Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (gp5) của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (prrsv)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HÀ ĐĂNG CHIẾN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS Lê Văn Sơn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS LÊ VĂN SƠN đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu bp Tên tiếng Anh Base pairs Tên tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Cộng sự CS DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GP5 Glycoprotein 5 IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside kb Kilo base kDa Kilodalton LB Luria Bertami Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MES 2-(N-morpholino)etansulfonic acid OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PRRS Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp và Respiratory Syndrome sinh sản ở lợn Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại Respiratory Syndrome virus hô hấp và sinh sản ở lợn PRRSV RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v TAE Tris-acetate-EDTA TBS Tris-buffered saline TTBS Tween tris-buffered saline v/p X-gal Vòng/ phút 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galacto-pyranoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ iv MỤC LỤC ...................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... ix MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài.......................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu: .................................................................................. 2 3.Nội dung nghiên cứu:.................................................................................... 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 1.1. Tổng quan về PRRS .................................................................................. 4 1.1.1. Khái niệm PRRS ..................................................................................... 4 1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn .......................................... 4 1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ................ 10 1.2. Protein tái tổ hợp ..................................................................................... 15 1.2.1. Giới thiệu ............................................................................................... 15 1.2.2. Glycoprotein (GP5) ............................................................................... 15 1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5........................................... 16 1.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp ........................... 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii 1.2.5. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ...................... 17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 20 2.1. Vật liệu .................................................................................................... 20 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 20 2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng......................................................................... 22 2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm............................................................... 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 24 2.2.1. Tạo dòng gen GP5 ................................................................................. 24 2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen GP5 .................................................... 25 2.2.3. Phƣơng pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ................................ 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 34 3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 34 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 ...................... 37 3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 44 1. Kết luận ...................................................................................................... 44 2. Kiến nghị .................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 13 Hình 1.2. Cấu tạo phân tử virion ................................................................... 15 Hình 2.1. Vector tách dòng pBT ................................................................... 20 Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 21 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pBT-GP5 ............................... 35 Hình 3.2. Kết qủa điện di sản phẩm colony- PCR khuẩn lạc mang gen GP5 35 Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 36 Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) với enzyme cắt giới hạn ....... 38 Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn39 Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE .......................................................... 40 Hình 3.7. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag .......... 41 Hình 3.8. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ....................... 42 Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA ...... 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm ................................................................... 23 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 24 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 25 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 26 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 26 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 27 Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên lợn từng đƣợc ghi nhận trên thế giới và đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc Mỹ năm 1987 [23], do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh, với lợn nái, PRRS gây hậu quả nghiêm trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con [3]. “Lợn tai xanh” là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh [1]. Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nƣớc trên thế giới, gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Hoa Kỳ vào năm 1987 [31], ở châu Âu (tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991) và tại châu Á vào đầu những năm 1990. Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [8]. Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi. Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dƣơng, cấu trúc tƣơng tự các khung đọc mở (open reading frame, ORF) của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau, mã hóa cho 7 protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2 GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá bởi ORF5, là một protein đƣợc glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus. Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine phòng bệnh đang lƣu hành. Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp thế hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra. Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”. 2. Mục đích nghiên cứu: - Thiết kế đƣợc vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5. - Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3 3.Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu tạo dòng vector mang GP5. Dựa trên thông tin về trình tự nucleotide của gen GP5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để phân lập kiểm tra và nhân gen bằng PCR. - Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5. - Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 ) bằng sắc ký ái lực Ni-NTA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về PRRS 1.1.1. Khái niệm PRRS Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndome, viết tắt PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu hiện đặc trƣng là các rối loạn sinh sản ở lợn nái nhƣ sảy thai, thai chết lƣu, lợn sinh ra chết yểu [20], cũng nhƣ lợn con theo mẹ và lợn nái hậu bị còn thể hiện viêm đƣờng hô hấp rất nặng nhƣ: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao… Bệnh còn đƣợc gọi bằng một số tên khác nhƣ: “Mystery Disease Syndome” (Bệnh bí hiểm ở lợn). “Swine Infertility and Respiratory Syndromde. Viết tắt là SIS (Hội chứng vô sinh và hô hấp ở lợn). “Porcine Endemic and Respiratory Syndrome, viết tắt là PEARS” (Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn). “Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome” (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn). “Blue-ear disease” (Bệnh lợn tai xanh). Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đƣợc tổ chức tại St. Paul, Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và đƣợc tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh đƣợc gây ra bởi virus PRRS, tồn tại dƣới dạng hạt virion gây nhiễm. 1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn * Cơ chế gây bệnh và các phƣơng pháp lan truyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5 Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đƣờng hô hấp, tiêu hóa và đƣờng âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus là các đại thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong loại tế bào này và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thực bào nhƣng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết chúng, các virion đƣợc giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm do mắc PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đƣờng hô hấp nhƣ Mycoplasma hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A. pleuropneumoniae... Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A. pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens. Kết quả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6 phân lập đƣợc vi khuẩn A. pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P. multocida 10%. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn. * Triệu chứng Lợn mắc PRRS thƣờng có các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn đỏ da, khó thở, táo bón hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh. Đặc biệt, một số con lợn mắc bệnh ở chóp tai bị ứ huyết có màu xanh tím và một số triệu chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát và từng loại lợn. Ở lợn nái: Các triệu chứng chủ yếu là tím âm hộ, sảy thai, thai chết lƣu, thai gỗ hàng loạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao. Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độ tuổi của thai nhƣ thai dƣới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết là 93,75% [11]. Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thƣờng ít uống nƣớc, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sƣng, có thể táo bón hoặc ỉa chảy, viêm phổi. Ở lợn đực giống: Sốt cao, bỏ ăn, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tƣợng tai xanh. Đặc biệt xuất hiện hiện tƣợng viêm dịch hoàn, bìu dái nóng đỏ (chiếm 95%), dịch hoàn sƣng đau, lệch vị trí (85%), giảm hƣng phấn. Lƣợng tinh ít, chất lƣợng kém biểu hiện qua các chỉ số nhƣ nồng độ tinh trùng C< 80.106, hoạt lực của tinh trùng A< 0,6, sức kháng của tinh trùng R< 3000, tỷ lệ kỳ hình K >10%, tỷ lệ sống của tinh trùng < 70%, độ nhiễm khuẩn cao 20.103. Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục đƣợc khả năng sinh sản của mình [11]. Ở lợn choai, lợn thịt: Lợn mắc bệnh sốt cao 400C đến 420C, bỏ ăn, ủ rũ, khó thở, ho; những phần da mỏng gần tai, phần da bụng lúc đầu có màu hồng nhạt, dần dần chuyển sang màu hồng thẫm và xanh nhạt. Lợn con mới sinh hầu nhƣ sẽ chết sau vài giờ; số còn sống sót tiếp tục chết vào tuần thứ nhất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7 Lợn con có triệu chứng gầy yếu, bỏ bú, da xuất huyết phồng rộp, khó thở và tiêu chảy [2]. * Bệnh lý Lợn mắc PRRS bệnh tích thƣờng thấy nhƣ thận xuất huyết lấm tấm nhƣ đầu đinh ghim; não xung huyết; hạch hầu, amidan sƣng hoặc sung huyết; gan sƣng, tụ huyết; lách sƣng, nhồi huyết; hạch màng treo ruột xuất huyết; loét van hồi manh tràng; phổi tụ huyết, xuất huyết, cuống phổi chứa đầy dịch nhớt, sầu bọt [2]. Theo Nguyễn Tiến Dũng (2011) [6], bệnh tính đặc trƣng nhất là viêm phổi kẽ và viêm hạch lâm ba ở cả 2 dạng (PRRS dạng cổ điển và PRRS dạng sốt cao). Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trƣng bởi những đám đặc chắc (nhục hóa) trên các thùy phổi. Thùy phổi bị viêm có màu đỏ xám, có mủ và đặc chắc. Trên mặt cắt ngang của thùy bị viêm lồi ra, khô. Nhiều trƣờng hợp lợn mắc bệnh bị viêm phế quản phổi hóa mủ ở mặt dƣới thùy đỉnh. Các triệu chứng thƣờng gặp của lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết (đối với lợn con) và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với lợn ở mọi lứa tuổi. * Các biện pháp phòng bệnh Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung ƣơng tới các địa phƣơng. Thực hiện nghiêm việc tiêm vaccine phòng các bệnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8 nguy hiểm ở lợn theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN ngày 13/10/2005 của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn [16]. * Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam [14] + Trên thế giới Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (từ châu Đại Dƣơng) trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành. Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [22]. Ví dụ: hàng năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD. Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao, ví dụ: Ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%. Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virusPRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus(thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung Quốc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9 đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vác xin đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [26]. Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh Tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, còn các virusthuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virusgây bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng viruscổ điển độc lực thấp. Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh Tai xanh do chủng virusPRRS thể độc lực cao gây ra. + Tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [7]. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm 2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung ở Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm 1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn chết và xử lý 7.296 con. 1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99% đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [5]. Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung Quốc (Lê Thanh Hòa và cs, 2009 [9]; Nguyễn Văn Cảm và cs, 2011 [4]; Cao Văn Thật và cs, 2012 [15]; Lý Thị Liên Khai và Võ Thị Cẩm Giàng, 2012 [10]).  Đặc tính sinh học của virus Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với các loại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11 hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thƣơng đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp. Nhóm virus có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [26].  Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus + Sức đề kháng của virus. Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70 o C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [13]. + Khả năng gây bệnh của virus Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhƣng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn