TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83
NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VÀ SÀNG LỌC DÒNG NẤM MEN Pichia pastoris
TÁI TỔ HỢP ĐA BẢN SAO BIỂU HIỆN NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG
TỪ TIỂU CẦU (BB-PDGF-BB) MỨC ĐỘ CAO
Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh,
Đặng Thị Phương Thảo*, Trần Linh Thước
Trường Đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh, *
[email protected]
TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức
FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét
chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái
tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf.
Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện
PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen
mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF
chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường.
Từ khóa: Pichia pastoris, dòng đa bản sao, đái tháo đường, PDGF-BB tái tổ hợp.
MỞ ĐẦU
PDGF (Platelet derived growth factor) là
một yếu tố phân bào chủ yếu của nguyên bào
sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được
sản xuất từ tiểu cầu. PDGF giữ nhiều chức năng
trong cơ thể, đặc biệt là chức năng tham gia
điều hòa và thúc đẩy quá trình làm lành vết
thương [6]. Protein này tác động đến nhiều tế
bào liên quan đến quá trình hàn gắn vết thương
như: kích thích sự phân bào và hướng hóa của
nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn, kích thích đại
thực bào sản xuất và tiết những nhân tố tăng
trưởng quan trọng, kích thích sự sản sinh những
phân tử fibronectin, collagen, proteoglycan và
hyaluronic acid. Trong giai đoạn tái tạo, PDGF
có vai trò kích thích sản xuất và tiết collagenase
bởi nguyên bào sợi cũng như sự co các sợi
collagen [1]. Với sự gia tăng bệnh đái tháo
đường như hiện nay, tỷ lệ bệnh nhân mắc chứng
loét chân ngày càng tăng. Tuy nhiên, tại Việt
Nam, nguồn cung cấp PDGF chủ yếu là từ nước
ngoài với giá thành cao. Điều này đặt ra yêu cầu
cấp thiết trong việc nghiên cứu công nghệ sản
xuất PDGF nhằm phát triển sản phẩm thuốc
điều trị có hiệu quả với giá thành hợp lý.
Trong số các hệ thống biểu hiện protein
người tái tổ hợp, Pichia pastoris được xem như
một hệ thống nổi bật với nhiều ưu điểm như dễ
nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến
đổi sau dịch mã. Bên cạnh các ưu điểm trên, hệ
thống này có tính bền vững di truyền qua nhiều
thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gen mục
tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men
theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA
plasmid và vùng trình tự tương đồng trên bộ gen
theo 2 cách: (1) gắn chèn vector vào bộ gen
nấm men hoặc (2) thay thế gen, loại bỏ hoàn
toàn gen AOX1 trong bộ gen nấm men. Số
lượng bản sao của gen mục tiêu sát nhập vào bộ
gen chủng chủ nấm men có thể là một trong các
yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện protein
mục tiêu. Hơn nữa, protein ngoại lai được tiết ra
ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính, vì thế,
quá trình thu nhận, tinh chế protein dễ dàng hơn
so với protein được biểu hiện ở dạng nội bào.
Ngoài ra so với Saccharomyces cerevisiae
protein được biểu hiện ở Pichia pastoris không
bị đường hóa quá mức và không hình thành liên
kết α-1,3 glycan, liên kết này được cho là gây ra
đáp ứng miễn dịch khi dùng trong trị liệu [2, 4,
5].
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu plasmid pPICZαA (V195-20,
Invitrogen); chủng E. coli DH5α [F-,
80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+),
phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1]
(Invitrogen) được cung cấp bởi Bộ môn Công
nghệ sinh học phân tử và Môi trường, Trường
77
Vuong Cat Khanh et al.
Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia
thành phố Hồ Chí Minh; chủng Pichia pastoris
X33 (C180-00, Invitrogen).
Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid
biểu hiện PDGF-BB (PDGF)
Gen pdgf được thu nhận bằng phương pháp
PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu FXhoI và RnotI.
Sản phẩm PCR (357 bp, mã hóa cho chuỗi
polypeptide dài 119 acid amin với khối lượng
phân tử là 17 KDa) sau khi tinh sạch được xử lý
với enzyme XhoI và NotI, sau đó nối vào vector
pPICZαA cũng đã được cắt mở vòng bằng 2
enzyme trên. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf
được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng
phương pháp hóa biến nạp, sử dụng yếu tố chọn
lọc là khả năng kháng kháng sinh zeocine.
Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được
kiểm tra sự chèn gen pdgf bằng kỹ thuật PCR
với cặp mồi FXhoI và 3’AOX, enzyme cắt giới
hạn XhoI và NotI, giải trình tự.
Tạo dòng tế bào Pichia pastoris X33 mang gen
mã hóa PDGF
Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được thu
nhận từ chủng E. coli DH5α bằng phương pháp
SDS kiềm, sau đó xử lý bằng enzyme SacI để
cắt mở vòng, điện biến nạp vào tế bào Pichia
pastoris (P. pastoris) X33 và được nuôi cấy trên
môi trường YPD (có thành phần gồm cao nấm
men 1%, peptone 2%, dextrose 2%, agar 2%
[7]) có nhân tố chọn lọc là zeocine 100 g/ml, ở
25oC, 3-5 ngày.
Kiểm tra kiểu hình, kiểu gen của các thể biến
nạp
Kiểm tra kiểu hình: các thể biến nạp được cấy
đồng thời lên hai môi trường MM (môi trường tối
thiểu chứa methanol có thành phần YNB 1,34%,
biotin 4.10-5%, methanol 0,5%) và MD (môi
trường tối thiểu có chứa dextrose có thành phần
YNB 1,34%, biotin 4×10-5%, glucose 2%), sau đó
đem ủ ở 25oC trong 3-4 ngày và quan sát.
Kiểm tra kiểu gen: bộ gen của các thể biến
nạp được tách chiết và kiểm tra kiểu gen bằng
phản ứng PCR với cặp mồi 5’AOX1 và
3’AOX1.
Xác định số bản sao của vector mang gen
trong bộ gen của P. pastoris bằng phương
pháp PCR bán định lượng
78
Bộ gen của các thể biến nạp sau khi pha
loãng trong khoảng 6.255 ng - 800 ng được
dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi
5’AOX1 và 3’AOX1 trong 20 chu kỳ. Kết quả
khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% và
phân tích bằng phần mềm ImageJ nhằm xác
định số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men.
Số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men
được tính thông qua tỷ lệ sản phẩm khuếch đại
chứa gen pdgf so với sản phẩm khuếch đại gen
AOX1, một gen nội sinh của nấm men. Các kết
quả phân tích được xử lý bằng phầm mềm
ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/download.html)
Đánh giá khả năng tăng trưởng và biểu hiện
của các thể biến nạp chứa nhiều bản sao
Một khuẩn lạc đơn X33, X33 chứa
pPICZαA và các thể biến nạp mang gen pdgf
được hoạt hóa trong môi trường BMGY lỏng
(có thành phần gồm cao nấm men 1%, peptone
2%, YNB 1,34%, 10% citrate buffer 1 M pH
4,0; biotin 4×10-5%, glycerol 1% [7]), nuôi cấy
lắc qua đêm 250 vòng/phút, ở 300C đến khi
OD600 của dịch nuôi cấy đạt 2-6. Sau đó sinh
khối được chuyển vào môi trường BMMY (có
thành phần như môi trường BMGY nhưng
glycerol được thay thế bằng methanol có nồng
độ cuối là 0,5% (v/v)) và tiếp tục nuôi cấy lắc.
Sau mỗi 24 giờ, bổ sung methanol đạt nồng độ
cuối 0,5%, đồng thời dịch nuôi cấy được thu
nhận, đo OD600 để đánh giá khả năng tăng
trưởng. Quá trình cảm ứng biểu hiện các thể
biến nạp trên môi trường BMMY pH 4,0 được
thực hiện tương tự như trên, 72 giờ sau cảm
ứng, dịch nuôi cấy được ly tâm 13000
vòng/phút, trong 5 phút, sau đó loại sinh khối,
thu nhận dịch môi trường. Sự biểu hiện protein
PDGF được kiểm tra bằng phương pháp điện di
trên gel SDS-PAGE, phân tích bằng phần mềm
Quantity One
((Biorad, http://www.biorad.com/en-us/product/quantity-one-1-danalysis-software) và lai Western
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid
biểu hiện PDGF
Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf sau khi tạo
thành được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Các thể biến nạp sau khi sàng lọc trên môi
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83
trường kháng sinh zeocine được tiếp tục kiểm tra
bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp
mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Các thể biến nạp cho
kết quả PCR khuẩn lạc dương tính (xuất hiện 1
a
vạch có kích thước vào khoảng 870 bp trên bản
điện di) được tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid
tái tổ hợp bằng phương pháp SDS-kiềm (kết quả
không được trình bày ở đây).
b
Hình 1. Sàng lọc vector tái tổ hợp mang gen pdgf
a. Sàng lọc vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR; a1. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen nấm men tái tổ
hợp; a2. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng PCR; b. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen pdgf bằng
phương pháp cắt giới hạn; b1. Vị trí enzyme cắt giới hạn trong vector; b2. Xử lý vector tái tổ hợp
bằng enzyme cắt giới hạn.
Nhằm phát hiện gen pdgf trên plasmid
pPICZαA/pdgf, plasmid tái tổ hợp được phân
tích bằng phương pháp sử dụng cặp mồi đặc
hiệu FXhoI (mồi xuôi) trên gen và 3’AOX1 (mồi
ngược) trên plasmid. Những plasmid pPICZαA
có chèn gen pdgf sẽ cho vạch DNA với kích
thước khoảng 540 bp, tương ứng với với kích
thước vạch gen pdgf cộng với một đoạn DNA
trên plasmid pPICZαA. Trong khi đó, với khuôn
là plasmid pPICZαA không mang gen pdgf nên
không có sản phẩm PCR (hình 1a).
Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
pPICZαA/pdgf bằng enzyme XhoI và NotI cho 2
vạch đúng như dự kiến: một vạch có kích thước
tương ứng với kích thước của plasmid
pPICZαA, và một vạch có kích thước tương ứng
với gen pdgf (hình 1b).
Đồng thời, kết quả giải trình tự gen pdgf trên
plasmid pPICZαA/pdgf bằng cặp mồi 5’AOX1
và 3’AOX1 sau khi so sánh với trình tự lý
thuyết do chúng tôi thiết kế và cải biên cho gen
pdgf biểu hiện trong nấm men bằng phần mềm
Jellyfish
(http://www.cbcb.umd.edu/
software/jellyfish/) cho độ tương đồng 100%.
Điều này cho phép kết luận chúng tôi đã tạo
dòng hóa thành công gen pdgf vào vector biểu
hiện pPICZαA trong tế bào E. coli DH5α.
Tạo dòng tế bào P. pastoris X33 mang gen mã
hóa PDGF
Plasmid pPICZα/pdgf được đưa về dạng
thẳng bằng cách xử lý với enzyme SacI và điện
biến nạp vào tế bào chủ P. pastoris X33. Các
thể biến nạp sau khi sàng lọc dựa trên khả năng
kháng kháng sinh zeocine được kiểm tra kiểu
hình và kiểu gen.
MM
MD
Hình 2. Kết quả kiểm tra kiểu hình nấm men
mang gen pdgf
79
Vuong Cat Khanh et al.
Khi DNA plasmid được sát nhập vào bộ gen
của tế bào chủ P. pastoris trong quá trình tái tổ
hợp tương đồng, gen AOX1 (mã hóa cho
enzyme alcohol oxidase, enzyme chính quy
định khả năng sử dụng methanol của P.
pastoris) có thể giữ lại hoặc bị loại bỏ, vì vậy
kiểu hình của thể biến nạp sẽ thay đổi. Nếu gen
AOX1 không bị mất đi, kiểu hình các thể biến
nạp thu được là Mut+, có khả năng tăng trưởng
tốt trên môi trường methanol. Nếu gen AOX1 bị
loại bỏ, thể biến nạp sẽ có kiểu hình MutS sinh
trưởng kém trên môi trường có methanol.
được tách chiết và thực hiện phản ứng PCR
kiểm tra kiểu gen bằng cặp mồi 5’AOX1 và
3’AOX1. Sản phẩm PCR từ các chủng Mut+ khi
điện di sẽ thu được 2 vạch. Một vạch có kích
thước 875 bp tương đương kích thước tổng của
gen pdgf và vùng gen AOX1 nằm trên plasmid.
Vạch còn lại có kích thước khoảng 2,2 kb,
tương ứng với gen AOX1 có sẵn trong bộ gen
của X33. Ở các chủng MutS thì không có vạch
2,2 kb này.
Kết quả so sánh sự phát triển của thể biến
nạp trên hai môi trường MD và MM, cho thấy
tất cả các thể biến nạp đều tăng trưởng tốt trên
cả hai môi trường (hình 2). Do đó, tất cả các thể
biến nạp đều có kiểu hình Mut+ (còn giữ lại gen
AOX1 trong bộ gen).
Kết quả PCR cho thấy ở tất các các dòng
đều xuất hiện 2 vạch trên bản điện di (hình 3),
điều này chứng tỏ tất cả các thể biến nạp đều có
kiểu hình Mut+, phù hợp với kết quả kiểm tra
kiểu hình. Các dòng này tiếp tục được phân tích
nhằm xác định số lượng pPICZα/pdgf được sát
nhập vào bộ gen bằng phương pháp PCR bán
định lượng.
Để xác nhận kết quả kiểm tra kiểu hình
(hình 2), DNA bộ gen của các thể biến nạp
Xác định số lượng bản sao của gen pdgf trong
bộ gen các thể biến nạp
Hình 3. PCR kiểm tra kiểu gen các thể biến nạp. (a) Vị trí bám của mồi AOX1
và các kết quả PCR dự kiến tương ứng với kiểu hình Mut+ và Muts;
(b) Kết quả PCR kiểm tra kiểu gen các thể nấm men mang gen pdgf
Đối với các thể biến nạp nấm men kiểu hình
Mut+, khi thực hiện phản ứng với mồi AOX1
(hình 3) bên cạnh sản phẩm PCR là gen AOX1 có
kích thước 2,2 kb, phản ứng còn cho sản phẩm
DNA dung hợp chứa gen mục tiêu pdgf dài
khoảng 875 bp có nguồn gốc từ plasmid tái tổ
hợp và được sát nhập vào bộ gen của tế bào nấm
men trong quá trình biến nạp. Số lượng các bản
sao DNA chèn vào bộ gen là hoàn toàn ngẫu
nhiên. Nếu bộ gen thể nấm men biến nạp chứa 1
bản sao DNA dung hợp, lượng sản phẩm DNA
875 bp chứa gen pdgf sẽ tương tương với lượng
sản phẩm khuếch đại từ gen AOX1 nội sinh (2,2
kb). Bộ gen thể biến nạp nấm men chứa càng
80
nhiều bản sao của gen pdgf thì tỷ lệ sản phẩm
khuếch đại càng tăng so với gen AOX1 nội sinh.
Bằng cách tính tỉ lệ sản phẩm khuếch đại, chúng
tôi xác định tương đối số lượng bản sao pdgf
trong thể nấm men biến nạp (hình 4). Kết quả
cho thấy, trong 20 thể nấm men mang gen pdgf
thu được, có 2 chủng mang nhiều bản sao gen
pdgf hơn so với các chủng còn lại (1 chủng mang
16 bản sao và 1 chủng mang 4 bản sao gen pdgf
so với các chủng còn lại chỉ mang 1 bản sao của
gen pdgf). Chúng tôi tiến hành ghi nhận kết quả
và khảo sát khả năng tăng trưởng cũng như khả
năng sinh tổng hợp PDGF của các chủng nấm
men này.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83
Hình 4. PCR bán định lượng xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp
a. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen Mut+; b. Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng; c. Số lượng bản sao
tương đối của các thể biến nạp
thể biến nạp. Kết quả khảo sát tăng trưởng cho
thấy khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp
không khác biệt nhiều so với chủng X33 hoang
dại, giá trị OD600 cao nhất đều đạt khoảng 10-15
sau 48 giờ cảm ứng (hình 5). Điều này chứng tỏ
các thể biến nạp đa bản sao thu nhận được
không bị giảm sức sống do hiện tượng sát nhập
gen gây ra.
Hình 5. Đường cong tăng trưởng của chủng
X33 hoang dại và các thể biến nạp
Đánh giá khả năng tăng trưởng của các thể
biến nạp nấm men đa bản sao pdgf
Việc chứa nhiều bản sao của vector trong bộ
gen có thể sẽ ảnh hưởng tới sức sống của các
Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các
thể biến nạp
Để đánh giá sự ảnh hưởng của số lượng bản sao
gen sát nhập đến khả năng biểu hiện protein
mục tiêu, chúng tôi tiến hành cảm ứng biểu hiện
PDGF từ các thể biến nạp thu nhận được.
Hình 6. Khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp
a. SDS-PAGE điều kiện biến tính; b. PAGEđiều kiện không biến tính; c. %PDGF/tổng protein tiết.
Kết quả kiểm tra protein bằng SDS-PAGE
cho thấy, dịch nuôi cấy của các thể biến nạp
(hình 6) xuất hiện 1 vạch protein có kích thước
trong khoảng 17 kDa trong điều kiện biến tính
tương ứng với kích thước PDGF monomer và
31 kDa trong điều kiện không biến tính tương
ứng với PDGF cấu hình dimer, trong khi nấm
men P. pastoris không chèn gen pdgf không
sản xuất được protein này. Phân tích bằng phần
mềm Quantity One chúng tôi nhận thấy vạch
protein này đậm và nhiều hơn hẳn ở thể biến
nạp đa bản sao (thể 1 và 4) và nhiều nhất ở thể
biến nạp 1, chiếm 44,5% so với tổng lượng
protein tiết của tế bào (hình 6c). Kết quả này
81
Vuong Cat Khanh et al.
cũng phù hợp với dự đoán từ kết quả kiểm tra
số lượng bản sao pPICZαA/pdgf trước đó. Dòng
tái tổ hợp 1 với số lượng bản sao pdgf sát nhập
nhiều nhất (16 bản sao) có khả năng biểu hiện
protein mục tiêu mức độ cao nhất. Thú vị hơn
nữa, khi chúng tôi tiến hành điện di protein thu
được từ nấm men trên gel polyacrylamide
không bổ sung tác nhân biến tính (hình 6b),
chúng tôi nhận thấy protein tiết thu được ở các
chủng nấm men có kích thước khoảng 31 kDa.
Theo các nghiên cứu của Raines (1982) [8] và
Wang (2008) [9] đây có thể là trạng thái dimer
của protein PDGF. Điều này cho thấy khả năng
thu nhận protein PDGF ở trạng thái dimer
(là trạng thái có hoạt tính sinh học) từ các chủng
nẩm men tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp 1 được
tiếp tục sử dụng để phân tích khả năng biểu hiện
protein PDGF theo thời gian. Dịch cảm ứng
được thu nhận sau 24, 48 và 72 giờ, sau đó
điện di SDS-PAGE và lai western với kháng thể
đặc hiệu kháng PDGF (AB20NA, R&D)
(hình 7).
Hình 7. Khả năng biểu hiện PDGF theo thời gian của thể biến nạp 1
a. SDS-PAGE; b. lai Western với kháng thể kháng PDGF; c. % PDGF trên tổng protein tiết.
Kết quả trên bản phim cho thấy, dịch nuôi
cấy của các thể biến nạp 1 sau 24 giờ, 48 giờ và
72 giờ cảm ứng đều xuất hiện một băng sáng
duy nhất tương ứng với vị trí của băng protein
kích thước khoảng 31 kDa trên hình PAGE.
Điều này giúp khẳng định vạch 31 kDa quan sát
trên bản điện di chính là protein PDGF dạng
dimer.
Phân tích các vạch protein mục tiêu bằng
phần mềm Quantity One, chúng tôi nhận thấy
trong 72 giờ nuôi cấy, hiệu quả biểu hiện và tiết
PDGF của thể biến nạp 1 ngày càng tăng. Tại
thời điểm 72 giờ, protein PDGF được tiết ra
chiếm tới 55,6% so với tổng protein tiết của tế
bào.
KẾT LUẬN
Với các kết quả thu được, chúng tôi kết luận
đã thu nhận được 2 dòng nấm men tái tổ hợp đa
bản sao gen pdgf. Các dòng nấm men mang
nhiều gen chèn này có khả năng sinh trưởng
bình thường như chủng chủ nấm men X33 ban
đầu và có khả năng biểu hiện protein PDGF.
Trong đó, dòng Pichia pastoris X33: pdgf mang
16 bản sao gen pdgf có khả năng biểu hiện và
82
tiết PDGF cao, chiếm 55,6% tổng lượng protein
tiết. Các kết quả này là tiền đề cho các nghiên
cứu phát triển sản phẩm protein PDGF tái tổ
hợp tiếp theo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Berlanga-Acosta J., Gavilondo-Cowley J.,
Barco-Herrera D. G., Martín Machado J.,
Guillen-Nieto G., 2011. Epidermal growth
factor (EGF) and platelet-derived growth
factor (PDGF) as tissue healing agents:
clarifying concerns about their possible role
in malignant transformation and tumor
progression. Journal of Carcinogenesis &
Mutagenesis, 1:115. doi:10.4172/21572518.1000115
2. Darby R. A., Cartwright S. P., Dilworth M.
V., Bill R. M., 2012. Which yeast species
shall I choose? Saccharomyces cerevisiae
versus Pichia pastoris (review). Springer,
866: 11-23.
3. Embil J. M., Papp K., Sibbald G.,
Tousignant J., Smiell J. M., Wong B., Lau
C. Y., 2000. Recombinant human platelet-
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83
derived growth factor-BB (becaplermin) for
healing chronic lower extremity diabetic
ulcers: an open-label clinical evaluation of
efficacy. Wound Repair and Regeneration:
Official Publication of the Wound Healing
Society [and] the European Tissue Repair
Society, 8(3): 162-8
4. Grinna L. S., Tschopp J. F., 1989. Size
distribution and general structural features
of N-linked oligosaccharides from the
methylotrophic yeast, Pichia pastoris.
Yeast, 5: 107-115.
5. Hamilton S. R.,
Davidson R. C.,
Sethuraman N., Nett J. H., Jiang Y., Rios S.,
Bobrowicz P., Stadheim T. A., Li H., Choi
B-K., Hopkins D., Wischnewski H., Roser
J., Mitchel T., Strawbridge R. R., Hoopes J.,
Wildt S., Gerngross T. U., 2006.
Humanization of yeast to produce complex
terminally sialylated glycoproteins. Science,
313: 1441-1443.
6. Heldin C. H., Westermark B., 1999.
Mechanism of action and in vivo role of
platelet-derived growth factor. Physiol.
Rev., 79(4): 1283-316.
7. Pichia expression kit, Invitrogen, 2010,
Catalog no. K1710-01.
8. Raines E. W., Ross R., 1982. Plateletderived growth factor. J. Bio. Chem.,
257(9): 5154-5160.
9. Wang Y., Xue, L., Li Y., Zhu Y., Yang B.,
Wang X., 2009. High-level secretory
production of recombinant human plateletderived
growth
factor-BB
by
Saccharomyces cerevisiae under the nonselective conditions. Appl. Biochem.
Microbiol., 45(2): 154-161.
A STUDY ON CONSTRUCTING AND SCREENING OF MULTI-COPY
pdgf RECOMBINANT Pichia pastoris CLONES PRODUCING HIGH YIELD OF
PDGF-BB (Platelet derived growth factor BB)
Vuong Cat Khanh, Ngo Thi Huyen Trang, Nguyen Pham Phuong Thanh,
Dang Thi Phuong Thao, Tran Linh Thuoc
Vietnam National University, Ho Chi Minh city, University of Science
SUMMARY
Platelet-derived growth factor-BB has been approved by US Food and Drug AdministrationFDA for the treatment of neuropathic ulcers. Since the number of diabetic patients has increased
rapidly, it is necessary to study the production of PDGF-BB with low cost for treatment. Among the
expression systems used for human recombinant protein expression, Pichia pastoris is the
remarkable one with many advantages. Multiple integrated copies of target gene may give advance
in driving up expression level of target protein. In this study, we succeeded in constructing and
screening two yeast clones, which carry multi-copy of pdgf target gene. The two multi-copy yeast
clones were subjected indetermination of PDGF expression level and compared to single-copy yeast
clones. Our results showed that multi-copy pdgf yeast clones have higher level expression of target
protein. PDGF produced by the multi-copy pdgf yeast clones accounted for over 50% of total
secretory protein, and was folded in dimer form, which is necessary for performing biofunction in
wound healing.
Keywords: Pichia pastoris, multi-copy clone, platelet-derived growth factor BB, yeast.
Ngày nhận bài: 15-7-2013
83
.PDF 
7 
372 
56 
