Tài liệu Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo nannochloropsis đạt mật độ cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRƯƠNG VĂN TUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ BỔ SUNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO NUÔI TẢO Nanocholoropsis oculata ĐẠT MẬT ĐỘ CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRƯƠNG VĂN TUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ BỔ SUNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO NUÔI TẢO Nanocholoropsis oculata ĐẠT MẬT ĐỘ CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 60620301 Quyết định giao đề tài: 1731/QĐ-ĐHNT ngày 26/12/2013 Quyết định thành lập HĐ: 967/QĐ-HĐNT ngày 08/11/2016 Ngày bảo vệ: 28/11/2016 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN NGUYÊN Chủ tịch Hội đồng: TS. LỤC MINH DIỆP Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Hải Phòng, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả Trương Văn Tuân iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Nguyên, Phó Viện trưởng Viện nghiên cứu Hải sản, Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Đào Duy Thu, Ths. Nguyễn Công Thành cùng các cán bộ nghiên cứu phòng Nghiên cứu Công nghệ sinh học biển, Trung tâm Quan trắc môi trường biển, Viện nghiên cứu Hải sản đã luôn tạo điều kiện làm việc tốt nhất để tôi hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện nghiên cứu Hải sản đã tạo những điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo, các cán bộ giảng dạy và nghiên cứu của Viện Nuôi trồng thủy sản, Khoa Sau đại học, Trường Đại học Nha Trang đã luôn tận tình giảng dạy trong thời gian học tập tại trường và đưa ra những lời góp ý trong việc hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với các nhà khoa học đã đọc và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho việc hoàn thiện bản luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hải Phòng, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Trương Văn Tuân iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................. vii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .............................................................................................x MỞ ĐẦU ........................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..............................................4 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................4 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................7 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và chất lượng của tảo ................................9 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................14 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu....................................................14 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................14 2.1.2. Thời gian nghiên cứu..................................................................................14 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................16 2.2.1. Vật liệu thí nghiệm .....................................................................................16 2.2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu.................................................................16 2.2.3. Bố trí thí nghiệm.........................................................................................17 2.2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .....................................................21 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................................24 3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng quần thể của tảo Nannochloropsis oculata..........................................................................................24 3.1.1. Biến động của một số điều kiện môi trường thí nghiệm ............................24 3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tốc độ sinh trưởng và mật độ của quần thể tảo Nannochloropsis oculata ...........................................................26 3.2. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung đến sinh trưởng quần thể của tảo Nannochloropsis oculata..........................................................................................34 3.2.1. Biến động của một số điều kiện môi trường thí nghiệm ............................34 v 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung đến tốc độ sinh trưởng và mật độ của quần thể tảo Nannochloropsis oculata .................................................................35 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ.............................................................41 4.1. Kết luận..............................................................................................................41 4.2. Khuyến nghị ......................................................................................................41 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................42 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CI : Confidential interval - Khoảng tin cậy ĐC : Đối chứng EPA : Axít Eicosapentaenoic (C20:5n-3) L : Lít N. oculata : Nannochloropsis oculata NTTS : Nuôi trồng thủy sản PBR : Photobioreactor (bình phản ứng quang sinh) ppm : Parts per million (phần triệu) PUFA : Polyunsaturated Fatty Acid, axít béo có mạch cacbon C16; C18; C20 hoặc C22 tb/L : tế bào/lít tb/mL : tế bào/mililít tb/ngày : tế bào/ngày vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Lượng bổ sung môi trường và ký hiệu cho từng lô thí nghiệm ....................19 Bảng 2.2. Khoảng thời gian bổ sung môi trường và ký hiệu cho từng lô thí nghiệm ...21 Bảng 3.2. Tốc độ sinh trưởng quần thể của tảo N. oculata trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau............................................................................................................31 Bảng 3.3. Mật độ tế bào (106 tb/mL) tảo N. oculata trong các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau............................................................................................................32 Bảng 3.5. Mật độ tế bào (106 tb/mL) tảo N. oculata theo thời gian bổ sung môi trường khác nhau .......................................................................................................................36 Bảng 3.6. Tốc độ sinh trưởng quần thể của tảo N. oculata theo thời gian bổ sung khác nhau ...............................................................................................................................39 Bảng 4.1. Kết quả phân tích ANOVA kiểm tra sai khác về nhiệt độ, độ mặn và trị số pH trong phòng thí nghiệm................................................................................................ Bảng 5.1. Kết quả phân tích ANOVA kiểm tra sai khác về nhiệt độ và trị số pH trong các túi nuôi ngoài trời ........................................................................................................ viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hệ thống nuôi tảo Photobioreactor (PBR) ......................................................5 Hình 2.2. Vi tảo Nannochloropsis oculata được quan sát dưới kính hiển vi................15 Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 1 ............................................................17 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí lô thí nghiệm nội dung 1............................................................18 Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 2 ............................................................20 Hình 2.6. Vị trí bố trí lô thí nghiệm nội dung 2 ............................................................21 Hình 3.1. Biến động nhiệt độ, độ mặn và trị số pH theo thời gian nuôi trong phòng thí nghiệm ...........................................................................................................................25 Hình 3.2. Chu kỳ sinh trưởng của tảo N. oculata trong các lô thí nghiệm bổ sung môi trường dinh dưỡng khác nhau........................................................................................28 Hình 3.3. So sánh mật độ cực đại của các lô thí nghiệm ở các môi trường nuôi khác nhau (Mean±0,95CI) .....................................................................................................30 Hình 3.4. Tốc độ sinh trưởng quần thể trung bình của tảo trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau............................................................................................................32 Hình 3.5. Biến động nhiệt độ và trị số pH theo thời gian nuôi ngoài trời.....................35 Hình 3.6. Chu kỳ sinh trưởng của tảo N. oculata trong các lô thí nghiệm chế độ thời gian bổ sung môi trường................................................................................................37 Hình 3.7. Biểu đồ so sánh mật độ cực đại giữa các chế độ thời gian bổ sung môi trường khác nhau (Mean±0,95CI) .................................................................................38 Hình 3.8. Tốc độ sinh trưởng quần thể trung bình của tảo theo thời gian bổ sung khác nhau ...............................................................................................................................40 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tảo Nannochloropsis oculata có hàm lượng dinh dưỡng cao, không chỉ có ý nghĩa sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống hải sản mà còn có tiềm năng làm thực phẩm chức năng cho người sử dụng. Tảo N. oculata chứa rất nhiều loại axít béo đa nối đôi không bão hòa (PUFA) trong đó đáng lưu ý nhất là các axít béo eicosapentaenoic EPA (20:5n-3, EPA). Loài tảo này còn chứa một hàm lượng lớn các sắc tố β-carotene, một hoạt chất có vai trò rất quan trọng chống oxy hóa, chống viêm, giúp ngăn ngừa, trì hoãn sự phát triển của ung thư, trong tảo khô còn có chứa nhiều loại muối khoáng quan trọng thiết yếu cho cơ thể con người. Do có thành phần dinh dưỡng toàn diện và hàm lượng dinh dưỡng cao nên các loài vi tảo thường được sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, một số được làm thực phẩm chức năng, bổ sung các chất thiết yếu cho cơ thể sống. Việc nuôi sinh khối N. oculata cho mật độ cao là một yêu cầu bức thiết. Để đạt được mục đích này, nhiều tác giả ngoài nước đã nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi sinh khối và chỉ ra điều kiện tối ưu là nhiệt độ (20 - 25 0C), độ mặn 27 - 30 ‰, pH 7,5 - 8,5, ánh sáng 80 - 130µM photon.s-1. Chế độ sục khí 25% thể tích với CO2 bổ sung 1 - 2%. Tuy nhiên, mỗi tác giả sử dụng một công thức môi trường riêng mặc dù các thực nghiệm của họ có thể nuôi tảo đạt mật độ và sinh khối khá cao. Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi sinh khối tảo N. oculata chủ yếu phục vụ sản xuất giống thủy sản. Điều kiện nuôi tảo trong các môi trường khác nhau và các tác giả cũng sử dụng một môi trường riêng biệt. Việc bổ sung môi trường khác nhau theo từng giai đoạn phát triển của tảo và mỗi loại môi trường cũng cần có chế độ bổ sung khác nhau theo thời gian. Tỉ lệ thu hoạch phù hợp từ 10 - 15% lượng sinh khối bổ sung môi trường hàng ngày vẫn giữ nguyên tốc độ sinh trưởng quần thể. Trong nuôi công nghiệp, khi tảo đạt được mật độ cao trên 150106 tb/mL (pha cân bằng) sẽ tiến hành thu hoạch 30% sinh khối. Do đó, cần phải xác định chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng để tảo nhanh chóng phục hồi mật độ ở pha cân bằng nhằm duy trì năng suất thu hoạch là vô cùng quan trọng. Từ những vấn đề trên, tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao”. Mục tiêu của luận văn nhằm xác định được loại môi trường và khoảng thời gian bổ sung môi trường thích hợp cho nuôi tảo N. oculata đạt mật độ cao. Để hoàn thành mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện 2 nội dung nghiên cứu: (1) Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi x tảo N. oculata đạt mật độ cao; và (2) Nghiên cứu xác định khoảng thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả nuôi tảo N. oculata. Nguồn số liệu sử dụng trong luận văn được thu thập từ kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ tảo Nannochloropsis oculata” thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện từ 2013 – 2015 do TS. Nguyễn Văn Nguyên là chủ nhiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng f/2 làm môi trường vẫn đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển cho vi tảo trong điều kiện nuôi sinh khối tảo N. oculata. Đối với việc bổ sung môi trường dinh dưỡng f/2 có tăng thêm 100% hàm lượng N và P (f/2-100) cho mật độ cao nhất đạt 149,5106 tb/mL với chu kỳ sinh trưởng kéo dài khoảng 21 ngày. Các giá trị lần lượt là 127,6106 tb/mL, 124,0106 tb/mL, 119,9106 tb/mL và 110,5106 tb/mL với môi trường f/2-150, f/2, Walne, f/2-50. Với môi trường f/2 và Walne, pha cân bằng đạt ở ngày thứ 13; pha cân bằng của môi trường f/2-50, f/2-100 và f/2-150 đạt ở ngày 15, 19 và 17. Tốc độ sinh trưởng trung bình khi sử dụng môi trường f/2-100 cho trị số cao nhất (K = 0,343), cao hơn so với 4 loại môi trường còn lại. Theo số liệu thống kê, môi trường f/2-100 cho mật độ cực đại cao hơn rõ rệt so với các môi trường thí nghiệm khác và giữa các môi trường thí nghiệm này cho mật độ cực đại khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Với chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng có tăng thêm 100% hàm lượng N và P (f/2-100) theo chế độ thời gian bổ sung khác nhau, giá trị mật độ tảo cao nhất là 179,3106 tb/mL, 164,9106 tb/mL, 160,6106 tb/mL, 148,9106 tb/mL và 138,3106 tb/mL tương ứng lần lượt với 1, 3, 4, 2 và 0 ngày/lần. Giá trị tốc độ sinh trưởng tại các lô thí nghiệm khá tương đồng và đều có xu thế suy tàn vào ngày thứ 18 trong 20 ngày theo dõi. Tuy nhiên, số liệu thống kê phân tích ANOVA một nhân tố với kiểm định Turkey test (P value = 0,09733) chứng tỏ sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về mật độ cực đại giữa các chế độ bổ sung môi trường khác nhau, điều đó có nghĩa rằng trong quá trình nuôi sinh khối tảo N. oculata, chế độ thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng không phải là yếu tố quyết định đến năng suất sinh khối. Chính vì vậy, tùy thuộc vào mục đích của việc nuôi tảo N. oculata, cần xem xét tần suất bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi đảm bảo kinh tế và hiệu quả. Từ khóa: Nannochloropsis oculata, mật độ, tốc độ sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng, thời gian. xi MỞ ĐẦU Tảo Nannochloropsis oculata là loài tảo có hàm lượng dinh dưỡng cao không chỉ có ý nghĩa sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống hải sản mà còn có tiềm năng làm thực phẩm chức năng cho người sử dụng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra N. oculata chứa rất nhiều loại axít béo đa nối đôi không bão hòa (PUFA) trong đó đáng lưu ý nhất là các axít béo eicosapentaenoic - EPA (20:5n-3, EPA), với hàm lượng chiếm đến 24,5- 40% tổng axít béo [56]. Đây là những chất giúp chống suy nhược cơ thể [16], ngăn chặn tình trạng máu nhiễm mỡ, chống các bệnh về tim mạch, xơ vữa động mạch, làm giảm viêm nhiễm [51,28], giảm chứng khối huyết [37]. Loài tảo này còn chứa một hàm lượng lớn các sắc tố β-carotene [31,47], một hoạt chất có vai trò rất quan trọng chống oxy hóa, chống viêm, giúp ngăn ngừa, trì hoãn sự phát triển của ung thư [66]. Bên cạnh đó, trong 100g tảo khô ngoài những chất được xem là nguồn dinh dưỡng thiết yếu, Nannochloropsis oculata còn có chứa nhiều loại muối khoáng quan trọng như Ca (972 mg), K (533 mg), Na (659 mg), Mg (316 mg), Zn (103 mg), Fe (136 mg), Mn (3,4 mg), Cu (35,0 mg), Ni (0,22 mg), and Co (<0,1 mg) thiết yếu cho cơ thể con người [55]. Do có thành phần dinh dưỡng toàn diện và hàm lượng dinh dưỡng cao nên các loài vi tảo thường được sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, một số được làm thực phẩm chức năng, bổ sung các chất thiết yếu cho cơ thể sống. Hiện nay, do nguồn tài nguyên xăng dầu nguồn gốc hóa thạch đang khan hiếm, loài tảo Nannochloropsis oculata với tỷ lệ cao hàm lượng lipid cao còn được nuôi sinh khối làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học. Một ví dụ điển hình là dự án sản xuất xăng dầu sinh học lớn nhất thế giới đang hoạt động tại Indonesia. Ở đây tảo N. oculata chủ yếu được nuôi trong các hệ thống quang sinh (photobioreactor) dạng ống với năng suất ước tính khoảng 70 tấn/ha/năm, cao gấp ba lần năng suất thực vật bậc cao hiện đạng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất xăng dầu (http://www.algaetech.com). Như vậy, dù với mục đích sử dụng nào, nuôi sinh khối N. oculata cho mật độ cao là một yêu cầu bức thiết. Để đạt được mục đích này, nhiều tác giả ngoài nước đã nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi sinh khối và chỉ ra điều kiện tối ưu là nhiệt độ (20 - 25 0C), độ mặn 27 - 30 ‰, pH 7,5 - 8,5, ánh sáng 80 – 130 µM photon.s-1. Chế độ sục khí 25% thể tích với CO2 bổ sung 1 - 2% (e.g. http://www.algaetech.com 1 [13,22,23,58,59]. Tuy nhiên, mỗi tác giả sử dụng một công thức môi trường riêng, ví dụ Cái Ngọc Bảo Anh (2010) sử dụng môi trường dinh dưỡng với nguồn nitơ dạng NO3- và NH4+ [2]; Converti et al. (2009) và Chiu et al. (2009) sử dụng môi trường f/2 [22,23], Sen et al. (2005) sử dụng công thức môi trường tự tạo [58], Gu et al. (2012) dùng môi trường f/2 có bổ sung Ure [32], Su et al. (2011) dùng môi trường Walne [60],… mặc dù các thực nghiệm của họ có thể nuôi tảo đạt mật độ và sinh khối khá cao. Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi sinh khối tảo N. oculata chủ yếu phục vụ sản xuất giống thủy sản. Điều kiện nuôi tảo trong các môi trường khác nhau, mỗi tác giả cũng sử dụng một môi trường riêng. Cao Văn Hạnh [5] sử dụng môi trường conway-walne với lượng 1ml/L nước nuôi hoặc môi trường f/2 cho kết quả đạt 14106 - 15106 tb/mL, trong khi đó đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi thâm canh và thu sinh khối vi tảo Isochrysis galbana và Nannochloropsis oculata phục vụ sản xuất giống hải sản” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II đang tiến hành với mục tiêu xây dựng được qui trình công nghệ nuôi thâm canh loài vi tảo N. oculata đạt mật độ >150106 tb/mL. Mặt khác, việc bổ sung môi trường khác nhau theo từng giai đoạn phát triển của tảo và mỗi loại môi trường cũng cần có chế độ bổ sung khác nhau theo thời gian. Chiu et al. (2009) thu hoạch 10 - 15% lượng sinh khối bổ sung môi trường hàng ngày vẫn giữ nguyên tốc độ sinh trưởng quần thể [22]. Trong nuôi công nghiệp, khi tảo đạt được mật độ cao trên 150106 tb/mL (pha cân bằng) sẽ tiến hành thu hoạch 30% sinh khối. Do đó, cần phải xác định chế độ bổ sung môi trường để tảo nhanh chóng phục hồi mật độ ở pha cân bằng nhằm duy trì năng suất thu hoạch là vô cùng quan trọng. Từ những vấn đề tồn tại nêu trên, tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao”. Nội dung nghiên cứu của đề tài này cũng là một phần nội dung nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ tảo Nannochloropsis oculata” do Viện Nghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện từ 2013 – 2015 (TS. Nguyễn Văn Nguyên là chủ nhiệm đề tài).  Mục tiêu của đề tài  Mục tiêu chung của đề tài: 2 Nâng cao hiệu quả nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao.  Mục tiêu cụ thể: Xác định được loại môi trường và khoảng thời gian bổ sung môi trường thích hợp cho nuôi tảo N. oculata đạt mật độ cao.  Nội dung nghiên cứu  Nội dung 1: Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao.  Nội dung 2: Nghiên cứu xác định khoảng thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả nuôi tảo Nannochloropsis oculata.  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Về khoa học: Kết quả của đề tài sẽ giải đáp một câu hỏi lớn về loại môi trường nào thích hợp cho nuôi công nghiệp tảo N. oculata và khoảng thời gian bổ sung như thế nào. Về thực tiễn sản xuất: Kết quả của đề tài có tiềm năng ứng dụng rất lớn vào sản xuất. Hiện tại, ở Việt Nam mật độ tảo N. oculata đang nuôi ở các trại sản xuất giống thủy sản thường đạt rất thấp (dưới 50106 tb/mL) và không ổn định. Các mô hình nuôi công nghiệp sử dụng hệ thống quang sinh kín (photobioreactor) ở Việt Nam cũng chỉ đạt mật độ cao nhất khoảng trên 150106 tb/mL. Do đó, kết quả nghiên cứu có thể là chìa khóa để nâng cao hiệu quả sản xuất sinh khối tảo N. oculata phục vụ nuôi trồng thủy sản cũng như các mục đích sử dụng khác cần có sinh khối tảo ở mật độ cao. 3 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới  Các phương pháp kỹ thuật nuôi sinh khối tảo N. oculata Kỹ thuật nuôi sinh khối vi tảo được phát triển từ khoảng giữa thế kỷ trước [59] và đã trở nên khá đa dạng hiện nay. Có thể phân loại các hệ thống nuôi hiện nay thành hai loại chính là hệ thống nuôi kín và hệ thống hở. Hệ thống hở sử dụng cách nuôi bằng thùng, bể, ao, cho phép tảo tiếp xúc trực tiếp với không khí bên ngoài. Hệ thống hở có ưu điểm là giá thành rẻ, dễ vận hành và có thể thực hiện được trên quy mô lớn nhưng có sự hạn chế là mật độ thu được thấp và không duy trì được lâu vì nguy cơ nhiễm nấm, vi khuẩn và động vật nguyên sinh [52,61]. Hệ thống hở phù hợp với mục đích nuôi tảo không cần đạt mật độ cao và không cần quá tinh sạch. Trong thực tế, hệ thống này được sử dụng khá phổ biến, nhất là trong nuôi trồng thủy sản hoặc nuôi sinh khối tảo làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học. Hệ thống kín thường sử dụng túi nilon, ống hoặc bình kín, không cho phép tảo tiếp xúc trực tiếp với không khí, trong nhiều trường hợp, chẳng hạn hệ thống quang sinh kín (Photobioreactor) là hệ thống nuôi mà các thông số như nhiệt độ, ánh sáng, pH, hàm lượng CO2 được kiểm soát chặt chẽ, tạo điều kiện tối ưu cho tảo phát triển nên thường cho mật độ cao và chất lượng tảo tốt, ít bị tạp nhiễm. Việc nuôi tảo làm thực phẩm chức năng đòi hỏi phải có sự kiểm soát chặt chẽ các khâu vệ sinh an toàn thực phẩm và chống nhiễm khuẩn nên mô hình nuôi bằng hệ thống quang sinh kín được đánh giá là phù hợp hơn. Photobioreactor (PBR), hay bình phản ứng quang sinh là thiết bị sinh học cho phép nguồn ánh sáng xuyên qua để cung cấp năng lượng lượng tử cho các phản ứng quang hoá. PBR là hệ thống nuôi khép kín, cho phép kiểm soát các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, cường độ ánh sáng, hạn chế nhiễm tạp, sự thất thoát CO2, sự bốc hơi nước v.v… Nhờ đó, thiết bị này dùng nuôi vi tảo rất hiệu quả, cho phép nuôi tảo đạt mật độ rất cao, gấp hàng chục lần, thậm chí hàng ngàn lần so với mật độ nuôi trong các hệ thống thông thường [50,65]. Hiện nay, có một số dạng PBR đang được sử dụng như giàn ống đứng (tubular PBR) [43], tấm panel phẳng (flat panel PBR) [20], dạng chữ V có 2 mặt phẳng (flat4 sided PBR) [41], dạng túi tổ ong (vertical alveolar PBR) [64], dạng bể hình trụ (cylinder PBR) và loại mới thiết kế gần đây nhất là dạng xoắn ốc (spiral PBR) [20]. Nguồn sáng cho các hệ thống PBR có thể là ánh sáng tự nhiên (solar), ánh sáng huỳnh quang (flourescent) hoặc đèn diot (LED). Hình 2.1. Hệ thống nuôi tảo Photobioreactor (PBR) Briassoulis et al. (2010) thử nghiệm nuôi N. oculata trong PBR dạng ống với các điều kiện tối ưu về chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng, hạn chế nhiễm tạp kèm theo chế độ sục khí và bổ sung CO2 hợp lý đã đạt mật độ tối đa trên 350106 tb/mL [17]. Hệ thống này đã đạt mức tăng mật độ khoảng 30x106 tb/mL/ngày, đảm bảo tỷ lệ thu hoạch 10%/ngày theo hình thức nuôi thu liên tục. Các hệ thống PBR đặt ngoài trời cũng cho sản lượng rất cao như PBR dạng panel nuôi N. oculata đạt sản lượng thu 12,1g/m2/ngày [57]; hệ thống tubular PBR nuôi I. galbana cho mật độ tối đa đạt 2 g/L với tốc độ sinh trưởng đặc biệt (SGR) đạt 0,38g/ngày và sản lượng thu đạt 0,32g/L/ngày theo hình thức nuôi thu bán liên tục [30]. PBR hiện đang được coi là một trong những giải pháp hữu hiệu để nuôi sinh khối tảo ở quy mô lớn, phục vụ nuôi trồng thuỷ sản và làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghệ khác. Tuy nhiên, bên cạnh việc lựa chọn được mô hình nuôi phù hợp theo mục đích, những yếu tố, điều kiện nuôi khác nhau có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi tảo cho mật độ cao và chất lượng sinh khối thu được. 5  Các điều kiện nuôi cấy cần chú trọng trong nuôi vi tảo N. oculata Tảo N. oculata cũng giống như các sinh vật tự dưỡng khác, cần ánh sáng, CO2, muối dinh dưỡng và các khoáng chất và một trường phù hợp để sinh trưởng. Trong quá trình nuôi tảo N. oculata, các nhà khoa học đã ghi nhận những điểm cần lưu ý dưới đây. Tảo N. oculata tuy có ngưỡng chịu nhiệt rất rộng (2 - 29o C) nhưng dải nhiệt độ tối ưu cho loài này lại khá hẹp, khoảng 20 - 25o C [50]. Bởi vậy, nhiệt độ sẽ là yếu tố quan trọng tác động đến sinh trưởng của loài tảo này. Trong quá trình nuôi, cần phải có biện pháp duy trì nhiệt độ trong khoảng tối ưu để tảo sinh trưởng tốt. CO2 không chỉ cần thiết cho quá trình quang hợp của tảo, mà còn là yếu tố then chốt trong việc điều chỉnh độ pH. Trong các hệ thống quang sinh, độ pH thường tăng lên rất cao khi tảo đạt mật độ cao, do quá trình quang hợp lấy đi rất nhiều CO2 từ môi trường. Độ pH lớn hơn 9 sẽ trở thành yếu tố ức chế sự phát triển của vi tảo. Sử dụng CO2 bổ sung được coi là giải pháp tối ưu để ổn định pH và cung cấp nguyên liệu cho quá trình quang hợp. Chiu et al. (2009) đã thử nghiệm các chế độ bổ sung CO2 khác nhau từ 2 - 15% và kết luận mức 2% cho sinh khối và tỷ lệ hàm lượng lipid cao nhất [22]. Ngoài việc bổ sung đủ hàm lượng CO2, các thành phần chứa nguồn C khác như NaC2H3O2 và NaHCO3 cũng cần được bổ sung để tảo đạt được tốc độ sinh trưởng tốt nhất. Muối nitơ là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo do nitơ là thành phần cơ bản cấu tạo nên các loại protein trong tế bào, nhiều loại vitamin (B1, B2, B6, BP). Nó cũng là thành phần quan trọng của hệ enzym oxy hóa khử và nhiều enzym quan trọng khác. Việc điều chỉnh hàm lượng nitơ trong môi trường cũng có thể điều khiển được tốc độ sinh trưởng của tảo. Dumaz (2007) thử nghiệm và nhận thấy, khi giảm hàm lượng nitơ thì sự tích lũy của α-tocopherol tăng lên, đồng thời tốc độ sinh trưởng của tảo bị giảm xuống [25]. Oxy cần cho sự sống nhưng trong điều kiện nuôi tảo mật độ cao, hàm lượng có thể lên cao do quá trình quang hợp, khiến cho tảo sẽ bị ức chế và giảm tốc độ sinh trưởng. Theo Molina et al. (1994) trong điều kiện nuôi ngoài trời, hàm lượng oxy hoà tan có thể đạt tới 400% mức độ bão hoà, gây hiệu ứng ức chế tảo. Để nuôi tảo đạt mật độ cao theo yêu cầu, cần phải có biện pháp điều chỉnh nhằm đảm bảo hàm lượng oxy ở 6 mức vừa phải. Hệ thống quang sinh kín được đánh giá là phù hợp để giải quyết vấn đề này [49]. Chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng cố định CO2 và tạo sinh khối của vi tảo [42]. Theo Tzovenis et al. (2003), sử dụng hệ thống quang sinh (PBR) với cường độ ánh sáng trong khoảng từ 120 - 460 µmol/m2/s, tốc độ sinh trưởng của tảo là tỷ lệ thuận với tổng cường độ chiếu sáng [65]. Tuy nhiên tác giả này cũng tìm thấy, chế độ chiếu sáng gián đoạn (16h:8h và 12:12h) cho sinh khối cao hơn chế độ chiếu sáng liên tục (24h:0h). Đối với tảo N. oculata nuôi trong hệ thống PBR, Zou & Richmond (1999) đã xác định cường độ ánh sáng và khoảng cách chiếu sáng tối ưu là 10cm sẽ cho sinh khối và sản lượng EPA cao nhất [68]. Chế độ khuấy đảo cũng rất quan trọng đối với sinh trưởng của tảo. Sự khuấy đảo sẽ giúp các tế bào tảo chuyển động, tăng khả năng tiếp xúc với ánh sáng, hạn chế hiện tượng tự che khuất (self shading) khi mật độ tảo cao, đồng thời giúp giải phóng bớt oxy, tăng khả năng hấp thụ CO2 và hạn chế sự kết vón, lắng đáy. Theo Gudin & Chaumont (1991), mặt trái của phương pháp khấy trộn (đặc biệt khi dùng bơm) là dễ làm vỡ tế bào tảo [33]. Bởi vậy cần cân nhắc khi lựa chọn phương pháp và mức độ khuấy đảo. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Vi tảo biển được nghiên cứu ở Việt Nam từ khá lâu. Tuy nhiên, lĩnh vực nuôi sinh khối mới chỉ tập trung vào mục đích làm thức ăn ương nuôi ấu trùng của động vật thủy sản. Từ năm 1999, Lê Viễn Chí và cs đã phân lập và nuôi giữ được hai loài tảo Skeletonema costatum và Chaetoceros sp [3]. Các nghiên cứu này đã tập trung đánh giá ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái như nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn và dinh dưỡng lên sinh trưởng và phát triển quần thể của hai loài tảo này. Trong khi đó, một số nhóm tảo khác như Chaetoceros, Chlorellasp., Platymonas sp., N. oculata, Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana, Pavlova… cũng được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản. Chúng là những loài thường được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng và động vật hai mảnh vỏ. Những năm gần đây, do N. oculata được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, chúng đã lôi kéo được sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong nước. 7 Phạm Thị Lam Hồng (1999) nghiên cứu một số thông số của quá trình nuôi như độ mặn, ánh sáng và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hóa của loài vi tảo N. oculata trong điều kiện phòng thí nghiệm [7]. Tác giả này đã chỉ ra rằng N. oculata có thể phát triển ở độ mặn 10 - 35 ‰ nhưng phát triển tốt nhất ở 30 32 ‰. Nghiên cứu cũng đã ứng dụng các kỹ thuật để nuôi bán liên tục loài tảo này, cung cấp tảo cho sản xuất động vật phù du phục vụ quy trình ương các loại ấu trùng động vật biển. Trần Văn Tựa (2002) nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của N. oculata để nhân nhanh trong điều kiện phòng thí nghiệm [12]. Theo đó, tác giả đã nhân nhanh vi tảo này trong điều kiện phòng thí nghiệm và đạt mật độ từ 50 - 150×106 tb/mL. Đặng Diễm Hồng (2008) đã thử nghiệm thành công các mô hình nuôi N.oculata ở các điều kiện khác nhau, từ điều kiện nuôi trong nhà với thể tích 1 - 5 lít đến túi nilon với thể tích 50-60 lít và nuôi bể composit 1 - 2 m2 để phục vụ sinh sản nhân tạo ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) [6]. Tất cả các lô thí nghiệm đều sử dụng môi trường nuôi Walne 30%. Kết quả cho thấy, ở môi hình nuôi 1 - 5 lít trong nhà, mật độ cực đại đạt được của N. oculata là 30×106 tb/mL và thời gian đạt mật độ cực đại là 4 ngày. Ở mô hình nuôi túi nilon 50 - 60 lít mật độ cực đại đạt được là 24,8×106 tb/mL với thời gian mật độ đạt cực đại là 3 ngày. Ở mô hình bể composite, mật độ cực đại đạt được là 20×106 tb/mL với thời gian mật độ đạt cực đại là 2 ngày. Chu Chí Thiết và Martins Kumar (2008) đã sử dụng vi tảo N. oculata kết hợp với hai loài tảo khác là Isochrysis galbana, Chaetoceros sp. để làm thức ăn cho ấu trùng ngao (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) trong quá trình sản xuất giống [10]. Tỷ lệ cho ấu trùng ngao ăn được duy trì với mật độ 100.000 tb/mL hỗn hợp của cả ba loài tảo trên. Sau 8 - 10 ngày cho ăn tảo, ấu trùng sẽ chuyển sang giai đoạn sống đáy đạt hiệu suất cao. Bùi Bá Trung và cs (2009) đã tiến hành một nghiên cứu khá bài bản tìm hiểu ảnh hưởng của mật độ nuôi ban đầu và tỷ lệ thu hoạch lên sinh trưởng của tảo N. oculata [11]. Theo đó, tảo được nuôi trong hệ thống ống dẫn trong suốt, nước chảy liên tục. Hệ thống nuôi bao gồm 10 ống thủy tinh được lắp đặt ngoài trời và có một hệ thống làm mát đi kèm để đảm bảo nhiệt độ trong suốt quá trình nuôi luôn ở mức độ thích hợp. 8 Nghiên cứu đã xác định được mật độ ban đầu thích hợp nhất cho nuôi sinh khối N. oculata là 8×106 tb/mL. Tác giả đã nuôi tảo N. oculata đạt mật độ cực đại là 61,07×106 tb/mL - mật độ rất cao so với các hệ thống nuôi N. oculata khác ở Việt Nam hiện nay, như túi nilon và bể composite. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỉ lệ thu hoạch 10% thể tích nuôi là phù hợp nhất. Cái Ngọc Bảo Anh và cs (2009) đã nghiên cứu điều chỉnh nồng độ và thay đổi một số muối nitơ trong môi trường f/2 để đánh giá sinh trưởng quần thể tảo N. oculata. Kết quả cho thấy, hàm lượng nitơ giảm (1/2 lần) kéo theo mật độ tảo ở đầu pha cân bằng giảm đáng kể. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng nitơ (1,5 - 2 lần) hầu như không làm thay đổi mật độ tảo khi thu hoạch. Hơn nữa, trong điều kiện nuôi cấy ở Việt Nam, hoàn toàn có thể sử dụng (NH4)2SO4 để thay thế NaNO3 trong môi trường f/2 mà không làm sai khác mật độ tảo so với điều kiện tiêu chuẩn ban đầu [1]. 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và chất lượng của tảo Tương tự như các loài vi tảo khác, sinh trưởng của N. oculata phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như dinh dưỡng môi trường nuôi, độ mặn, nhiệt độ, pH, hàm lượng CO2, cường độ ánh sáng,… [39]. - Yếu tố nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và sản xuất các hoạt chất có trong tế bào tảo. Vi tảo có thể sống được trong khoảng nhiệt độ từ 16 – 27 0C. Chúng sinh trưởng chậm ở dưới 16 0C và một số loài bị chết ở ngưỡng nhiệt độ trên 35 0C [24]. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù N. oculata có ngưỡng chịu nhiệt rộng nhưng dải nhiệt tối ưu cho loài này khoảng 20 - 25°C, trong đó nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nó ở 25 oC [50]. Nếu nhiệt độ cao hơn 35,0 oC thì tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 16,0 oC sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng của tảo. Trong quá trình nuôi, nếu tăng nhiệt độ từ 20 lên 25°C thì hàm lượng lipid trong tế bào N. oculata tăng gấp đôi (từ 7,9 - 14,92%) [23]. Đồng thời, khi tăng nhiệt độ, hàm lượng acid béo tổng số trong tế bào N. oculata tăng nhưng hàm lượng acid béo không no lại giảm [38]. Vì vậy, tùy theo mục đích nuôi để tảo sinh trưởng tốt cần có biện pháp tối ưu nhiệt độ sao cho thích hợp. Trong các hệ thống nuôi quang sinh kín, người ta thiết kế hệ thống làm mát thông qua hệ thống bể nông, phun sương hoặc qua hệ thống ống nhỏ ngâm trong bể nước [17]. 9