Tài liệu Nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hydroperoxitvà thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chúng

y o c u -tr a c k .c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tác giả luận văn Đỗ Thị Liền .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Trần Thị Luyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô giáo và cán bộ phụ trách PTN: Bộ môn Công nghệ Chế biến Thuỷ Sản – Khoa Công nghệ Chế Biến; Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi về hoá chất, dụng cụ và máy móc thiết bị trong suốt quá trình làm đề tài. Do những hạn chế về kiến thức của bản thân và điều kiện khách quan nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những nhận xét và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và bạn bè để luận văn này hoàn thiện hơn. Nha Trang tháng 8 năm 2008 Học viên thực hiện Đỗ Thị Liền .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ....................................................................................4 1.1 Tổng quan về chitosan và ứng dụng...................................................................4 1.2. Cơ chế cắt mạch Chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cắt mạch Chitosan bằng hydroperoxit...................................................................................13 1.3. Đặc tính và cơ chế kháng khuẩn của chitosan ................................................16 1. 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của chitosan..............................18 1.5. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh (E.coli, V.parahaemolyticus, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa) .................22 1.6. Một số nghiên cứu về cắt mạch chitosan.........................................................26 1.7. Một số nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng thấp .......28 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................31 2.1. Vật liệu nghiên cứu.........................................................................................31 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................31 1. Xác định độ nhớt được thực hiện trên thiết bị nhớt kế quay [phụ lục1] .......31 2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................ 32 2.3. Phương pháp xử lý số liệu [ phụ lục 2,3,4]......................................................39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 41 3.1. Xác định các chế độ cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit..............................41 1. Mô hình hồi quy. ........................................................................................41 2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cắt mạch chitosan............................... 43 3. Thử nghiệm sản xuất một số sản phẩm chitosan .........................................46 3. 2. Xác định độ nhớt của chitosan sau khi cắt mạch. ...........................................49 3.3. Xác định giới hạn pH hoà tan của các loại chitosan .......................................50 3.4. Khả năng kháng khuẩn của một số loại chitosan. ............................................51 1. Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (-)................................................51 2. Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (+)................................................79 3. so sánh khả năng kháng vi khuẩn Gram(-) và Gram(+) của chitosan...........87 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ....................................................................89 KẾT LUẬN...........................................................................................................89 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 92 .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải viết tắt DD Độ deacetyl Mw Trọng lượng phân tử v/v Thể tích/ thể tích w/v Khối lượng/ thể tích S.aureus Staphylococus aureus V.parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VSV Vi sinh vật MIC Nồng độ ức chế tối thiểu DP TSA Độ polyme hóa Môi trường Tryptone Soya Agar C1 DD75% (gốc) Sản phẩm chitosan ban đầu có độ nhớt 420 mPa.s C2 DD85% (gốc) Sản phẩm chitosan ban đầu có độ nhớt 391 mPa.s C3 DD95% (gốc) Sản phẩm chitosan ban đầu có độ nhớt 366 mPa.s C4 DD75% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 106 mPa.s C5 DD85% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 103 mPa.s C6 DD95% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 101 mPa.s C7 DD75% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 10 mPa.s C8 DD85% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 10 mPa.s C9 DD95% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 9 mPa.s C10 DD75% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 6 mPa.s C11 DD85% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 6 mPa.s C12 DD95% Sản phẩm chitosan sau khi cắt có độ nhớt 5 mPa.s DANH MỤC CÁC BẢNG .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c Bảng Nội dung Trang 1.1 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến trọng lượng phân tử chitosan 15 DD 91% 1.2 MIC của Chitosan và dẫn xuất đối với một số vi khuẩn 20 3.1 Ma trận quy hoạch thực nghiệm với DD 75% 41 3.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm với DD 85% 41 3.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm với DD 9% 42 3.4 Các chế độ thực nghiệm sản xuất chitosan ngắn mạch từ loại 47 DD75% 3.5 Các chế độ thực nghiệm sản xuất chitosan ngắn mạch từ loại 47 DD85% 3.6 Các chế độ thực nghiệm sản xuất chitosan ngắn mạch từ loại 48 DD95% 3.7 Chế độ sản xuất thử nghiệm một số sản phẩm chitosan phục vụ 48 nghiên cứu trong đề tài 3.8 Độ nhớt của các loại chitosan 49 3.9 Giới hạn pH hòa tan của các loại chitosan 50 .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức cấu tạo của Chitin, Chitosan và Cellulose 5 1.2 Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng H 2O2 14 1.3 Ảnh hưởng của thời gian và độ deacetyl đến khả năng cắt mạch 15 chitosan bằng H2O2 1.4 Ảnh hưởng của pH đến sự ion hóa của chitosan 19 3.1 Ảnh hưởng của độ DD, nồng độ H2O2, nhiệt độ và thời gian đến 43 khả năng cắt mạch chitosan 3.2 Kết quả kháng E.coli của C1, C2, C3 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút 53 (b) và 60 phút (c). 3.3 Kết quả kháng E.coli của C4, C5, C6 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút 53 (b) và 60 phút (c). 3.4 Kết quả kháng E.coli của C7, C8, C9 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút (b) 57 và 60 phút (c). 3.5 Kết quả kháng E.coli của C2, C5, C8, C11 theo nhiệt độ và thời gian xử 60 lý 3.6 Kết quả kháng V. parahaemolyticus của C1, C2, C3 ở thời gian 5 phút 64 (a), 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.7 Kết quả kháng V. parahaemolyticus của C4, C5, ở thời gian 5 phút (a), 66 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.8 Kết quả kháng V. parahaemolyticus của C7, C8, C9 ở thời gian 5 phút 67 (a), 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.9 Kết quả kháng V. parahaemolyticus của C2, C5, C8, C11 ở thời gian 5 70 phút (a), 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.10 Kết quả kháng P.aeruginosa của C1, C2, C3 ở thời gian 5 phút (a), 72 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.11 Kết quả kháng P.aeruginosa của C4, C5 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút (b) và 60 phút (c). 74 .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c y o c u -tr a c k .c 3.12 Kết quả kháng P.aeruginosa của C7, C8, C9 ở thời gian 5 phút (a), 30 75 phút (b) và 60 phút (c). 3.13 Kết quả kháng P.aeruginosa của C2, C5, C8, C11 ở thời gian 5 phút (a), 77 30 phút (b) và 60 phút (c). 3.14 Kết quả kháng S. aureus của C1, C2, C3 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút 80 (b) và 60 phút (c). 3.15 Kết quả kháng S. aureus của C4, C5, C6 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút 82 (b) và 60 phút (c). 3.16 Kết quả kháng S. aureus của C7, C8, C9 ở thời gian 5 phút (a), 30 phút 83 (b) và 60 phút (c). 3.17 Kết quả kháng S. aureus của C2, C5, C8, C11 ở thời gian 5 phút (a), 30 85 phút (b) và 60 phút (c). 3.18 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Gram ( -) và Gram (+) của chitosan 87 .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy sản được coi là ngành mũi nhọn và được xem là nhiệm vụ chiến lược của nước ta, hàng năm ngành đã đem về hàng triệu USD, là nguồn ngoại tệ đáng kể trong ngân sách nhà nước. Theo đến năm đánh giá của FAO thì tính 2000 Việt Nam đứng thứ ba thế giới về nuôi tôm Sú (105.000 tấn) đứng sau Thái Lan (250.000 tấn) và Inđônêxia (trên 110.000 tấn). Hiện nay tôm là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến xuất khẩu thủy sản ở nước ta. Theo Bộ Thủy Sản (2003), tổng sản lượng tôm nuôi, trong đó đại đa số đối tượng nuôi là tôm Sú, đã tăng từ 60.000 tấn (1999) lên 193.000 tấn (2002), giá trị xuất khẩu đạt hơn 1 tỷ USD. Năm 2005 vừa qua ngành thuỷ sản đạt trên 2,7 tỉ USD, trong đó mặt hàng tôm đông lạnh chiếm 1,3 tỉ USD với sản lượng xuất khẩu là 149.871,8 tấn. Cùng với việc tăng nguồn nguyên liệu, lượng phế liệu tôm cũng tăng lên. Hiện nay nguồn phế liệu này chủ yếu được phục vụ cho công nghệ sản xuất chitin thô xuất đi nước ngoài. Phần còn lại phục vụ cho công nghệ sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm. Rất ít nguyên liệu được sử dụng trong công nghệ sản xuất chitosan, oligosaccarite, glucogamine,…Nguyên nhân chủ yếu là việc ứng dụng chitosan ở nước ta hiện nay còn rất ít và chưa có hiệu quả. Hơn nữa, các loại chitosan phân tử lượng thấp phục vụ trong nhiều ứng dụng quan trọng lại chưa có nhiều cơ sở sản xuất được. Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghệ sinh học, y tế, xử lý nước, mỹ phẩm, nông nghiệp, thực phẩm và ngành dệt. Tuy nhiên, chitosan có trọng lượng phân tử lớn do khả năng hoà tan thấp của nó trong nhiều dung môi. Điều này đã giới hạn những ứng dụng của nó đặc biệt trong ngành thực phẩm và y tế. Để cải thiện khả năng hoà tan và đặc tính sinh học, hoá học và vật lý nhiều phương pháp đã được tiến hành để sản xuất ra loại chitosan có trọng lượng phân tử thấp với việc không làm biến đổi cấu trúc hoá học [35], [55], [61], [46]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 1 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kết hợp với lipid, ngăn cản sự phát triển của u biếu, là tác nhân miễn dịch và có nhiều các ứng dụng trong y tế. Chitosan có trọng lượng phân tử thấp (5-20kDa) dường như có tác dụng lên chức năng sinh hoá so với chitosan có trọng lượng phân tử cao hơn. Theo Kondo và cộng sự, 2000 những chitosan có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa ngăn ngừa được sự phát triển của bệnh đái tháo đường và biểu hiện ái lực cao với lipopolysaccharides hơn là chitosan có trọng lượng phân tử 140 kDa. Chitosan có trọng lượng phân tử thấp trong khoảng 5-10kDa có khả năng ức chế mạnh với nhiều loại tác nhân gây ệbnh bao gồm Fusarium oxyporum, Phomopsis fukushi, Alternaria alternata . Ikeda và cộng sự, 1995 đã chứng minh rằng chitosan với trọng lượng phân tử thấp (khoảng 5kDa) ngăn ngừa được sự gia tăng của cholesterol của chuột khi sử dụng thức ăn đã được bổ sung cholesterol. Suzuki và cộng sự, 1986 [54] đã phát hiện rằng chito-hexamer ngăn chặn sự phát triển của khối u Sarcoma180 và Meth-A trong chuột. Chitosan trọng lượng phân tử thấp đang mở ra nhiều hướng phát triển cho o ngành công nghệ chế biến thủy sản cũng như nhiều ngành khác. Nghiên cứu mở rộng khả năng ứng dụng của chitosan góp phần nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu từ giáp xác có ý nghĩa rất lớn. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu cắt mạch Chitosan bằng hydroperoxit và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chúng” do cô GS.TS. Trần Thị Luyến hướng dẫn Mục tiêu của đề tài: - Xây dựng quy trình sản xuất một số loại chitosan có phân tử lượng thấp. Đồng thời cải thiện độ hoà tan của chitosan ở các giá trị pH cao hơn điểm kết tủa của chúng, qua đó nghiên cứu ảnh hưởng của độ dài mạch (tương ứng với một số sản phẩm) đến khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) . Tính mới của đề tài: Hiện nay ở Việt Nam các nghiên cứu về cắt mạch bằng phương pháp hoá học còn rất ít đặc biệt đối với H2O2 thì chưa có tác giả nào công .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 2 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic bố. Thành công của đề tài sẽ góp phần mở rộng ứng dụng của chitosan trong lĩnh vực chế biến thực phẩm. Tính khả thi của đề tài: Hiện nay việc áp dụng chitosan và chitosan ngắn mạch trong công nghệ sinh học, bảo quản thực phẩm và y tế đang được sự quan tâm của các nhà khoa cũng như các nhà doanh nghiệp. Chính vì vậy, khả năng áp dụng của đề tài này là rất cao. Nội dung của đề tài bao gồm: - Nghiên cứu xác định chế độ cắt mạch chitosan bằng hdroperoxit và thử nghiệm sản xuất một số loại chitosan phân tử lượng thấp. - Nghiên cứu khả năng hoà tan, tính kháng khuẩn của một số sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 3 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chitosan và ứng dụng  Cấu trúc và tính chất của chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin. Trong tự nhiên có ở màng tế bào nấm mốc thuộc họ Zygemyceces và ở vài loài côn trùng như thành bụng của mối chúa, ở một vài loại tảo. Ngoài ra nó có nhiều trong vỏ động vật giáp xác như tôm, cua, ghẹ và mai mực. Vì vậy vỏ tôm cua ghẹ là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất chitinchitosan và dẫn xuất của chúng. - Cấu trúc của chitosan: Chitosan có cấu tạo hoá học tương tự như cellulose, chỉ khác một nhóm chức ở vị trí C2 của mỗi đơn vị D-glucose (thay nhóm hydroxyl ở cellulose bằng nhóm amino ở chitosan), nhưng tính chất của chúng lại khác nhau. Sự khác biệt về cấu tạo hóa học của chitin, chitosan và cellulose được chỉ rõ qua công thức cấu tạo của chúng như sau: .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 4 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Chitin, Chitosan và Cellulose Tuy nhiên trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy công thức chính xác của chitosan được thể hiện như sau[8],[48] CH2OH CH2OH O O O OH NH2 Trong đó tỷ lệ O O OH n NHCOCH3 m m phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa. n Tên hoá học của chitosan là: Poly--(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly--(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Qua đây ta thấy chitosan là một polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β- D- Glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4 glucoside Chitosan có công thức phân tử: (C6H11O4N)n Phân tử lượng: Mchitosan =(161,16)n - Một số tính chất của Chitosan: + Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng vảy có màu trắng trong hay màu hơi vàng. Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DD (degree of deacetylation) hơn 70% và trọng lượng phân tử gần 100.0001200.000 Dalton [52]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 5 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic + Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm nhưng hoà tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb3+, Hg+,… + Chitosan phản ứng với hỗn hợp hai acid đậm đặc là chlosylformic và sunfuric theo tỉ lệ 2:1 ở 20-40oC trong 2 giờ tạo muối chitosan- 6- sunfate khó tan. Đặc biệt chất này không tan trong eteretylic + Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan. + Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2)[53]. + Chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao. + Trên mỗi mắc xích của phân tử chitosan có ba nhóm chức, các nhóm chức này có khả năng kết hợp với chất khác tạo ra các dẫn xuất có lợi khác nhau của chitosan (O-acetylchitosan, N-acetylchitosan, N-phatylchitosan). + Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể.  Khái quát ứng dụng của chitosan Do tính chất không tan trong nước mà Chitin ít được sử dụng trực tiếp. Nhưng từ nó trải qua nhiều giai đoạn xử lý hóa chất có thể điều chế dẫn xuất như Glucosamine, Chitosan …Thì nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. : - Trong nông nghiệp: Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt. Ngoài ra Chitosan còn được dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa [26],[32],[49]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 6 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Ngày nay, chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng và làm thức ăn tăng trưởng cho gà, không độc hại. Người ta ít sử dụng Chitin làm phụ gia thực phẩm vì Chitin không hòa tan trong nước, các dung dịch acid loãng hay kiềm. Hơn nữa Chitin có tác dụng kháng khuẩn yếu hơn Chitosan, nó không có tác dụng kháng nấm như Chitosan (Chitosan có cấu trúc giống như các polyamin, đó là các polymer có tính kháng nấm đặc hiệu) - Trong y học: Đây là ứng dụng quan trọng nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan, đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Do khả năng kháng khuẩn và tạo màng nên chitosan được ứng dụng phối hợp với một số thành phần phụ liệu khác để tạo da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép chống nhiễm khuẩn và cầm máu[43]. Chitosan dùng làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV. Ngoài ra, chitosan còn được dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng… dùng làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer có tác dụng chậm kéo dài. - Trong công nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh: Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm. Trong công nghiệp giấy, do cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy. Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn[31]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 7 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Trong công nghiệp dệt, dung dịch chitosan có thể thay hồ tinh bột để hồ vải. Nó có tác dụng làm sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ. Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải cold. Trong hoá mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm chống khô da, làm mềm da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm NH4+. Các nhóm này liên kết với tế bào sừng hoá của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da ngăn ngừa tia cực tím Trong công nghiệp xử lý nước, nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt với các ion kim loại như: Pb2+, Hg+,…do đó chitosan được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm[37],[43] - Trong công nghiệp thực phẩm: Do bản chất là một hợp chất polymer tự nhiên không độc và rất an toàn đối với thực phẩm với những tính chất khá đặc trưng như khả năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, có khả năng hấp phụ màu mà không hấp phụ mùi, hấp phụ một số kim loại nặng,…nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực công nghệ sản xuất và bảo quản thực phẩm. Trong đó, nhiều kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về khả năng kết hợp của chitosan với các loại vật liệu tạo màng khác nhau để tạo ra các màng bao cũng như khả năng kéo dài thời gian bảo quản của nhiều đối tượng rau quả, thịt, nước quả [31][37],43] [52],[53]. Chitosan dùng để lọc trong các loại nước quả ép, bia rượu vang, nước giải khát… . Ở Việt Nam, chitosan đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh cuốn, bánh su sê… với vai trò như một chất phụ gia thực phẩm. Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng nên Chitosan được đưa vào ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm. - Trong công nghệ sinh học: Dùng để cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 8 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c  Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitosan Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hoá ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm. Và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know năm 1991 thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan. Người ta ước tính sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm; trong đó Nhật, Mỹ là nước sản xuất chính. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978-1980, trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng mở đầu bước ngoặt quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất. Hiện nay nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại học Thủy sản Nha Trang, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu polymer - Viện khoa học Việt Nam, Viện hoá thuộc Viện khoa học Việt Nam tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản - Viện nghiên cứu môi trường thuỷ sản 2,…Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme[9], ], [10], [11,[13]14],[15] Đáng kể nhất là các công trình nghiên cứu của Trần Thị Luyến và các cộng sự đã sử dụng enzym papain, chitinase và vi khuẩn Lactic trong công nghệ sản xuất chitosan. Những kết qủa đó đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe hơn về chất lượng của chitin, chitosan trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 9 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Chitosan đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm nghiên cứu để nâng cao và mở rộng khả năng ứng dụng của nó. Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Học viên Quân y - Bộ Quốc phòng và Khoa hoá, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng nghiên tác dụng hạ cholesterol trong máu của N,N,N-Trimethylchitosan (TMC). Theo tác giả tác dụng hạ cholesterol của TMC là do trong phân tử của nó có chứa nhóm –N+(CH3)3, các nhóm này có khả năng kết hợp với Cl- của acid béo có trong muối mật và được đào thải ra khỏi cơ thể[3]. Tác giả Lê Văn Thảo và cộng sự thuộc bệnh viện U Bướu Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu sử dụng chế phẩm chitosan mang thuốc điều trị trên 60 bệnh nhân mắc nhiều loại ung thư. Kết quả tất cả 60 bệnh nhân đều có thể trạng chung tốt, ăn được ngủ ngon, trọng lượng cơ thể không thay đổi trước và sau điều trị. Đặc biệt giá trị bạch cầu có giảm nhưng trong giới hạn cho phép còn hồng cầu và tiểu cầu không có sự thay đổi. Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng đã ghi nhận sự giảm cholesterol trong máu những bệnh nhân nói trên. Hoá trị và xạ trị là hai trong số các phương pháp quan trọng nhất trong điều trị ung thư. Tuy nhiên, nhược điểm của các liệu pháp này là làm giảm lượng hồng cầu, bạch cầu trong cơ thể dẫn tới sự suy sụp thể trạng của bệnh nhân. Các bác sĩ bệnh viện U Bướu Hà Nội vừa cho biết, chế phẩm chitosan có thể giảm thiểu tối đa các tác dụng phụ này. Và đưa ra kiến nghị sử dụng nó để hổ trợ điều trị bệnh ung thư bằng hoá trị và xạ trị. Chitosan cũng được ứng dụng trong việc điều trị viêm loét dạ dày. Năm 1983, Marshall và Warren phát hiện một loại vi khuẩn hiện diện trong niêm mạc dạ dày có tên là Helicobacter pylori có mối liên hệ với bệnh viêm loét dạ dày- tá tràng. Vì vậy mà vấn đề diệt trừ H.pylori là một liệu pháp quan trọng trong điều trị viêm loét. Tuy số lượng thuốc dùng trong điều trị có khá nhiều, đa dạng và có nhiều tiến bộ trong điều trị nhưng việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới, đặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên nhằm khắc phục các tác dụng phụ do thuốc là hoá chất tổng hợp vẫn .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 10 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic được đặt ra. Chitosan là hợp chất được điều chế từ nguồn thiên nhiên, chúng được ghi nhận có tính bảo vệ niêm mạc. Đặc biệt ở nước ta chitosan cũng đã được nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn H.pylori với kết quả khả quan[6]. Các nhà khoa học Nguyễn Thị Ngọc Tú - Viện Hoá học, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia và Lê Thị Hải Yến, Trần Bình Nguyên - Công ty Dược liệu Trung Ương I hợp tác nghiên cứu tạo ra thuốc polymer có tác dụng chậm kéo dài. Các nhà khoa học thuộc Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh nghiên cứu một dẫn chất của chitosan ứng dụng trong kỹ thuật bao phim thuốc[2]. Hiện nay, nước ta cũng đã chế tạo được màng chữa tổn thương về da có tên là Vinachitin do các ngành khoa học thuộc Viện Hoá học - Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia cùng các bác sĩ Trường Đại học Y khoa Hà Nội - Bộ y tế phối hợp nghiên cứu. Màng vinachitin được dùng để chữa các vết thương ở diện rộng và tương đối sâu. Chúng có khả năng hoà hợp sinh học rất cao và thúc đẩy việc gắn liền vết thương, chúng bị phân huỷ sau hai tuần. Nó có tác dụng bảo vệ, chống nhiễm trùng, chống mất nước, tăng khả năng tái tạo da và đặc biệt khi vết thương lành không để lại sẹo[5]. Qua nghiên cứu của Châu Văn Minh và cộng sự thuộc Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã điều chế được chế phẩm BQ-1 với nguyên liệu chính là chitosan có tác dụng bảo quản quả tươi (cà chua, nho vải, chuối,…) rất tốt. Chế phẩm này có tác dụng chống mốc, chống sự phá huỷ của một số nấm men, vi sinh vật Gram (-) trên các loại hoa quả. Từ kết quả nhận được, Châu Văn Minh tiếp tục thử nghiệm khả năng bảo quản thực phẩm tươi sống của BQ-1 (thịt bò, thịt lợn, trứng gà tươi). Nhờ khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối của chế phẩm BQ-1 đã kéo dài được thời gian sử dụng của sản phẩm trong một thời gian nhất định[4]. Ở Việt Nam, chitosan cũng đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh cuốn, bánh su sê… với vai trò như một chất phụ gia thực phẩm. Sở .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 11 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c thương mại Hà Nội, Viện dinh dưỡng, Viện Hoá học và Hội khoa học Kỹ thuật an toàn thực phẩm hợp tác nghiên cứu và sản xuất ra phụ gia chitosan-PDP (có polyphosphate) dạng bột hoàn toàn thay thế hàn the - một chất tạo độ dẻo dai, giòn chắc cho thực phẩm xay nghiền đã bị cấm sử dụng do gây ung thư. Các nhà khoa học Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh thuộc khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông lâm đã nghiên cứu dùng chitosan để bảo quản các thực phẩm tươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như cá, thịt…. Nhờ khả năng hạn chế nước đi qua của lớp màng mỏng chitosan nên đã chống lại được sự mất nước trong quá trình bảo quản lạnh và lạnh đông thực phẩm. Kết quả nhận được sau khi kết đông, rã đông thì sự mất nước hao hụt trọng lượng của cá giảm hơn trường hợp không sử dụng chitosan, đồng thời không làm mất màu, mùi vị của sản phẩm. Nói về khả năng chống mất nước của chitosan, một bài báo ở Cần Thơ đã đưa ra cách giải bài toán bảo quản trái cây nói chung và trái xoài nói riêng bằng cách: Các trái xoài đạt tiêu chuẩn được ngâm trong nước nóng 550C trong 5-10 phút phối hợp với chất benomyl (diệt nấm), chitosan để giúp trái cây không bị mất nước. Mới đây nhất, tại Đại học Thủy sản Nha Trang, các kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn Trọng Bách cho thấy chitosan có thể kết hợp với các phụ liệu tinh bột hồ hóa, sorbitol và PVA (polyvinyl acetate) để tạo màng bao có đặc tính cơ lý khá tốt (mềm dẻo và độ bền đứt cao) có khả năng đáp ứng yêu cầu bao gói thực phẩm. Đồng thời khi sử dụng màng bao chitosan tạo thành để bao gói thịt bò tươi, kết quả cũng cho thấy màng bao chitosan đã làm giảm đáng kể nồng độ vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt bò khi bảo quản ở nhiệt độ 0-50C[1],[15],[16]. Bên cạnh đó, những ứng dụng của các dẫn xuất chitosan cũng được các nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Tác giả Trần Thị Luyến và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng olygoglucosamin, một dẫn xuất của chitosan, thay thế NaNO3 trong bảo quản xúc xích gà surimi. Kết quả cho thấy, với hàm lượng 0,4% olygoglucosamin bổ sung vào thành phần phối trộn sản xuất xúc xích gà surimi, sản phẩm vẫn đáp ứng tốt về chất lượng cảm quan đồng thời đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng[17]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 12 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic 1.2. Cơ chế cắt mạch Chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cắt mạch Chitosan bằng hydroperoxit  Cơ chế cắt mạch[30] Trong qúa trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxit, liên kiết glucoside 1,4 trong chuỗi polysaccharide bị bẻ gẫy làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan. Quá trình cắt mạch chitosan diễn ra theo một loạt các phản ứng hóa học. Chitosan ưu tiên nhận thêm một proton do H2O2 sinh ra để ion hóa nhóm NH2 trong phân tử thành NH3+ theo phản ứng: R–NH2 + H+ = R–NH3+ H2O2 = H+ + HOO− Hoặc H2O2 + R −NH2 + H+=R −NH3+ + HOO− + H+ Nồng độ ion H+ giảm dần làm tăng pH trong suốt quá trình thủy phân. Thêm vào đó anion hydroperoxit rất linh động, dễ dàng phân phủy tạo ra gốc HO*, O* và nhóm OH-, điều đó có nghĩa H2O2 bị phân hủy liên tục. Quá trình diễn ra theo phản ứng sau: HOO− → OH−+O* H2O2 + HOO−→ HO* + O2*- + H2O Gốc hydroxyl có khả năng oxy hóa rất mạnh, nó phản ứng với carbohydrates rất nhanh. Nhóm HO* lấy hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan và nước được hình thành tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân tạo thành glucosamine (GlcN) Phản ứng: (GlcN)m−(GlcN)n + HO*→ (GlcN)m−(GlcN)n + H2O (GlcN)m−(GlcN)n + H2O→ (GlcN)m+(GlcN)n .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 13 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c