phòng chống HIV mà còn có giá trị trong sản xuất kit chẩn đoán thích hợp cho từng vùng. Các công trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ƣu tiên theo địa lý các nƣớc giàu nghèo. Phân type C xuất hiện chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type CRF01_AE lƣu hành chủ yếu tại các nƣớc khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu về HIV hiện nay đều tập trung vào phân type B, vì phân type này lƣu hành chủ yếu ở các nƣớc phát triển. Nghiên cứu để biết rõ hơn về đặc tính di truyền và kháng nguyên của các phân typ HIV lƣu hành chủ yếu ở Việt Nam từ đó chế tạo các bộ kit chẩn đoán huyết thanh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái tổ hợp GP120, GP41 và P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành ở Việt nam là mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng dot blot với các protein GP120, Gp41 và P24 tái tổ hợp” Đề tài đƣợc đặt ra với các mục tiêu cụ thể sau: - Tạo ra đƣợc các kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán. - Xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán HIV bằng dot blot,độ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Luận văn cao họcK12 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS Quá trình diễn biến HIV/AIDS trên thế giới chia 3 giai đoạn [21]. - Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981. HIV đã bắt đầu xuất hiện âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX. Ngƣời ta đã tìm thấy kháng thể (KT) kháng HIV trong các mẫu máu đƣợc bảo quản ở Zaire (1959) và ở Mỹ (1970). - Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985. Ở thời kỳ này, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc virus, xác định đƣợc phƣơng thức truyền bệnh và phát triển các kỹ thuật phát hiện virus. + Năm 1981, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xác định đƣợc những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) đầu tiên trên thế giới dựa trên sự phát hiện và mô tả bệnh của bác sỹ Michạel Gottlieb về 5 thanh niên đồng tính luyến ái bị viêm phổi nặng do Pneumocystis carinii ở Los Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 Luận văn cao họcK12 Điều đặc biệt là ở những bệnh nhân này đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn dịch, về cả số lƣợng và chức năng của tế bào miễn dịch, quan trọng nhất là sự giảm tế bào TCD4. + Năm 1982, nhiều nơi đã công bố căn bệnh tƣơng tự nhƣ trên ở các bệnh nhân phải truyền máu nhiều lần, ở các đối tƣợng nghiện chích ma tuý, ở những ngƣời mẹ và đứa con do họ đẻ ra. Cuối 1982, dựa trên những trƣờng hợp AIDS đầu tiên đƣợc thông báo, CDC đã đƣa ra tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chƣa có phƣơng pháp xét nghiệm căn nguyên. + Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế đã thống nhất gọi tên các virus LAV (Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III), ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human Immunodefiency Virus- HIV). + Năm1984-1985, đã xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III và chuẩn hoá bộ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym ELISA để sàng lọc máu và phát hiện lâm sàng - Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế giới chống AIDS. + Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng đầu tiên với AZT (Azidothymidine) nhƣ một thuốc chống Retrovirus. + Năm 1989, đƣa ra các hƣớng dẫn điều trị bằng AZT cho những ngƣời nhiễm HIV và bệnh nhân AIDS trên cơ sở số lƣợng tế bào TCD4 của ngƣời bệnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 Luận văn cao họcK12 + Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Luận văn cao họcK12 1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới Đại dịch HIV/AIDS tuy xuất hiện chƣa lâu, mới bắt đầu vào những năm 70-80 của thế kỷ XX nhƣng đã nhanh chóng lan tràn trên toàn cầu, tấn công mọi đối tƣợng không phân biệt lứa tuổi, nghề nghiệp, địa vị xã hội nhƣ phụ nữ, trẻ em, thanh niên, ngƣời có tuổi, ngƣời đồng tính luyến ái, ngƣời nghiện chích ma tuý. Dịch liên tục phát triển về cả không gian và thời gian trở thành đại dịch nguy hiểm. Đại dịch này gồm nhiều vụ dịch xảy ra ở từng nƣớc, từng lục địa, có phƣơng thức lây truyền, biểu hiện lâm sàng đặc trƣng riêng phụ thuộc vào nguồn gốc virus, đối tƣợng nhiễm, điều kiện kinh tế xã hội và tập quán từng nƣớc. Ban đầu xuất hiện, dịch chủ yếu xảy ra tại các nƣớc công nghiệp phát triển ở Bắc Mỹ, Úc, và Tây Âu, tại các thành phố lớn, ở những ngƣời đồng tính luyến ái và ngƣời nghiện chích ma tuý. Từ đó, dịch lan tràn khắp các nƣớc, gây tác hại to lớn tại châu Phi, vùng Caribe với số lƣợng ngƣời nhiễm HIV rất cao. Đến nay, khu vực Nam phi vẫn là vùng có số lƣợng bệnh nhân cao nhất trên thế giới và riêng tại khu vực Sahara đã có tới 25,8 triệu ngƣời nhiễm HIV, chiếm 64% tổng số ngƣời nhiễm HIV trên thế giới. Ở Châu Á, dịch HIV/AIDS đến muộn bắt đầu từ cuối những năm 80 của thế kỷ XX nhƣng phát triển rất nhanh với phƣơng thức lây truyền đa dạng phản ánh tính đa dạng về xã hội, kinh tế và văn hoá.Theo dự đoán của WHO, đại dịch HIV/AIDS sẽ có xu thế dịch chuyển về Châu Á mà điểm nóng là Thái lan, Ấn Độ, Campuchia và Indonesia.Vì vậy cần phải có các chƣơng trình khống chế và dự phòng HIV/AIDS kịp thời, mạnh mẽ. Một tình trạng đáng báo động khi 70% ngƣời dân Ontania trên đảo Bomeo, Indonesia kết quả xét nghiệm HIV dƣơng tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 Luận văn cao họcK12 1.2. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS VÀ NGHIÊN CỨU HIV Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam, dịch HIV/AIDS đến muộn hơn các quốc gia khác nhƣng đang trở thành một trong những nguyên nhân chính gây tử vong cho cộng đồng. Kể từ trƣờng hợp nhiễm HIV đầu tiên đƣợc phát hiện tháng 12/1990, đến tháng 12/1992 mới chỉ có thêm 11 trƣờng hợp bị nhiễm HIV nhƣng đến tháng 06/1999, toàn quốc đã có 13.623 trƣờng hợp nhiễm HIV, 2.532 bệnh nhân AIDS và 1.320 ngƣời đã tử vong vì AIDS. Theo thống kê của Uỷ ban Quốc gia phòng chống AIDS, tính đến cuối tháng 7/2007, toàn quốc có 123.775 ngƣời nhiễm HIV, 26.214 bệnh nhân AIDS và 38.648 ngƣời đã tử vong [1]. Ban đầu, dịch chỉ có ở thành phố Hồ Chí Minh, đến tháng 6/1995 đã có 34/53 tỉnh thành báo cáo có ngƣời nhiễm HIV/AIDS và hiện nay, tất cả các tỉnh thành trên cả nƣớc đều có ngƣời nhiễm HIV/AIDS. Dịch liên tục lan rộng ra các xã, phƣờng với 95% số huyện, 49% số xã có ngƣời nhiễm HIV/AIDS và mỗi năm có trên 10.000 trƣờng hợp nhiễm mới [26]. Phƣơng thức lây truyền HIV ở nƣớc ta chủ yếu là qua đƣờng tình dục và tiêm chích ma tuý. Sự gia tăng của dịch HIV/AIDS ở đối tƣợng nghiện chích ma tuý tại Việt Nam là điều thực sự đáng quan tâm vì số ngƣời sử dụng ma tuý ngày càng có chiều hƣớng gia tăng với mức độ khó kiểm soát. Theo Cục phòng chống tệ nạn xã hội, hiện nay, nƣớc ta có khoảng 185.000 đến 200.000 ngƣời nghiện ma tuý, điều này nhấn mạnh nguy cơ tăng tỷ lệ nhiễm HIV ở đối tƣợng nghiện chích ma tuý cũng nhƣ nguy cơ lan truyền từ ngƣời tiêm chích ma tuý sang các nhóm khác trong cộng đồng. Bên cạnh đó, hình thức lây nhiễm HIV qua đƣờng tình dục cũng đang có dấu hiệu gia tăng. Theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 1994-2002, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm gái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Luận văn cao họcK12 mại dâm đã tăng gấp 10 lần (từ 0,6% lên đến 6%) [8]. Tình hình lây nhiễm HIV ngày càng trở nên phức tạp bởi sự lây lan giữa hai nhóm đối tƣợng có nguy cơ cao này. Các công trình nghiên cứu về HIV ở Việt Nam thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau, nhƣng có lẽ tập trung nhiều vào việc thống kê về tình hình nhiễm HIV tại các cơ sở điều trị và tại các địa phƣơng khác nhau [17], [27], [22]. Ngoài ra các công bố về dịch tễ học, đặc điểm lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS đến điều trị tại các bệnh viện cũng đƣợc đề cập nhiều [25], [10], [16]. Nghiên cứu về sự kháng thuốc của HIV cũng đƣợc đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây [14]. Dịch tễ học phân tử của HIV lƣu hành ở Việt Nam và các phƣơng pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán, phát hiện, định loại HIV cũng đƣợc quan tâm và đƣa vào ứng dụng tại Việt Nam [1], [15], [11], [23]. Các kit chẩn đoán HIV hiện nay chủ yếu vẫn là nhập của nƣớc ngoài. Ở trong nƣớc đã có một số cơ sở sản xuất đƣợc kit chẩn đoán và định lƣợng HIV bằng kỹ thuật PCR nhƣ thuốc thử định lƣợng HIV của Công Ty Nam Khoa [10]. Trong khuôn khổ của đề tài KC.10.08/06-10, Phan Tuấn Nghĩa và cs đã tạo ra đƣợc bộ kit Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời HBV, HCV and HIV trong các mẫu máu. Tuy nhiên, tất cả các kit chẩn đoán huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng HIV trên cơ sở các kháng nguyên của HIV, hiện tại chúng ta vẫn phải nhập ngoại. Để xây dựng đƣợc panel chuẩn cho tất cả các kit nhập ngoại thì không phải là điều dễ dàng. Theo chúng tôi các Hãng trên thế giới không cho biết các kit của họ đƣợc chế tạo từ phân typ nào, do đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu khi phát hiện kháng thể kháng các chủng HIV lƣu hành trong nƣớc cần phải tiếp tục đƣợc thực hiện để xây dựng đƣợc panel chuẩn trong chẩn đoán HIV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Luận văn cao họcK12 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA HIV 1.3.1 Giới thiệu chung HIV là virus gây AIDS ở ngƣời, thuộc nhóm Lentivirus họ Retroviridae vì vậy HIV có những đặc điểm chung của cả retrovirus và lentivirus [21]. Đặc trƣng của một retrovirus: - Là một RNA virus có enzym sao chép ngƣợc, enzym sao chép ngƣợc này có bản chất là DNA polymerase phụ dƣ̣a vào khuôn RNA của virus HIV tổng hợp DNA 2 mạch trong tế bào bị retrovirus xâm nhập DNA này gọi là cDNA. - cDNA mới tạo ra này có những đoạn tự lập lại với kích thƣớc khác nhau đƣợc gọi là đoạn cuối dài tự lập lại (long terminal repeat), nhờ vậy genom của virus gắn ổn định trong DNA của tế bào nhiễm virus và trở thành một tiền virus (provirus). - Provirus này sẽ tồn tại nhƣ một gen của tế bào nhiễm virus, tồn tại thầm lặng không phát triển và truyền sang cho thế hệ khác khi có phân bào, hoặc đƣợc chuyển thành mRNA trƣ̣c tiếp tham gia quá trì nh sinh tổng hợp protein của virus để hình thành nhƣ̃ng virus hoàn chỉnh. Đặc trƣng của lentivirus: Phát triển chậm, hƣớng động tới các tế bào bạch cầu đơn nhân (monocyte) và đại thực bào (macrophage). Không có khả năng làm bất tử hay biến đổi nhƣng lại làm tiêu huỷ tế bào nhiễm virus. Nucleotide có trình tự (sequence) giống virus VISNA, là virus tiêu biểu cho hạ tộc lentivirus. 1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc của HIV Dƣới kính hiển vi điện tử, HIV có dạng hình cầu với đƣờng kính khoảng 80-120 nm. Cấu trúc từ ngoài vào trong gồm 3 lớp [21]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Luận văn cao họcK12 Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của HIV [21]. a. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon) Lớp này là một màng lipid kép có kháng nguyên (KN) chéo với màng sinh chất tế bào, đƣợc bao phủ bởi các gai nhú. Gai nhú có bản chất là glycoprotein (gp) dài 9-10nm, rộng 14 nm, trọng lƣợng phân tử (TLPT) 160 kDa (kilodalton) ký hiệu là gp 160 với HIV1 và 165 kDa với HIV2, gồm 2 gp: + gp120 với HIV-1 hoặc gp125 với HIV-2: là phần KN bên ngoài dễ biến đổi nhất, gây khó khăn cho việc tạo KT và việc sản xuất vacxin phòng bệnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Luận văn cao họcK12 + gp41 với HIV-1 hoặc gp36 với HIV-2: là gp xuyên màng gắn với gp120 hoặc gp125 với HIV-2 giúp cho HIV xâm nhập đƣợc vào tế bào đích. b. Lớp vỏ trong (vỏ capsid) Vỏ này gồm 2 lớp [21]: + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein TLPT 17 kDa (p17 với HIV-1) hoặc 18 kDa (p18 với HIV-2). + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi protein TLPT 24 kDa (p24) bao bọc lấy lõi của virus, giữa lớp trong và lõi của virus có những khối dầy đặc điện tử gọi là thế bên. c. Lõi Nhân hay lõi là thành phần bên trong lớp vỏ capsid có hình trụ hơi lệch tâm gồm [21]: * Vật liệu di truyền (genom) của HIV nằm trên hai sợi RNA có gắn enzym sao mã ngƣợc, mỗi sợi RNA đơn có khoảng 9200 cặp bazơ với 2 nhóm gen : + Nhóm gen cấu trúc gồm gen gag, pol và env. + Nhóm gen điều hoà sinh trƣởng là tat, nef, vif, vpr, vpu, vpx. Nhóm gen cấu trúc: - Gen gag (group specific antigen) là gen mã hoá KN đặc hiệu nhóm cho các protein p17/p18, p24/p25 ở lớp vỏ capsid của HIV. Ban đầu, nhóm gen gag này sẽ tổng hợp nên một protein lớn là p55. Khi virus trƣởng thành, protein này sẽ đƣợc cắt ra tạo nên các protein con là: MA(p17), CA(p24), NC(p9) và p6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 Luận văn cao họcK12 Protein lõi p24 đƣợc mã hoá bởi nhóm gen gag là 1 KN đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán nhiễm HIV vì P24 là protein có vai trò tạo nên lõi hình nón bên trong của virus và là vị trí mà cycophilin A gắn với nhóm protein gag. Điều này rất quan trọng trong quá trình nhân lên của virus vì nếu sự kết hợp này bị cản trở thì quá trình nhân lên của virus cũng bị dừng lại. P24 đƣợc sản xuất ra trong tế bào nhiễm virus và có thể đƣợc giải phóng ra ngoài bằng nhiều cách do đó ngƣời ta có thể đo lƣợng p24 nội bào và ngoại bào để đánh giá số lƣợng HIV trong cơ thể. + Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzym: Reverse transcriptase (RT) p64/p67, p51/p53 là enzym sao chép ngƣợc đảm nhiệm mã hoá bộ gen virus thành DNA bổ xung (cDNA). Ngƣời ta đã thí nghiệm dùng các thuốc nhƣ Zidovudin (ZDV), ddI và Nevirapin để ức chế RT nhằm ngăn chặn sự nhân lên của virus nhƣng HIV đã phát sinh biến dị làm thay thế các axit amin ở nơi tác động của thuốc nên có tác dụng kháng lại thuốc. Enzym này còn đƣợc ứng dụng phát hiện HIV bằng kỹ thuật RT-PCR. Protease (p10) của HIV có tác dụng tách các protein đƣợc mã hoá bởi gen gag và pol thành các phân tử hoạt động. Endonuclease p31/p34 đảm nhiệm sự tích hợp DNA của virus vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Protease và endonuclease còn gọi là enzym tích hợp (integrase). + Gen env (envelop) mã hoá cho gp110/120, gp41 ở lớp vỏ peplon của virus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 Luận văn cao họcK12 Nhóm gen điều hoà : + Gen tat (transactivateur): là gen phát động sự tăng trƣởng các gen khác của virus. Nơi tác động là đoạn TAR (transactivateur responsive) trong đoạn 5LTR. Tế bào nhiễm HIV mà provirus có gen tat sẽ kích hoạt các HIV hoạt động gấp 1000 lần các provirus không có gen tat. Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hành (kể cả gen tat). + Gen rev ( regulation gene) có chức phận điều chỉnh quá trình nhân lên của virus thông qua tat và nef . Rev điều hoà mã hoá 1 protein rev có hai đầu trong đó một đầu có nhiệm vụ ức chế (CRS) và một đầu giải ức chế (CAR). + Gen nef (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm phát triển virus, tăng cƣờng khả năng lây nhiễm của virus . + Gen vif (virion infectivity factor) mã hoá protein vì làm tăng tính thâm nhập của virus vào tế bào cảm nhiễm. Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc gen của HIV [95]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 Luận văn cao họcK12 1.4. PHÂN LOẠI HIV HIV là virus có độ biến đổi cao, đột biến dễ dàng. Điều này có nghĩa là trong một cơ thể của một ngƣời nhiễm bệnh cũng có nhiều chủng HIV. Dựa trên những điểm tƣơng tự về di truyền, HIV đƣợc chia làm 2 loại là: HIV-1 và HIV-2. Hai loại này cùng gây nên AIDS trên ngƣời với bệnh cảnh lâm sàng không thể phân biệt đƣợc và đƣờng lây hoàn toàn giống nhau. Tuy nhiên, HIV-1 là loại gây bệnh chủ yếu và là nguyên nhân chính gây AIDS ở tất cả các châu lục trên thế giới, khi nói nhiễm HIV mà không kèm theo type HIV tức là nói đến HIV-1. HIV-2 chỉ lƣu hành ở châu Phi, có khả năng gây bệnh và tiến triển bệnh lâu hơn, khó lây hơn HIV-1 [41]. 1.4.1. HIV-1 Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm là nhóm M (major), nhóm N (new) và O (outlier). Các nhóm này có thể khác nhau 30-40% trong trình tự các axit amin nằm ở gp120. Ba nhóm này đại diện cho đợt du nhập riêng rẽ của SIV gây suy giảm miễn dịch từ khỉ sang ngƣời. Nhóm O hầu nhƣ chỉ khu trú tại Tây Phi, nhóm N rất hiếm gặp và chỉ mới đƣợc phát hiện tại Cameroon (1998) còn lại là trên 90% các trƣờng hợp nhiễm HIV-1 đều thuộc nhóm M. Nhóm M là nhóm lớn nhất và đƣợc chia làm 8 phân type [(A1, A2), (B), (C), (D), (CRF01_AE), (F1, F2, K) (G, J), (H)]; mỗi phân type có phân vùng địa lý khác nhau [40]. Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho các việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn. Sự hình thành các thể tái tổ hợp là do 2 virus thuộc 2 phân type khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 Luận văn cao họcK12 nhau cùng hiện diện trong tế bào ngƣời nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành một virus lai mới, mặc dù đa số virus thuộc chủng mới này không sống sót lâu đƣợc, nhƣng nếu chủng nào lây nhiễm tồn tại đƣợc sẽ tạo ra thể tái tổ hợp. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc khoảng 30 CRF. CRF A/E đƣợc coi là sự lai tạo giữa phân type A và một phân type gốc E, cho đến nay ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy đƣợc phân type E ở dạng riêng rẽ vì vậy CRF A/E có thể đƣợc coi là phân type E [41]. Hình 1.3: Sơ đồ phân bố các phân type HIV [104]. Kết qủa nghiên cứu phân tích mức độ lƣu hành của các phân type HIV -1 toàn cầu năm 2004 cho thấy [41], [39]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 Luận văn cao họcK12 + Về tỷ lệ %: Phân type C chiếm đa số (47,2%), phân type A 27%, phân type B chiếm 12,3%, phân type D chiếm 5,3%, phân type E chiếm 3,2%, các phân type còn lại (F, G, H, J,) và các CRF khác chỉ chiếm 5 %. + Về phân vùng địa lý: Các phân type HIV-1 và các CRF đƣợc phân bố không đều trên thế giới, trong đó các phân type B và C phân bố rộng rãi nhất. Phân type B xuất hiện chủ yếu tại Bắc Mỹ, châu Âu và châu Úc. Tuy nhiên, hiện nay tại châu Âu đang dần có sự du nhập của các phân type khác, khoảng 25% những trƣờng hợp nhiễm HIV tại châu Âu không phải do phân type B. Điều này có thể đƣợc giải thích là do sự lai tạp về dân số vì đã có một số lƣợng lớn dân di cƣ du nhập đến châu Âu kể từ sau thế chiến thứ 2. Phân type C là phân type thƣờng gây ra các vụ dịch HIV nặng nề chủ yếu tại châu Phi, châu Á, Ấn Độ, Nepal và là nguyên nhân của khoảng một nửa các trƣờng hợp nhiễm HIV hiện nay trên thế giới. Phân type A xuất hiện nhiều tại Nga và châu Phi, chủ yếu tại Tây Phi và Trung Phi còn phân type D lại thƣờng khu trú tại Đông Phi. Phân type F đƣợc tìm thấy tại Trung Phi, Nam Mỹ và Đông Âu nhƣng phân type G và CRF A/G lại là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu tại Tây Phi, Đông Phi và tại Trung Âu. Phân type H chỉ tìm thấy tại Trung Phi; phân type J chỉ có tại Trung Mỹ; và phân type K chỉ có tại Cộng hòa Dân chủ Congo và Cameroon. Theo các công bố gần đây của các nƣớc khu vực Đông Nam Á thì phân type lƣu hành chủ yếu ở khu vực này lại là CRF01_AE (nhƣng nguồn gốc từ Trung Phi). Tại Việt Nam, hiện nay thƣờng xuất hiện HIV-1 phân type CRF01_AE và B phân bố tùy theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 18