Tài liệu Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện hiv bằng dot blot với các protein gp120, gp41, p24 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT …………..o0o………….. NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT …………..o0o………….. NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN Mở đầu-----------------------------------------------------------------------------------1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới -------------------------------------1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS. ---------------------------------------1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới. ------------------------------------1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cƣ́u HIV ở Việt Nam. ------------1.3 Đặc điểm của HIV----------------------------------------------------------------1.3.1 Giới thiệu chung. -----------------------------------------------------------------1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV.----------------------------------------------1.4 Phân loại HIV. --------------------------------------------------------------------1.4.1 HIV-1-------------------------------------------------------------------------------1.4.2 HIV-2-------------------------------------------------------------------------------1.5 Đặc điểm sinh vật học của HIV. -----------------------------------------------1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tƣợng cảm thụ HIV. ----------------------------1.7 Các phƣơng thức lây truyền của HIV------------------------------------------1.8 Sƣ̣ xâm nhập tế bào và nhân lên của HIV. -----------------------------------1.9 Đáp ƣ́ng miễn dị ch của cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS. ----------------------1.9.1 Nhƣ̃ng thay đổi miễn dị ch khi nhiễm HIV. ----------------------------------1.9.2 Suy giảm miễn dị ch do nhiễm HIV. -------------------------------------------1.9.3 Diễn biến huyết thanh ngƣời nhiễm HIV/AIDS. -----------------------------1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV trong cơ thể. -------------------------------------1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV. ---------------------------------------1.10.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV. --------------------------------------------1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV. --------------------1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV. -------------------------------------1.10.5 Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV. -------------------------------------------1.10.6 Nghiên cƣ́u các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán. ------------------1.11 Điều trị HIV/AIDS----------------------------------------------------------------- 3 5 5 7 8 10 10 10 15 15 18 18 19 19 20 23 23 24 26 28 28 29 30 31 34 35 37 40 Đối tƣợng, vật liệu. --------------------------------------------------------------- 40 Đối tƣợng. -------------------------------------------------------------------------- 40 Các sinh phẩm---------------------------------------------------------------------- 40 Hóa chất vật liệu-------------------------------------------------------------------- 40 Dung dị ch và môi trƣờng---------------------------------------------------------- 40 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U------ 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Luận văn cao họcK12 2.1.5 Thiết bị và máy móc--------------------------------------------------------------2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u--------------------------------------------------------2.2.1 Phƣơng pháp điện di trên gel và polyacrylamide. ----------------------------2.2.2 Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21. -----2.2.3 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin. -----------------2.2.4 Phƣơng pháp Western blot-------------------------------------------------------2.2.5 Đị nh lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford-----------------------------2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp120-------------------2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp41---------------------2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp p24. ---------------------2.2.9 Phƣơng pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV------------------------CHƢƠNG III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC------------------------------------------------3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp gp120. -------------------------------------------3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp. -----------------------------------------------------3.3 Nghiên cƣ́u khả năng phản ƣ́ng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng western blot. ------------------------3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE. ----3.4.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và xác đị nh trạng thái gp41 tái tổ hợp. ---3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp--------------------------------------------------------3.5 Kiểm tra khả năng phát hiện khá ng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng western blot. ----------------------------------------------------------3.6 Biểu hiện và tinh sạch protein p24----------------------------------------------3.7 Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. ---------------------------3.8 Kết quả nghiên cƣ́u chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV. ----------------KẾT LUẬN --------------------------------------.----------------------------------------KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------------------PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------ 44 45 45 46 47 50 50 53 53 54 55 57 57 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO---------------------------------------------------------------- 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh 59 61 61 62 65 66 66 66 68 75 77 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Luận văn cao họcK12 MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chƣa có vacxin phòng bệnh và chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cƣớp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội làm ảnh hƣởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia. Theo báo cáo của Tổ chức phòng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO), đến năm 2008 trên thế giới có 33,4 triệu ngƣời đang sống chung với HIV, mỗi năm có 2,7 triệu ngƣời nhiễm mới và 2 triệu ngƣời tử vong do AIDS. Tại Việt Nam, từ khi ca nhiễm đầu tiên đƣợc thông báo vào năm 1990 ở thành phố Hồ Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang ngày càng tăng lên. Tính đên 31/3/2009, toàn quốc có 144.483 ngƣời nhiễm HIV, 30.996 ngƣời đã chuyển sang giai đoạn AIDS còn sống, 42.447 ngƣời đã tử vong vì AIDS . Có hai type HIV gây bệnh ở ngƣời là HIV-1 và HIV-2. Tuy nhiên, HIV-2 chỉ lƣu hành ở châu Phi, còn HIV-1 thì lƣu hành rộng rãi và gây bệnh chủ yếu ở tất cả các châu lục. Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm M, N và O. Các nhóm này có thể đƣợc chia ra thành các phân type, mỗi phân type lại có phân vùng địa lý khác nhau. Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn [41]. Hiểu đƣợc sự lƣu hành của các phân type HIV cũng nhƣ các thể tái tổ hợp của chúng ở mỗi vùng địa lý khác nhau không chỉ có ý nghĩa quyết định cho việc nghiên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Luận văn cao họcK12 cứu và triển khai vắc xin phòng chống HIV mà còn có giá trị trong sản xuất kit chẩn đoán thích hợp cho từng vùng. Các công trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ƣu tiên theo địa lý các nƣớc giàu nghèo. Phân type C xuất hiện chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type CRF01_AE lƣu hành chủ yếu tại các nƣớc khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu về HIV hiện nay đều tập trung vào phân type B, vì phân type này lƣu hành chủ yếu ở các nƣớc phát triển. Nghiên cứu để biết rõ hơn về đặc tính di truyền và kháng nguyên của các phân typ HIV lƣu hành chủ yếu ở Việt Nam từ đó chế tạo các bộ kit chẩn đoán huyết thanh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái tổ hợp GP120, GP41 và P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành ở Việt nam là mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng dot blot với các protein GP120, Gp41 và P24 tái tổ hợp” Đề tài đƣợc đặt ra với các mục tiêu cụ thể sau: - Tạo ra đƣợc các kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán. - Xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán HIV bằng dot blot,độ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Luận văn cao họcK12 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS Quá trình diễn biến HIV/AIDS trên thế giới chia 3 giai đoạn [21]. - Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981. HIV đã bắt đầu xuất hiện âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX. Ngƣời ta đã tìm thấy kháng thể (KT) kháng HIV trong các mẫu máu đƣợc bảo quản ở Zaire (1959) và ở Mỹ (1970). - Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985. Ở thời kỳ này, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc virus, xác định đƣợc phƣơng thức truyền bệnh và phát triển các kỹ thuật phát hiện virus. + Năm 1981, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xác định đƣợc những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) đầu tiên trên thế giới dựa trên sự phát hiện và mô tả bệnh của bác sỹ Michạel Gottlieb về 5 thanh niên đồng tính luyến ái bị viêm phổi nặng do Pneumocystis carinii ở Los Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 Luận văn cao họcK12 Điều đặc biệt là ở những bệnh nhân này đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn dịch, về cả số lƣợng và chức năng của tế bào miễn dịch, quan trọng nhất là sự giảm tế bào TCD4. + Năm 1982, nhiều nơi đã công bố căn bệnh tƣơng tự nhƣ trên ở các bệnh nhân phải truyền máu nhiều lần, ở các đối tƣợng nghiện chích ma tuý, ở những ngƣời mẹ và đứa con do họ đẻ ra. Cuối 1982, dựa trên những trƣờng hợp AIDS đầu tiên đƣợc thông báo, CDC đã đƣa ra tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chƣa có phƣơng pháp xét nghiệm căn nguyên. + Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế đã thống nhất gọi tên các virus LAV (Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III), ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human Immunodefiency Virus- HIV). + Năm1984-1985, đã xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III và chuẩn hoá bộ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym ELISA để sàng lọc máu và phát hiện lâm sàng - Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế giới chống AIDS. + Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng đầu tiên với AZT (Azidothymidine) nhƣ một thuốc chống Retrovirus. + Năm 1989, đƣa ra các hƣớng dẫn điều trị bằng AZT cho những ngƣời nhiễm HIV và bệnh nhân AIDS trên cơ sở số lƣợng tế bào TCD4 của ngƣời bệnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 Luận văn cao họcK12 + Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Luận văn cao họcK12 1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới Đại dịch HIV/AIDS tuy xuất hiện chƣa lâu, mới bắt đầu vào những năm 70-80 của thế kỷ XX nhƣng đã nhanh chóng lan tràn trên toàn cầu, tấn công mọi đối tƣợng không phân biệt lứa tuổi, nghề nghiệp, địa vị xã hội nhƣ phụ nữ, trẻ em, thanh niên, ngƣời có tuổi, ngƣời đồng tính luyến ái, ngƣời nghiện chích ma tuý. Dịch liên tục phát triển về cả không gian và thời gian trở thành đại dịch nguy hiểm. Đại dịch này gồm nhiều vụ dịch xảy ra ở từng nƣớc, từng lục địa, có phƣơng thức lây truyền, biểu hiện lâm sàng đặc trƣng riêng phụ thuộc vào nguồn gốc virus, đối tƣợng nhiễm, điều kiện kinh tế xã hội và tập quán từng nƣớc. Ban đầu xuất hiện, dịch chủ yếu xảy ra tại các nƣớc công nghiệp phát triển ở Bắc Mỹ, Úc, và Tây Âu, tại các thành phố lớn, ở những ngƣời đồng tính luyến ái và ngƣời nghiện chích ma tuý. Từ đó, dịch lan tràn khắp các nƣớc, gây tác hại to lớn tại châu Phi, vùng Caribe với số lƣợng ngƣời nhiễm HIV rất cao. Đến nay, khu vực Nam phi vẫn là vùng có số lƣợng bệnh nhân cao nhất trên thế giới và riêng tại khu vực Sahara đã có tới 25,8 triệu ngƣời nhiễm HIV, chiếm 64% tổng số ngƣời nhiễm HIV trên thế giới. Ở Châu Á, dịch HIV/AIDS đến muộn bắt đầu từ cuối những năm 80 của thế kỷ XX nhƣng phát triển rất nhanh với phƣơng thức lây truyền đa dạng phản ánh tính đa dạng về xã hội, kinh tế và văn hoá.Theo dự đoán của WHO, đại dịch HIV/AIDS sẽ có xu thế dịch chuyển về Châu Á mà điểm nóng là Thái lan, Ấn Độ, Campuchia và Indonesia.Vì vậy cần phải có các chƣơng trình khống chế và dự phòng HIV/AIDS kịp thời, mạnh mẽ. Một tình trạng đáng báo động khi 70% ngƣời dân Ontania trên đảo Bomeo, Indonesia kết quả xét nghiệm HIV dƣơng tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn 8