Tài liệu Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi citrus ở việt nam

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tồi hoàn thành bản luận văn. Tồi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cồ trong Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chúc cán bộ, Phòng Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi học tập chương trình thạc sĩ. Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của Th.s. Đặng Thị Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này tồi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua. MỤC LỤC Hà Nội, tháng 10 năm 2010 La Việt Hồng LỜT CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC TÙ VIÉT TẮT MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tưọng và phạm vinghiên cửu 2 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀILIỆU 3 1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi 3 1.2. Những bệnh thường gặp ỏ’ cây có múi 5 1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ 5 1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens 5 1.2.3. Bệnh vàng lá Greening 6 2 MỤC LỤC 1.2.4. Bệnh Tristeza 7 1.2.4.1. Triệu chứng và phân bô của bệnh 7 1.2.4.2. Cơ chê lan truyền và trung gian truyềnbệnh 10 1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza 11 1.2.4.4. Chuân đoản và phòng chông bệnh 13 1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử 15 1.3.1. K ỹ thuật RT-PCR 15 1.3.2. K ỹ thuật PCR 15 1.3.3. K ỹ thuật biến nạp plasmide vào E.coỉi 16 1.3.4. K ỹ thuật tách dòng 17 1.3.5. K ỷ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 19 1.3.6. K ỷ thuật xác định trình tự nucleotide 19 1.3.7. X ử lí số liệu 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊN cứu 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1. V ật liệu thực vật 22 2.1.2. H 3 óa chất và thiết bị 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. S ơ đồ thí nghiệm 23 2.2.2. P hương pháp nghiên cứu 23 CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Thiết kế mồi 31 3.2. Tách RNA tổng số 32 3.3. Nhân dòng các đoạn gen 33 3.4. 34 Tách dòng gen và xác định trình tự gen 3.4.1. Tạo plasmide tái tô hợp 34 3.4.2. Biến nạp vector tái tố hợp vào tế bào khả biến E.colỉ DH5a 35 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tô hợp băng phương pháp colony-PCR 36 3.4.4. Tách plasmide và cắt kiếm tra gen bang enzyme giới hạn 37 3.4.5. Xác định trình tự các đoạn A, F, p của CTV ở các mẫu CT, HG, 38 HN và VL KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 1. ết luận K 45 2. Đ ề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 4 PHỤ LỤC 52 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g) Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, lỏng Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tông hợp cDNA Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV Bảng 3.2. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Agiữa CT,HG, HN và VL Bảng 3.3. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Fgiừa CT, HG, HN và VL Bảng 3.4. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn pgiữa CT, HG, HN và VL Hình 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện tử âm bản nucleocapsid Hình 3.1. Ket quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1% 5 DANH MỤC HÌNH Hình 3.2. Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker lkb Hình 3.3. Ket quả điện di kiếm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi trường LB đặc Hình 3.6. Ket quả điện di sản phâm colony-PCR với cặp mồi pƯClB trên gel agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb Hình 3.7. Ket quả điện di kiếm tra sản phâm cắt plasmide pBT tái tô hợp bằng enzyme giới hạn đối với mẫu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb Hình 3.8. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG. HN và Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank Hình 3.10. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank 6 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen p của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank |jg microgram pl microlitre [Jĩn micrometer bp base pair BYV Beet yellows virus cDNA Complementary DNA cs Cộng sự CP/NCP Protein VO (Coat protein/Nucleocapsid Protein) CCM Cây có múi CTV Citrus tristezci virus CT DDBJ Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh cần Thơ) Ngân hàng dữ liệugen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học có địa chỉ truy cập: www.ddbi.nig.ac.ip DEPC Diethyl pyro Carbonate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) EMBL Phòng Sinh học phân tử Châu Âu thuộc Viện Thông tin Sinh học Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk HSP70 Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt HG Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang) HN Hà Nội (Mầu thu tại Hà Nội) IPTG Isopropylthio-Ị3-D-galactoside Kb Kilobase LB Luria và Bertani M NCBI Marker (thang đo kích thước DNA) Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia của Hoa Kỳ có địa chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer ORF PNAS Open reading frames - khung đọc mở Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuồi polymerase) PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điêm cắt PMF Polymethoxylated flavones RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction mă ngược) TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquatic us v/p vòng/phút VL VTnh Long (mẫu thu tại tỉnh VTnh Long) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-P"D-galactosidase 8 (phản ứng PCR phiên MỞ DANH MỤC TÙĐẦU VIÉT TẤT 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh... cùng họ Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại 9 cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm ngon, được nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu... Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: cần Thơ, Ben Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [481. Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza... làm cho sản lượng cũng như chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có tác nhân là virus Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có múi [10], [40], [25]. Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây ảnh hưởng tới năng suất và phấm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh Greening. Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa dạng về hệ gen của virus này. Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam” 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới đế có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi. - Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ genome của virus Citrus Tristeza ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng virus được chính xác. Bcn cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long. - Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long. - Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây dựng cây phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu. CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông Nam Châu Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải Nam. Những loài này bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt, cam chua... [6]. Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu nhiệt đới và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc, những vùng thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay Bắc của xích đạo. Ớ Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng Đồng bằng sông Cửu Long, CCM hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi năm roi, bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật, 11 cam dây, cam sành... [6]. Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu hoạch, một số loài có thể cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng. Ở nước ta, 1 ha cam quýt ở thời kỳ 8 tuối năng suất trung bình có thế đạt 16 tấn. So về giá trị kinh tế 1 ha trồng cam cho thu nhập gấp 4 - 10 lần 1 ha trồng lúa Trên thế giới sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7% [48]. Theo tác giả Trần Thượng Tuấn và cộng sự (1994) [6], quả cam quýt được sử dụng rộng rãi vì chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là vitamin c (Bảng 1.1; 1.2). Vị chua nhẹ và hơi đắng giúp dễ tiêu hoá, tuần hoàn của máu, vở giàu pectin được sử dụng làm mứt, kẹo, thuốc nam hay trích lấy tinh dầu, trái được chế biến thành nhiều sản phấm như: nước giải khát, sirô, rượu bổ... Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi Loại Nước Tro Protein Hydrat Chất Năng quả (%) (%) (%) cacbon (%) xơ (%) lượng (%) Muối khoáng (mg/100g) Ca p Fe Cam 87,5 0,5 0,5 8,4 1,4 43 34 23 0,4 Chan h Quýt 87,5 0,5 0,3 3,6 1,3 18 40 22 0,6 88,5 0,6 0,4 8,6 0,8 35 35 17 0,4 Bưởi 83,5 0,4 0,5 15,3 0,7 30 30 19 0,7 12 Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g) Loại quả Vitamin A Vitamin BI Vitamin B2 Vitamin pp Vitamin c Cam 0,30 0,08 0,03 0,20 48 Chanh 0,30 0,04 0,01 0,01 50 Quýt 0,60 0,08 0,03 0,02 55 Bưỏi 0,02 0,05 0,01 0,10 42 Tinh dầu được cất từ vở quả, lá và hoa được dùng trong công nghiệp thực phấm và công nghiệp mỹ phấm. Trên thị trường quốc tế tinh dầu có giá trị rất cao (1 kg tinh dầu có giá trị trên dưới 300 USD) [1]. Ngoài ra, những loại quả thuộc nhóm Citrus còn được dùng làm thuốc chữa bệnh. Các thầy thuốc Ấn Độ, Trung Quốc đã dùng vở quả cam để phòng bệnh dịch hạch, chữa bệnh phối và bệnh chảy máu dưới da. Ớ Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ 20 các thầy thuốc đã dùng vỏ cam quýt kết hợp với insulin đế trị bệnh tiểu đường. Ở Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị bệnh y học trong nhân gian, ơ nước ta, nhân dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại cây ăn quả có múi đế phòng và chữa bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là “trần bì”, được sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cố truyền [1]. Nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam quít có tên khoa học là polymethoxylated flavones (PMF) - là những yếu tố chống oxy hóa tích cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại cholesterol độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50]. Một thử nghiệm của các nhà khoa học Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho thấy tác dụng rất tốt của dịch chiết từ vở quả cam, chanh, quýt có tác dụng chữa hen suyễn do dịch chiết này có chứa limonene [50]. 13 1.2. Những bệnh thường gặp ở cây có múi 1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ Bệnh vàng lá thối rễ là một trong những bệnh quan trọng trên CCM, nhất là trên cam sành và quýt tiều. Bệnh thường gây hại nặng trong mùa mưa lũ, gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đó rụng đi nhất là sau các cơn gió lớn. Lúc đầu chỉ có một vài cành bị bệnh và biểu hiện sự rụng lá, sau đó toàn lá cây bị rụng. Khi đào rễ lên ở phía lá vàng và rụng thấy rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần lên phần rễ chính. Bệnh cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên mức độ bệnh ở bưởi ít hơn so với cam sành và quýt tiều. Bệnh chủ yếu do nấm Fusarium solani tấn công làm hư bộ rễ, tuy nhiên bên cạnh đó còn nhiều tác nhân khác như Phytophthora, Pythỉum, Slerotỉum, Thỉelavỉopsỉs... Trong một số trường hợp do tuyến trùng gây hại và tạo vết thương cho nấm bệnh tấn công. Các loài tuyến trùng như: Pratyỉenchus, Radophơlus, Tylenchulus. 1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens thường vườn trồng bưởi năm roi và quýt tiều. Triệu chứng biếu hiện xảy ra trong qua hiện tượng lá đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô. Bệnh nặng trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất. 1.2.3. Bệnh vàng lá Greening Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là Châu Phi và Châu Á. Ờ Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam Phi gọi là Greening. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8]. Thái lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12], nhiều nước khác cũng cho thấy thiệt hại của Greening. Ở Việt Nam, bệnh này cũng gây thiệt hại nặng từ Bắc chí Nam. Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này: dòng Châu Phi phát triển mạnh 14 trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°c, dòng Châu Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và nóng (lên đến 35°C) [38]. Vi khuẩn Liberibacters gây bệnh Greening có thế nhiễm trên tất cả CCM, cam mật, quýt và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất. Bưởi chùm, chanh Rangpus, chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn. Chanh giấy, cam ba lá và các dòng lai có xu hướng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, không có giống nào kháng lại bệnh này cả. Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích thước lá bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng. Những lá mới sau đó nhỏ hơn kích thước bình thường và mọc thắng đứng, lá bị vàng như triệu chứng thiếu kẽm và sắt. Ket quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao, nhưng hàm lượng canxi, magie và kẽm thấp [17], [24]. Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến dạng và có vị đắng hơn, có thế do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường giảm thấp. Quả thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được màu xanh [28], có thế vì lý do này nên người ta gọi theo triệu chứng bệnh là Greening. Quả phát triển lệch tâm, hạt trên quả bị hỏng và phát triển không bình thường. Theo báo cáo của Garnier và cộng sự (1984) [18], bệnh Greening do vi khuẩn Gram âm hiện diện trong mô libe gây ra, vi khuẩn này chưa nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm. Đặc tính của dòng vi khuẩn được xác định thông qua việc định chuỗi gen 16S ribosome DNA và protein trong ribosome. Ket quả cho thấy vi khuẩn này thuộc chi Alphaproteobacteria (vi khuẩn Gram âm) và có tên khoa học “Candidatus Liberibacter”. Loài gây hại ở Châu Phi là Candidatus Liberibacter africanus. Loài gây hại ở Châu Á (gồm cả Việt Nam) là Candidatus Liberibacter asiaticus. Theo các tác giả van Lelyveld LJ và van Vuuren SP (1988) [39], khi cây bị bệnh greening thì hoạt độ của enzyme peroxidase bị giảm, hoạt động của enzyme này 15 tương quan nghịch với độ nhạy cảm với bệnh greening của loài, do đó có thể sử dụng chỉ tiêu hoạt độ enzyme peroxidase trong lá như một “chỉ thị” đánh giá khả năng chống chịu bệnh và độ nhạy cảm với greening. 1.2.4. Bệnh Tristeza 1.2.4.1. Triệu chứng và phân bổ của bệnh Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus thuộc họ cỉosterovirus. Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống, dòng virus nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]: • Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân trong hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (Citrus aurantifolia). • Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange, Citrus aurantium), chanh giấy (Citrus limon), và bưởi chùm (Citrus paradisỉ). • Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis) trên gốc ghép cam chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh. • Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ khỏi thân. Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn và dễ gãy. • Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính và cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất nhiều. • Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn. Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo ở Nam Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong thập niên 30 thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khấu các CCM nhiễm bệnh và rệp truyền bệnh Toxoptera citricida. Hơn 80 triệu cây ghép trên gốc cam chua (Citrus aurantium) đã bị chết hoặc không sinh sản được bởi CTV. Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10 16 triệu cây), Brazil (hơn 6 triệu cây) và Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14]. Chỉ riêng ở Tây Ban Nha có hơn 40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus reticulata) được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15]. Ngoài ra, CTV có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả. Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu Âu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7]. Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44]. B 17 Hình 1.1. Triệu chứng do vừus Citrus Tristeza gây ra (A) Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do CTV, so với cây bình thường ở giừa. (B) Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam 18 chua (cây ở giữa) bao quanh là các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy giảm chậm. (C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có dạng tổ ong ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của cây bị nhiễm Tristeza. (E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên bàn tay) các cành và thân của một cây bưởi bị rỗ. 1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh Tác nhân truyền bệnh CTV từ cây bị nhiễm bệnh sang cây khoẻ mạnh là rầy mềm Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis spiraecoỉa, Toxơptera aurantii và Myzus persicae (Hình 1.2) [46]. Nhiều tác giả cho rằng rây mềm Myzus persỉcae chỉ truyền virus thuộc dòng nhẹ, nên ta có thể dựa vào đó đế lây truyền dòng nhẹ phục vụ cho phương pháp bảo vệ chéo (Cross- protection). Ngoài ra virus còn được truyền qua việc chiết ghép. Sự xâm nhiễm của virus trong thực vật được cho là liên quan đến hai quá trình: di chuyển từ tế bào này sang tế bào xung quanh (khoảng cách ngắn) và di chuyến giữa các bộ phận của cây (khoảng cách dài). Svetlana Y. F. và cộng sự (2008) [35] đã kiếm tra hệ thống xâm nhiễm của CTV ở các loài CCM khác nhau. Bằng cách sử dụng một dòng CCM “sạch bệnh” CTV và virus gắn protein huỳnh quang màu xanh (green fluorescent protein-labeled virus), kết quả cho thấy có sự di chuyển từ tế bào tới tế bào và di chuyển khoảng cách dài, hai con đường này thường không bị giới hạn, và khả năng di chuyển thay đối tuỳ theo cây chủ. Tập trung phân tích sự xâm nhiễm ở hai loài cây có múi khác nhau, Citrus macrophylla (loài ít nhạy cảm với CTV) và cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các cây chủ nhạy cảm hơn có các điếm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào. 19 Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza 1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza Virus Citrus Tristeza (CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền đến tất cả các nước đang phát triến CCM. CTV thuộc chi Closterovỉrus có kích thước khoảng 2000 X 12 nm [23], [13], [33] (Hình 1.3 B). Genome là sợi RNA đơn dương, không phân đoạn. Vo protein bao gồm hai phân tử protein CP và CPm có kích thước phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và 27 kDa (chiếm 5%) [41]. Protein CP cấu tạo nên phần thân của virus còn protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của virus. Hình thành hạt virion có cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion, cấu trúc virion bất thườn này lần đầu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus) [19]. Những phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức năng khác nhau trong hạt virion virus. Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm 12 khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá (UTR) đầu 5’ và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme protease tương tự papain, các protein liên quan tới sự tái bản (RNA polymerase, helicase, methyltransferase), protein giống với heat shock protein Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và CPm, protein p23 tương tác với RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi. Một so protein chưa rõ chức năng như p61, pl3, p 18 [32], [33], [34], [47]. Hsp70h đóng vai trò kép liên quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của virus từ tế bào này sang tế bào khác [10]. Trình tự bộ genome hoàn chỉnh của một vài dòng CTV đã được công bố [23], 20