Tài liệu Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió (zingiber zerumbert sm.) và chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học

Nghiên cứu các phương pháp phân lập Zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió (zingiber zerumbert sm.) và chuyển hóa Zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học Lê Thị Thùy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa học Luận văn ThS Chuyên ngành : Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn: PGS.TS. Văn Ngọc Hướng Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Khái quát về chi Gừng (Zingiber), cây Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm), công dụng và các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm). Trình bày các phương pháp thực nghiệm: phương pháp phân lập zerumbone từ thân rễ cây gừng gió; điều chế các dẫn xuất của Zerumbone; khảo sát hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất của Zerumbone. Đưa ra kết quả nghiên cứu và thảo luận: điều chế Zerumbone chất lượng cao (> 99%);tTổng hợp một số dẫn xuất của zerumbone và khảo sát hoạt tính chống ung thư của chúng; khảo sát hoạt tính chống ung thư của 3-isopropylaminozerumbone. Keywords: Hóa hữu cơ; Hoạt tính sinh học; Hóa học; Cây gừng Content Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời không chỉ ở nước ta mà còn ở rất nhiều nước Đông Nam Á như Indonexia, Thái Lan, Miến Điện… Gừng gió là cây mọc hoang dại phổ biến ở nước ta từ Bắc tới Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền núi nước ta. Hợp chất có hoạt tính sinh học chính của gừng gió là Zerumbone- nó là chất có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thư mạnh trên 10 loại ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư gan và ung thư vú. Vì vậy, gần 20 năm trở lại đây, Zerumbone nhận được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt là các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ. Ngoài ra những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đã chứng minh rằng dẫn xuất của zerumbone cũng có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thư mạnh. Chính vì vậy mà chúng tôi đặc biệt quan tâm tới việc điều chế zerumbone có chất lượng cao từ cây gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành các chất khác nhau nhằm tạo ra được những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dược. Đấy cũng chính là lí do mà chúng tôi chọn đề tài:“ Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) và chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học.” Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cây thuốc dân tộc, mọc hoang và phổ biến ở nước ta. Như trong tổng quan đã trình bày, trong 20 năm trở lại đây các kết quả nghiên cứu của trong và ngoài nước về hoạt tính chống ung thư của Zerumbone đã khẳng định rằng: Zerumbone là một tác nhân chống ung thư mạnh, nó ức chế sự phát triển của 10 loại ung thư khác nhau. Cơ chế chống ung thư của Zerumbone đã được chứng minh rõ ràng, nó thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis) của tế bào ung thư làm cho ung thư không phát triển được, nó ức chế NF- kB hoạt động nên ngăn ngừa sự tạo thành ung thư và phát triển ung thư. Zerumbone lại không độc, nguyên liệu cho điều chế zerumbone là cây gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)- nước ta lại có nhiều và chất lượng tốt, hơn nữa gần đây người ta phát hiện ra rằng một số dẫn xuất của zerumbone có hoạt tính chống ung thư túi mật mạnh hơn zerumbone nhiều. Chính vì vậy mà điều chế Zerumbone có chất lượng cao để tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone có hoạt tính sinh học là mục tiêu và nội dung của đề tài này. 1. Điều chế zerumbone có chất lượng cao Đề tài của chúng tôi là một phần của đề tài nghiên cứu khoa học quốc gia mã số CNHD- ĐT- 018/10-11 thuộc chương trình KHCN trọng điểm quốc gia phát triển CN hóa dược đến năm 2020. Trong đề tài này người ta đã xác định nguyên liệu cho sản xuất zerumbone là củ gừng gió (rhizomer of Zingiber 2 zerumbet Sm) thu mua tại Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc vào cuối tháng 11 dương lịch, do ThS Nguyễn Quốc Bình thu mua, phân loại, giám định và cung cấp. Điều chế zerumbone có thể đi từ củ gừng gió tươi hay củ gừng gió khô. Khảo sát sinh lý củ gừng gió của chúng tôi cho thấy từ lúc thu hoạch cuối tháng 11 đầu tháng 12 dương lịch, bảo quản đến tháng 3 tháng 4 năm sau thì củ gừng gió mọc mầm và biến chất, hàm lượng Zerumbone rất thấp. Chính vì lí do này nên chúng tôi đã nghiên cứu điều chế zerumbone từ bột củ gừng gió khô, hiệu suất chuyển đổi được từ củ khô là 14,28%, hơn nữa nguyên liệu khô cho phép sản xuất được quanh năm nên thuận tiện cho việc công nghiệp hóa quá trình sản xuất. Để thu được phần không phân cực này chúng tôi chiết tổng các chất trong bột củ gừng gió khô bằng EtOH 96%, loại bớt EtOH còn 1/5 thể tích, rồi pha thêm 4/5 nước muối 10% và chiết bằng n-hexan, sau đó làm khô và loại n-hexan được phần không phân cực hiệu suất đạt 4% tính theo nguyên liệu khô. Từ phần không phân cực tiến hành điều chế zerumbone tinh khiết bằng 3 phương pháp: Sắc ký cột (CC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) và phương pháp kết tinh phân đoạn (FCr). So sánh chất lượng và hiệu suất zerumbone của 3 phương pháp này được số liệu trên bảng 3.1. Bảng 3.1: Hiệu suất zerumbone thu được từ 3 phương pháp phân lập khác nhau Phương pháp CC PTLC FCr Hiệu suất (%) 0,10 0,08 0,35 Điểm chảy 66-67% 66-67% 66-67% Rf 0,75 0,75 0,75 Kết quả trên cho thấy phương pháp tối ưu để điều chế Zer tinh khiết từ thân rễ gừng gió là kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp. Từ các kết quả trên chúng tôi đề xuất quy trình công nghệ sản xuất zerumbone tinh khiết như ở sơ đồ 3.1. Thực hiện quá trình này một cách nghiêm chỉnh chúng tôi thu được zerumbone 99,5% đạt hiệu suất 0,35% tính theo nguyên liệu tươi. Trong khi đó cũng bằng cách chiết phần không phân cực rồi qua 3 phương pháp sắc ký cột Abdul và cộng sự trong bằng phát minh của mình số US2009/0239953 A1 công bố Sep.24,2009 chỉ thu được zerumbone với hiệu suất 0,062% tính theo nguyên liệu tươi. Trong các tài liệu khác chúng tôi cũng chưa tìm thấy quy trình điều chế zerumbone từ củ gừng gió có hiệu suất cao. Sự trình bày trên cho thấy quy trình điều chế zerumbone 99,5% từ củ gừng gió vùng Tam Đảo có nhiều ưu điểm và cho hiệu suất cao, tuy nhiên hiệu suất sản phẩm còn phụ thuộc chất lượng nguyên liệu. Bột củ gừng gió khô 1. Chiết bằng EtOH 96% 2. Loại bớt EtOH còn 1/5V 3. Thêm 4/5V nước muối, chiết bằng n-hexan 4. Làm khô, loại n-hexan Công đoạn I Điều chế dầu Zerumbone Dầu Zerumbone 1. Kết tinh chậm ở nhiệt độ thấp 2. Lọc qua phễu thủy tinh xốp G4 Công đoạn II Điều chế Zerumbone thô Zerumbone thô 1. Kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp và dung môi thích hợp 2. Lọc butne qua giấy lọc Công đoạn III Điều chế Zerumbone tinh khiết Zerumbone tinh khiết 4 Sơ đồ 3.1 : Quy trình công nghệ sản xuất Zerumbon tinh khiết từ bột củ gừng gió khô Độ tinh khiết của sản phẩm được kiểm tra bằng UPLC- MS trên máy sắc phổ chỉ cho 1 pic duy nhất (phụ lục 1 trang 62) Cấu trúc của Zerumbone đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ : + Phổ khối của Zerumbone cho pic M+H =219,19 nghĩa là phân tử lượng Zer-1 là 218 đv (xem phụ lục 2). + Phổ IR cho thấy trong phân tử Zerumbone có liên kết đôi 2 nhóm thế dạng trans có H = 965,18cm-1 và liên kết đôi ba nhóm thế có H = 831,33cm-1 (xem phụ lục 3 trang 63). + Phổ 1H-NMR cho thấy phân tử Zer-1 có 2H của liên kết đôi loại E dạng pic AB, dd ở 5,96ppm và 5,88ppm, J = 16,40Hz. Hai nhóm metyl có H = 6,00; J = 11,12Hz và H = 5,25 và J = 10,63, một nhóm metylen có H = 1,90; J = 12,72. Một nhóm gemdimetyl có H = 1,07 và 1,20ppm dạng singlet và 2 metyl singlet khác có H = 1,79 và 1,54ppm (xem phụ lục 4). + Phổ 13C-NMR cho thấy trong phân tử Zerumbone có 15 nguyên tử cacbon, trong đó có một nhóm >C=O, C = 204,33 ppm. 6 cacbon olefin có độ chuyển dịch hóa học từ 124ppm đến 160ppm và 8 cacbon ở vùng trường mạnh có C từ 11ppm đến 42ppm (phụ lục 5). + Phổ DEPT cho thấy phân tử Zerumbone có 4 nhóm CH3, 3 nhóm CH2, và 4 nhóm CH (phụ lục 6). Dựa trên những dữ liệu phổ, công thức phân tử của Zerumbone được xác định là C15H22O , công thức cấu tạo như trong hình 3.1 và các dữ liệu phổ được thể hiện trong bảng 3.2. 5 Hình 3.1: Công thức cấu tạo của Zerumbone Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của Zerumbone 13 1 C-NMR H-NMR Số C C ppm H ppm Số H Độ bội J.Hz 1 42.38 2.45; 1.90 2H d,d 11.39; 12.72 2 127.14 2.50 1H t 10.60 3 136.26 6.01 4 39.42 2.34 2H t 12.55 5 29.61 2.22 2H q 12.00 6 148.80 6.01 1H t 11.32 7 137.93 8 204.33 9 124.97 5.97 1H d 16.37 10 160.72 5.87 1H d 16.40 11 37.84 12 15.19 1.54 3H s 13 11.76 1.79 3H s 14 24.38 1.07 3H s 15 24.17 1.20 3H s 6 2. Tổng hợp một số dẫn xuất của zerumbone và khảo sát hoạt tính chống ung thư của chúng Zerumbone là một serquyterpen xeton vòng lớn, ,  không no, có công thức chung C15H22O, cấu tạo phân tử ở hình 3.1, tên gọi hóa học là 2,6,9,9tetramethyl- (E,E,E)- 2,6,10- cycloundecatrien-1- on. Hợp chất cacbonyl ,  không no trong tự nhiên là loại hợp chất có hoạt tính sinh học rất lý thú và đã được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm. Zerumbone là một ví dụ điển hình và đã được trình bày trong phần tổng quan, hoạt tính sinh học nổi bật của zerumbone là ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư theo cơ chế apoptosis, loại trừ NF- kB hoạt động. Nhóm chức sinh học của zerumbone là nhóm cacbonyl ,  không no. Vào năm 2010 Uraiwan Songsiang và cộng sự đã chỉ ra rằng dẫn xuất 3amino, 3- amino thế có hoạt tính chống sự phát triển của 5 dòng ung thư túi mật khác nhau ở nồng độ IC50  75 M trong khi đó ở nồng độ này zerumbone không có tác dụng- đây là một kết quả thú vị [42]. Theo hướng này người ta tổng hợp rất nhiều dẫn xuất của zerumbone nhằm nâng cao hiệu quả của zerumbone. Cấu tạo phân tử của Zerumbone cho thấy có nhiều khả năng tổng hợp các dẫn xuất của Zerumbone như: dẫn xuất của nhóm cacbonyl, dẫn xuất của liên kết đôi liên hợp với nhóm C=O, dẫn xuất của liên kết đôi độc lập (C6=C7) và các dẫn xuất của oix hoá mở vòng. Đứng đầu trong chuyển hoá Zerumbone là các nhà khoa học Nhật Bản [25]. Theo hướng chuyển hóa Zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học chúng tôi amin hóa zerumbone bằng amoniac và isopropylamin. 3. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của 3-isopropylamino-Zerumbone Nhằm làm rõ hiệu quả về hoạt tính chống các ung thư: ung thư gan HepG2; ung thư phổi- Lu và ung thư cơ tim RD của dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone so với zerumbone chúng tôi khảo sát hoạt tính chống ung thư của 2 hợp chất này đối với 3 dòng ung thư kể trên.Kết quả được thể hiện trong bảng sau: 7 Bảng 1: Khả năng gây độc tế bào của 3-isopropylamino-Zer và Zer Ký hiệu mẫu IC50 (g/mL) HepG2 Lu RD Zerumbone 0,31 1,00 0,36 3-isopropylamino-Zerumbone 2,23 >5 >5 Kết quả trên cho thấy hoạt tính chống ung thư của dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone yếu hơn nhiều so với Zerumbone đối với 3 dòng ung thư đã thử. Điều này cũng cho thấy nếu hệ thống liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl trong phân tử zerumbone bị giảm thì hoạt tính chống ung thư của zerumbone đối với 3 dòng ung thư HepG2,Lu và RD cũng bị giảm. References TIẾNG VIỆT 1. Báo cáo tổng kết đề tài QGTD0309-2006 tháng 2 2. Báo cáo kỉ niệm 45 năm thành lập Viện Dược liệu TW 9-5-200 3. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc việt nam. Trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, tr 291-292, NXB nông nghiệp, Hà nội 4. Võ văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt nam, tr 536, NXB Y học. 5. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1987), Phân loại thực vật. Thực vật bậc cao, tr 461-464, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà nội 6. Trịnh Đình Chính (1995), Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu một số cây thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt nam, Luận án PTS Khoa học và Hóa học, Trường ĐH Sư phạm Hà nội I. 7. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, quyển 3, tr 553, NXB Trẻ Hà Nội. 8. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, in lần thứ mười ba, tr 368- 369, NXB Y học Hà Nội. 8 9. Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Củ, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt nam, tập 2, tr 94-119, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 10. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học tập 3, Công nghệ sinh học tế bào, trang 343-344, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 11. Văn Ngọc Hướng, Đỗ Thị Thanh Thúy (2006), Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm) vùng Tam Đảo, một nguyên liệu quý cho điều chế Zerumbone, Tạp chí Khoa học và công nghệ, tập 44, số 3, trang 65-69. TIẾNG ANH 12. A. Hoffman, L. M. Spetner and M. Burke (2002), “Redox-regulated mechanism may account for zerumbone’s ability to suppress cancer-cell proliferation”, Carcinogenesis 23 (11): 1961-1962. 13. Abdul, A.B.H., A.S. Al-Zubairi, N.D. Tailan, S.I.A. Wahab, Z.N.M. Zain, S. Ruslay and M.M. Syam (2008), “Anticancer activity of natural compound (zerumbone) extracted from Zingiber zerumbet in human HeLa cervical cancer cells”, International Journal of Pharmacology 4, (3), 160--168 14. Ahmad Bustanmam Abdul (2009), US2009/0239953 15. Bokyung Sung, Sonia Jhurani, Kwang Seok Ahn, Yoichi Mastuo, Tingfang Yi, Sushovan Guha, Mingyao Liu, and Bharat B. Aggarwal (2008), “Zerumbone Down-regulates Chemokine Receptor CXCR4 Expression Leading to Inhibition of CXCL12-Induced Invasion of Breast and Pancreatic Tumor Cells”, Cancer Res, 8938-8944. 16. Buckingham J (1982), “Dictionary of Organic compounds”, New YorkLondon-Toronto, Chapman and Hall, 5, 5763. 17. Dai.J.R., Cadellina II.J.H., Mc Mahon.J.B., and Boyd.M.R (1997), “Zerumbone, an HIV-inhibitory and cytotoxic sesquiterpene of Zingiber aromaticum and Z. zerumbet”, Natl. Prod. Lett, 10, 115-118. 18. Dae Sik Jang, Ah-Reum Han, Gowooni Park, Gil-Ja Jhon, Eun-Kyoung Seo (2004), “Flavonoids and aromatic compounds from the Rhizomes of Zingiber zerumbet”, Arch Pharm Res 27, (4), 386-389. 9 19. Dai J.R. et al (1997), Nat. Prod. Lett 10, 115-118. 20. Dev S. (1960), Tetrahedron 8, 171-180. 21. Dung.N.X., chinh.T.D., Piet A.Leclereq (1995), “Chemical investigation of the acrial part of Zingiber zerumbet (L.) Sm. from Vietnam”, Jour. Essent. Oil Res.(USA), 7 (2), 153-157 22. Huang.G.C., Chien.T.Y., Chen.L.G., Wang.C.C (2005), “Antitumor effects of zerumbone from gingiber zerumbet in P-388D1 cells in vitro and in vivo”, Planta Med, 71 (3), 219-224 23. Kirana C, McIntosh GH, Record IR, Jones GP. (2003), “Antitumor activity of extract of Zingiber aromaticum and its bioactive sesquiterpenoid zerumbone”, Nutr Cancer.45(2):218-25. 24. Matthes.H.W.D., Luu.B., Ourisson.G (1980), “Cytotoxic components of Zingiber zerumbet, curcuma zedoaria and C. domestica”, Phytochemistry, 19, 2643-2650. 25. Masuda.T., Jitoe.A., Kato.S., Nakatani.N (1991), “Acetylated flavonol glycosides from Zingiber zerumbet”, Phytochemistry, 30, 2391-1392. 26. M. Golam KADER, M. Rowshanul HABIB, Farjana NIKKON, Tanzima YEASMIN, Mohammad A. RASHID, M. Mukhlesur RAHMAN, Simon GIBBONS (2010), “Zederone from rhizomes of Zingiber zerumbet and staphylococus activity”, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 9 (1), 63 – 68. 27. Mohamed Yousif Ibrahim , Ahmad Bustamam Hj Abdul, Tengku Azmi Tengku Ibrahim, Siddig Ibrahim AbdelWahab, Manal Mohamed Elhassan and Syam Mohan (2010), “Attenuation of cis platin- induced nephrotoxity in rats using Zerumbone”, African Journal of biotechnology Vol 9, 44344444. 28. Murakami.A, Takahashi.M., Jiwajinda.S., Koshimizu.K., Ohigashi (1999), “Identification of zerumbon in Zingiber zerumbet Smith as Potent inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate induced Epstein-Barr virus activation”, Biosci Biotechnol Biochem, 63 (10), 1811-2. 29. Murakami.A., Takahashi.D., Kinoshita.T., Koshimizu.K., Kim. H.W., Yoshihiro.A., Kakamura.Y., Jiwajindo.S., Terao.J., Ohigashi.H (2002), 10 “Zerumbone, a southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by apoptosis the alpha, beta-unsatureted carbonyl group is a prerequisite”, Carcinogenesis, 35 (5), 795-802 30. Nakamura.Y., Yoshida.C., Murakami.A., Ohigashi.H., Osawa.T., Uchida.K (2004), “Zerumbone, a tropical ginger sesquiterpene, activates phase II drug metabolizing enzymes”, FEBS Letters, 13, 572 (1-3), 245-250 31. N.P. Damodaram and Sukh Dew (1965), “Stereochemistry of Zerumbone”, Tetrahedron Letters, 24, 1977-1981. 32. Ozaki.Y., Kawahara.N., and Harada.M (1991), “Anti-inflammatory effect of Zingiber cassumunar.Roxb. and its active principles”, Chem.Pharm. Bull, 39, 2353-2356. 33. Samir Kumar Sadhu, Amina Khatun, Takashi Ohtsuki, Masami Ishibashi (2007), “First isolation of sesquiterpenes and flavonoids from Zingiber spectabile and identification of Zerumbone as the major cell groth inhibitory component”, Natural product research, 21, (14), 1242-1247. 34. Sal S.R. et al (1981), Aust J..Chem. 34, 243-247. 35. SA Sharifah Sakinah, S Tri Handayani and LP Azimahtol Hawariah (2007), “Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2 ratio”, Cancer Cell International 7, 1186. 36. Takahashi.S et al (2002), Japanese Journal of cancer and chemotherapy, 27, 70. 37. Takashi Kitayama et al (2001), “ Chemistry of Zerumbone, part 2 Regulation of Ring bond Cleavage and unique antibacterial activities of Zerumbone derivatives”, Biosci, Biotechnol. Biochem. 65, 2193-2199. 38. Takashi Kitayama et al (2003), “ The chemistry of Zerumbone part 5 Structural transformation of the dimethylamine derivatives”, Tetrahedron 59, 4857-4866. 39. Takashi Kitayama et al (2002), “ The chemistry of Zerumbone IV. Asymetric Synthesis of Zerumbol”, Journal of Molecular Catalysis 17, 75-79. 11 40. Takashi Kitayama et al (2007), “ Synthesis of a novel inhibitor against MRSA and VRE: preparation from Zerumbone ring opening material showing histidine-kinase inhibition”, Bioorganic and Medicinal chemistry Letter 17, 1098-1101. 41. Takada Y, Murakami A, Aggarwal BB. (2005), “ Zerumbone abolishes NFkappaB and IkappaBalpha kinase activation leading to suppression of antiapoptotic and metastatic gene expression, upregulation of apoptosis, and downregulation of invasion”. 42. Uraiwan Songsiang et al. (2010), “ Cytotoxicities against cholagiocarcinoma cell lines of Zerumbone derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry 45, 3794-3802. 43. Vimala.S., Norhanom.A.W., Yada.M (1999), “ Anti-tumour promoter activity in Malaysian ginger rhizobia used in traditional medicine”, British Journal of cancer, 80, 110-116. 12