Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Asparaginase của Aspergillus Oryzae trong nấm men Pichia Pastoris

  • Số trang: 72 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 60 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Huyền TS. Đinh Nho Thái Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Huyền trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, GS. TS Trương Nam Hải nguyên trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, ThS. Nguyễn Thị Hương Trà, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và TS. Đinh Nho Thái, Bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền, tôi đã được tập thể cán bộ nghiên cứu của phòng, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thanh Ngọc, CN. Lê Tùng Lâm đã chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình. Tôi xin chân thành cảm ơn về sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn đối với các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết. Lời cuối cùng, tôi xin được chân thành cảm ơn cha mẹ, những người thân trong gia đình tôi và đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM ........................................................3 1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide ........................................................... 3 1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng ................................... 4 1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm ....................................... 5 1.2. ASPARAGINASE ............................................................................................5 1.2.1. Asparaginase .............................................................................................. 5 1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm ........... 6 1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase .............................................................. 8 1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp ..............................8 1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn (chủng GRAS) tái tổ hợp ...............................................................................10 1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS ..........................12 1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men ....................... 12 1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men ............................................. 13 1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris........................................................................... 14 1.3.3.1. Promoter AOX1 ................................................................................14 1.3.3.2. Chủng biểu hiện ................................................................................15 1.3.3.3. Vector biểu hiện gen .........................................................................17 1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris ..................................18 1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris ......................................... 19 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 21 2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................21 2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid................................................................... 21 2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị ................................................... 21 2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng ........................................................... 22 2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli DH10b ..........................................................................................22 2.1.3.2. Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli ........................................................................................................................22 2.1.3.3. Dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose .........23 2.1.3.4. Môi trƣờng biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm men P. pastoris ......................................................................................................23 2.1.3.5. Dung dịch sử dụng trong điện đi SDS-PAGE ..................................23 2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong nhuộm bạc ................................................24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................24 2.2.1. Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinh 24 2.2.2. Phƣơng pháp PCR.................................................................................... 25 2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose ................................................................. 26 2.2.4. Quy trình biến nạp sốc nhiệt .................................................................... 27 2.2.5. Quy trình tách DNA plasmid ................................................................... 28 2.2.6. Kiểm tra DNA thu đƣợc bằng enzyme hạn chế ....................................... 29 2.2.7. Tinh sạch DNA plasmid để gửi đi giải trình tự bằng cột Qiagen ............ 29 2.2.8. Phản ứng nối ghép gen ............................................................................ 30 2.2.9. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện ........ 30 2.2.10. Lên men chủng P. Pastoris .................................................................... 31 2.2.11. Điện di SDS – PAGE ............................................................................. 31 2.2.12. Thử hoạt tính asparaginase bằng phƣơng pháp điện di không biến tính và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch ....................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 34 3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A. ORYZAE 3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợp ........ 36 3.1.2. Cải biến sơ bộ gen asparaginse ................................................................ 37 3.1.3. Đánh giá các chỉ số phù hợp mã bộ ba của gen asp1 đối với chủng biểu hiện . 41 3.1.4. Thiết kế vùng gen để biểu hiện asp1 trong P. pastoris ........................... 42 3.2. NHÂN DÒNG GEN ASP1 .............................................................................43 3.2.1. Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng các enzyme hạn chế ............ 44 3.2.2 Giải trình tự gen asp1 ............................................................................... 45 3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 .............................................45 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9 ....................................... 45 3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCR ......... 47 3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1 .................... 48 3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1 ..............................49 3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC ..................................................................................52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 57 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm ..........5 Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase ..................................7 Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris. ........18 Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 .............19 Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1 trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168 ............................................................ 35 Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong asparaginase của A. oryzae. ......................................................................................36 Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm men P. pastoris..........................................................................................................37 Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B). .....................................................38 Hình 9. Đồ thị so sánh tần suất sử dụng của các codon trong hai chủng A. oryzae (đỏ) và P. pastoris (đen)............................................................................................ 39 Hình 10. So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp và asp1 ....................... 40 Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải biến ............................................................................................................................41 Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B) ............................... 41 Hình 13. Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI, NotI (đƣợc tô đậm). .........................................................................................42 Hình 14. Phân tích các dòng plasmid pUC-asp1 trên gel điện di agarose 1%................44 Hình 15. Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 bằng cặp enzyme XhoI và NotI trên gel agarose 1%. ..................................................................................................45 Hình 16. Sơ đồ vector pPIC9 (trái) và ảnh điện (phải) kết quả cắt pPIC9 bằng NotI (đƣờng chạy 1) và XhoI ( đƣờng chạy 2) .................................................................. 46 Hinh 17. Phân tích gen asp1, pPIC9 sau khi đã đƣợc cắt bằng cặp enzyme NcoI+XhoI và đƣợc tinh chế trên gel agarose 1%.....................................................47 Hình 18. Ảnh điện di kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong vector pPIC9 bằng cặp mồi AOX1 ......................................................................................48 Hình 19. Phân tích plasmid pPIC-asp1 và sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 bằng NotI và XhoI trên gel điện di agarose 1%. ................................................................49 Hình 20. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 bằng StuI ............................ 50 Hình 21. Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P. pastoris. ........................50 Hình 22. Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P. pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1. .......................................... 51 Hình 23. Đƣờng cong sinh trƣởng của 4 chủng P. pastoris tái tổ hợp theo thời gian ...................................................................................................................................53 Hình 24. Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp ở các thời điểm khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6%.. .......................................54 Hình 25. A: Gel không biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP trên gel bằng thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1% asparagine. .................................................................................................................55 Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp. ............................................................................................................................16 Bảng 2. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát thông qua OD600 theo thời gian lên men ..................................................................52 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic AOX Alcohol oxidase APS Ammonium persulfate ARN Axit ribonucleic ASP Asparaginase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast BMMY Buffered Minimal Methanol Yeast bp Base pair dNTP 2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ETBr Ethidium bromide E. coli Escherichia coli GRAS Generally Recognized as Safe kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site ( vị trí đa nối) MD Minimal Dextrose mARN Messenger RNA (ARN thông tin) P. pastoris Pichia pastoris PCR Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium dodecyl sunfat TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA MỞ ĐẦU Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố dẫn đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời này. Tuy vậy, rất ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ các loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ. Năm 2002 các nhà khoa học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10]. Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở nhiệt độ trên 120oC. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29]. Các nhà khoa học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine. Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8]. Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24]. Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11]. Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam còn rất hạn chế. Với mong muốn tạo ra chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở trong nƣớc, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris”. Nấm men P. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà khoa học sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học, 1 là chủng eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49]. Ngoài ra, hệ thống P. pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm. Chính vì những ƣu điểm này mà P. pastoris đƣợc xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A. oryzae. Hiện nay, có rất nhiều công trình trên thế giới biểu hiện asparaginase từ các nguồn khác nhau để phục vụ chủ yếu cho mục đích chữa bệnh và làm chất phụ gia. Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu hiện trong E. coli và Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55]. Ngoài ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. pastoris [53]. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P. pastoris để biểu hiện asparaginase của A. oryzae. Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo ngƣời tiêu dùng về nguy cơ ung thƣ do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tƣởng nhƣ vô hại khác nhƣ cà phê, bánh mì, bánh quy... cũng có thể dẫn đến ung thƣ. Nguyên nhân chính là do các thực phẩm trên có acrylamide. Ngay sau khi ăn, acrylamide trong thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Nó đƣợc phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí là cả trong sữa mẹ. Acrylamide chuyển hoá thành glycidamide ở trong gan thông qua cytochrome P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có thể tƣơng tác với các đại phân tử nhƣ DNA, hemoglobin và các enzyme gây đột biến DNA hoặc làm ảnh hƣởng tới chức năng sinh học của hệ enzyme trong cơ thể [16]. Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và ảnh hƣởng đến hệ thần kinh [38]. Thông thƣờng chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hƣởng đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5 mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thƣờng khó đạt đƣợc thông qua ăn uống. Ngƣợc lại, khả năng gây ung thƣ và đột biến gen của acrylamide và glycidamide đã đƣợc công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ trên động vật. Nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào cho thấy acrylamide và glycidamide có thể làm gãy nhiễm sắc thể và gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thƣờng trên nhiễm sắc thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh. Những nghiên cứu trên tế bào chuột và ngƣời đƣợc xử lý bằng acrylamide cho thấy, acrylamide làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase nhƣ adenine bằng guanine và guanine bằng cytosine. Đối với thí nghiệm trên chuột, acrylamide thúc đẩy quá trình hình thành khối u trên não, phổi, tinh hoàn và tuyến vú. Khi chuột đƣợc xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1 kg trọng lƣợng cơ thể sẽ làm tăng 3 đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác. Mặc dù vậy, acrylamide đƣợc sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên động vật có thể không phản ánh trung thực những ảnh hƣởng, tác động của acrylamide hấp thu đƣợc trong thức ăn. Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học đã đƣợc thực hiện để đánh giá nguy cơ gây ung thƣ của acrylamide cho con ngƣời. Mucci và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng acrylamide hầu nhƣ không liên quan tới ung thƣ bóng đái, ruột, thận, thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng [32]. Tuy nhiên , Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Tổ chức Nông lƣơng liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu Âu và Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ thế giới (IARC) đều coi acrylamide là chất có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời, thuộc nhóm 2A [24]. Vì vậy, nồng độ của acrylamide trong thực phẩm phải đƣợc kiểm soát ở mức độ cho phép. Vì lý do đó, con đƣờng hình thành acrylamide cần phải đƣợc xác định để kiểm soát lƣợng acrylamide hấp thu vào cơ thể. Tổ chức Bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA) và WHO đã đƣa ra hàm lƣợng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5 ppb hoặc 0,05 µg/lít. Hiện nay, số liệu về lƣợng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều gây chết còn hạn chế [9]. 1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng Bột mỳ là nguyên liệu chính giàu carbohydrate đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất các loại bánh nƣớng nhƣ bánh mỳ, bánh bích quy... Bột mỳ đƣợc trộn với nguyên phụ liệu, nhào bột, ép nặn tạo hình, ủ, nƣớng, làm nguội, phân loại và bao gói. Quá trình nƣớng trải qua ba giai đoạn với nhiệt độ nƣớng là 160oC, 190oC và trên 225oC từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn [24]. Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy , Thụy Sĩ , Anh và Mỹ đã cho thấy các loại thực phẩ m có nguồ n gố c thực vâ ̣t giàu carbohydrate khi đƣợc chế biế n bằng các phƣơng pháp đòi hỏi nhiê ̣t đô ̣ cao (>120oC) đều sản sinh acrylamide [16, 30, 41]. Nguyên nhân là trong sản xuất bánh nƣớng, sự tạo thành màu vàng sau khi nƣớng là do các axit amin phản ứng với đƣờng glucose (phản ứng Maillard) tạo thành hợp chất có màu vàng nâu. Tuy nhiên, chỉ có asparagine là tiền chất chủ yếu tạo thành acrylamide. Những loại đƣờng khử tham gia tạo thành acrylamide mạnh mẽ nhất là glucose, fructose [16, 30]. Hàm lƣợng asparagine tự do trong các loại bột 4 mỳ rất khác nhau, dao động từ 0,14-0,4 g/kg [28]. Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm [30] 1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm Sự lo ngại về acrylamide trong thực phẩ m đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các nghiên cứu đã đƣa ra số liệu về hàm lƣợng acrylamide trong một số loại thực phẩm nhƣ sau: khoai tây chiên 600-4300 µg/kg, bánh bích quy 100-750 µg/kg, bánh mỳ 50-4000 µg/kg, ngũ cốc 50-1350 µg/kg [30]. Mức độ nhiễm acrylamide trong một số sản phẩm thƣơng mại cũng đã đƣợc Uỷ ban Châu Âu báo cáo: bánh mỳ gừng lên đến 7834 µg/kg, trung bình là 303 µg/kg, trong bánh bích quy 3324 µg/kg, trung bình là 145 µg/kg và ở bánh mỳ 2838 µg/kg, trung bình là 244 µg/kg [33]. Tuy nhiên, lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu protein đƣợc chế biế n ở nhiê ̣t đô ̣ cao là thấp , từ 5-50 µg/kg, nhƣng phát hiện với liều cao ở thực phẩm giàu carbohydrate, trung bình 150-4000 µg/kg và không phát hiện thấy ở thực phẩm không nƣớng và thực phẩm luộc [16]. 1.2. ASPARAGINASE 1.2.1. Asparaginase Asparaginase (L-asparagine amidohydrolase) là enzym thủy phân Lasparagine thành axit aspartic và ammonia. Asparaginase có mặt trong giới thực vật, động vật và vi sinh vật. Ở thực vật, phần lớn các nghiên cứu về asparaginase từ cây đậu. Ở động vật, enzyme này đƣợc tìm thấy trong gan gà. Việc sản xuất asparaginase bằng vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu từ năm 1972 [18] . Asparaginase đƣợc sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau [33] nhƣ Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogens, Aeromonas 5 hydrophila, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris, Bacillus subtilis, Streptomyces griseus, Corynebacterium glutamicum [22, 33, 34]. Nấm mốc và nấm men cũng có khả năng sinh asparaginase nhƣ Aspergillus niger, A. oryzae, A. tamarri, A. terreus, Penicillium granulatum, P. digitatum, Fusarium solani, F. oxysporum, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae [22, 33, 34] . Asparaginase có thể đƣợc tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết các chủng sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi. Asparaginase sinh ra từ vi sinh vật khác nhau có khối lƣợng phân tử khác nhau: từ 40 đến gần 200 kDa. Tính chịu nhiệt của các asparaginase khác nhau thƣờng khác nhau. Asparaginase của một số vi khuẩn nhƣ là P. aeruginosa 50071, P. stutzeri MB-405, Erwinia carotovoca và Staphylococcus hoạt động tối ƣu ở 37oC, trong khi asparaginase của Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ƣu chỉ là 20oC [20] . Asparaginase từ A. oryzae hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70oC, đạt cực đại ở 60oC. Tính bền của asparaginase từ A. oryzae đạt đƣợc 2 giờ ở 37oC, pH 4-8, hầu nhƣ không bị bất hoạt ở nồng độ muối cao [24]. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong dải nhiệt độ từ 20-65oC, nhiệt độ tối ƣu khoảng 50oC và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ trên 70oC [42]. 1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm Asparaginase thƣờng đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dƣợc phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase đƣợc sử dụng nhƣ là chất phụ gia với tên thƣơng mại nhƣ Acrylaway®L và PreventASe. Trong dƣợc phẩm, asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar, Oncaspar, Erwinase và Kidrolase [37]. Trong công nghiệp thực phẩm, để giảm lƣợng acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng, asparaginase đƣợc bổ sung trƣớc khi nƣớng để chuyển hóa asparagine thành axit aspartic và ammonia (Hình 2), do vậy asparagine không tham gia vào phản ứng Maillard nên sự hình thành acrylamide giảm đáng kể [24, 28]. 6 Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase [28] Đối với mỗi loại thực phẩm, lƣợng enzyme đƣợc bổ sung, thời gian ủ, pH, nhiệt độ, độ ẩm đều ảnh hƣởng đến khả năng loại acrylamide trong thành phẩm [24]. Công ty DSM đã khuyến cáo lƣợng enzym cần sử dụng phụ thuộc vào chất lƣợng của từng loại nguyên liệu, hàm lƣợng asparagine, thời gian và nhiệt độ áp dụng trong quá trình làm bánh. Đối với bánh làm từ bột mỳ thì cần sử dụng asparaginase với liều 77-385 IU/kg, còn bánh làm từ các bột của hạt ngũ cốc nhƣ bột ngô thì cần liều dùng 20-850 IU/kg và từ bột khoai tây thì liều dùng cần là 5001500 IU/kg. Khi bổ sung asparaginase vào bột mỳ ƣớt đã cho thấy hàm lƣợng acrylamide trong vỏ bánh mỳ giảm từ 36% đến 75%. Ngoài ra sự hình thành acrylamide từ các sản phẩm bánh quy, bánh nƣớng, bánh đậu phộng đã giảm tới trên 80% sau khi bổ sung asparaginase vào bột nguyên liệu trƣớc khi nƣớng bánh. Hơn thế nữa, các sản phẩm từ bột khoai tây đã đƣợc phát hiện có hàm lƣợng acrylamide rất cao, lên tới 2500 ppb, nhƣng sau khi bổ sung asparaginase vào bột khoai tây ƣớt đã làm giảm trên 80% lƣợng L-asparagine tự do. Sau quá trình nƣớng, asparaginase bị mất hoàn toàn hoạt tính, dƣ lƣợng chất rắn hữu cơ trong sản phẩm thực phẩm sau cùng là từ 2-13 mg/kg (0,0002-0,0013%) đối với bánh mỳ; 0,2-30 mg/kg (0,00002-0,0030%) đối với các sản phẩm bánh có nguồn gốc từ ngũ cốc; 4562 mg/kg (0,0004-0,0562%) đối với các sản phẩm từ khoai tây và 3-5 mg/kg (0,0003-0,0005%) đối với các sản phẩm gia vị. Asparaginase có mặt trong thực 7 phẩm ở hàm lƣợng thấp đƣợc xem nhƣ là các protein không hoạt động và không gây hại cho ngƣời sử dụng [42]. 1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp asparaginase kể trên thì E. coli, Ewinia carotovora, Serratia marcescens, S. cerevisiae, A. oryzae và A. niger đã đƣợc sử dụng để sản xuất asparaginase ở quy mô công nghiệp ứng dụng vào trong y tế và thực phẩm [20, 33]. Rất nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, pH và nhiệt độ lên men nhằm thu đƣợc lƣợng asparaginase tối đa. Baskar và Renganathan (2011) cho rằng ammonium chloride là nguồn nitơ tốt nhất đối với Aspergillus terreus MTCC1782, trong khi đó Sarquis và cộng sự (2004) lại cho rằng môi trƣờng bổ sung 2% proline phù hợp với A. terreus IOC 217 và A. tamari IOC 186 [36]. Nhƣng đối với chủng E. coli thì nguồn cazein thủy phân 0,2% hoặc cao men 0,1% hoặc tryptone 1% đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sản lƣợng asparaginase cao. Hầu hết các chủng tự nhiên này thƣờng chỉ sản xuất asparaginase ở một lƣợng rất thấp nhƣ E. coli 0-225 U/g (đơn vị/g tế bào khô), E. carotovora 40-450 U/g, S. marcescens 100-335 U/g [22, 33], S. cerevisiae 100-180 U/g, Aspergillus terreus 58 U/l (đơn vị/lít dịch lên men), A. tamari 38 U/l, A. oryzae 140 U/l, A. niger 70 U/l [48]. Trƣờng hợp hiếm, Rani và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc chủng Aspergillus sp KUFS20 có khả năng tổng hợp asparaginase lên đến 3800 U/l [37]. Việc sản xuất asparaginase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp là con đƣờng có triển vọng nhất để thu đƣợc chế phẩm enzyme đạt sản lƣợng cao, giá thành rẻ, có khả năng ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và dƣợc phẩm. 1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp Vi khuẩn E. coli có khả năng sản xuất hai loại asparaginase khác nhau về tính chất, nhất là khả năng ái lực của chúng với asparagine [12]. Asparaginase II, khác với asparaginase I, có ái lực cao hơn với asparagine và có hoạt tính chống lại sự hình thành khối u, đƣợc tìm thấy ở khoang chu chất. Do đó một loạt các nghiên cứu 8 về tính chất, biểu hiện và sản xuất asparaginase II từ E. coli đƣợc triển khai. Lasparaginase II của E. coli đƣợc cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị giống nhau và có khối lƣợng phân tử là 141 kDa. Mỗi tiểu đơn vị gồm 326 gốc axit amin và cứ 2 tiểu đơn vị hợp lại thành một dimer có chứa đầy đủ các đơn vị cấu trúc và các nhóm chức năng cho một enzym hoạt động. Tuy nhiên, dạng hoạt động của enzyme này luôn tồn tại ở dạng tetramer [39]. Enzyme đạt hoạt tính tối đa ở pH 6-7 tại 40oC. Vì enzym từ E. coli có dải pH tối ƣu rộng và có ái lực lớn với cơ chất nên thuận tiện hơn trong ứng dụng thực tiễn. Do đó, hiện nay ngƣời ta vẫn tập trung vào nghiên cứu asparaginase II từ E. coli. Harms cùng cộng sự (1991) đã thiết kế thành công hệ biểu hiện cho L-asparaginase II từ E. coli. Enzym đƣợc tiết vào khoang chu chất và đƣợc thu nhận với hàm lƣợng là 10-15 mg/l [23]. Nhƣợc điểm của hệ biểu hiện này là hiệu suất thu hồi enzyme không cao, hoạt tính enzyme thấp và quy trình tinh sạch phức tạp (phá tế bào, loại bỏ endotoxin) [14]. Để khắc phục nhƣợc điểm này, Khushoo và cộng sự (2005) đã tạo đƣợc chủng E. coli tái tổ hợp tiết E. coli Lasparaginase II ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy nên enzyme ít bị protease phân hủy hơn, thƣờng ở dạng hòa tan và hoạt động, nhờ thế mà hiệu suất thu hồi enzyme tăng lên đáng kể, đạt 86% và sản lƣợng enzym thu đƣợc tăng gấp 8 lần, ứng với 95 mg/l, hoạt tính enzyme đạt đƣợc 20950 IU/l. Tiếp đến, nhiều tổ hợp chủng vector biểu hiện đƣợc thử nghiệm nhằm tìm ra chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất E. coli Lasparaginase II ra ngoài môi trƣờng. E. coli asparaginase biểu hiện khi lên men ở quy mô lớn hơn đạt đƣợc sản lƣợng rất cao, tới 5,24 g/l với hoạt tính enzyme là 870000 IU/l, ứng với 80% hoạt tính của asparaginase tự nhiên [27]. E. coli là cơ thể vật chủ đƣợc sử dụng thƣờng xuyên cho biểu hiện protein tái tổ hợp do chúng dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh và chấp nhận nhiều loại vector. Tuy nhiên asparaginase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn thƣờng gây ra những tác dụng phụ khi thử nghiệm ở ngƣời cũng nhƣ ứng dụng vào trong công nghệ thực phẩm và dƣợc phẩm, nhƣ gây ra các phản ứng dị ứng và sốc phản vệ. Asparaginase tổng hợp từ E. coli đã đƣợc thử trên một loạt các động vật thí nghiệm (thỏ, chuột, chó) và gây ra những ảnh hƣởng bất lợi cho động vật nhƣ giảm cân nặng, giảm khả 9 năng tiêu thụ thức ăn, dị ứng [42]. Do đó, các nhà khoa học đã tiến hành tìm những nguồn sản xuất asparaginase mới an toàn hơn. 1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn (chủng GRAS) tái tổ hợp Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris và Aspergilus spp là những chủng đã đƣợc chứng nhận là an toàn đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại protein dùng trong y tế. Cũng giống nhƣ E. coli, S. cerevisiae cũng tổng hợp hai loại asparaginase khác nhau: asparaginase I đƣợc tổng hợp thƣờng xuyên trong tế bào và đƣợc mã hóa bởi gen ASP I, còn asparaginase II thì đƣợc tổng hợp ở một lƣợng rất ít dƣới sự điều hòa của nguồn nitơ và đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Asparaginas II từ S. cerevisiae đƣợc mã hóa bởi gen ASP3 và đạt hoạt tính cao nhất ở pH 6,8 và nhiệt độ 65oC [19, 26]. Do asparaginase II đƣợc tổng hợp trong S. cerevisiae rất ít, 100-180 U/g, ngay cả khi đƣợc tổng hợp từ các chủng đột biến bị làm yếu đi nhu cầu nitơ, nên việc biểu hiện gen asparaginase II tái tổ hợp của S. cerevisiae trong một hệ biểu hiện sinh vật nhân chuẩn khác có thể coi là một giải pháp hứa hẹn nhằm làm tăng mức độ biểu hiện của enzym. P. pastoris là cơ thể chủ đƣợc sử dụng rất thành công để biểu hiện nhiều loại protein tái tổ hợp với năng suất cao nhờ có promoter AOX1 rất mạnh đƣợc cảm ứng bởi methanol. Ferrara cùng cộng sự lần đầu tiên đã thu đƣợc S. cerevisiae asparaginase II tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong nấm men P. pastoris với hoạt tính là 800 U/g, cao gấp bảy lần so với chủng đột biến. Tuy nhiên asparaginase tái tổ hợp không đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng dù trình tự tiết đã đƣợc gắn trong vectơ biểu hiện. Có thể lý giải là do một tiểu phần nào đó của enzym này đã liên kết với thành tế bào của cơ thể chủ, do đó đã ngăn cản sự tiết enzym này ra ngoại bào. Ngoài ra, promoter AOX1 của P. pastoris đƣợc lấy từ gen mã hóa cho alcohol oxidase enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa methanol để tạo thành formaldehyde. Do vậy, trong quá trình tổng hợp protein tái tổ hợp, việc cảm ứng methanol sẽ dẫn tới hình thành sản phẩm phụ là formaldehyde - một chất gây độc cho con ngƣời. Do đó, để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, formaldehyde cần phải đƣợc loại bỏ khỏi 10 asparaginase tái tổ hợp. Điều này sẽ khiến cho quy trình sản xuất công nghiệp của asparaginase trong P. pastoris phức tạp hơn, đồng nghĩa với giá thành chế phẩm enzym cũng nhƣ của sản phẩm cuối (thực phẩm chứa nhiều tinh bột) sẽ tăng cao [31]. Ngoài hệ biểu hiện protein tái tổ hợp P. pastoris thì S. cerevisiae cũng đƣợc sử dụng rất rộng rãi để biệu hiện nhiều loại chế phẩm sinh học trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm và y học. S. cerevisiae là an toàn sinh học và có khả năng sinh tổng hợp hàm lƣợng protein, vitamin rất lớn, có giá trị dinh dƣỡng cao nên thƣờng đƣợc bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho ngƣời và động vật. Tuy nhiên, protein ngoại lai đƣợc tiết từ S. cerevisiae thƣờng thấp, chỉ đạt 0,1- 5 mg/l. Có thể đây cũng là lý do cho tới thời điểm này vẫn chƣa có một công bố nghiên cứu nào về việc biểu hiện asparaginase tái tổ hợp trong S. cerevisiae. Hãng Novozymes A/S Denmark và DSM đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tƣơng ứng A. oryzae và A. Niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm làm giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm. Tên thƣơng mại của sản phẩm asparaginase từ A. oryzae là Acrylaway®L, còn asparaginase từ A. niger là PreventASeTMM, PreventASeTMW (dạng bột) và PreventASeTML (dạng lỏng). Asparaginase từ A. oryzae có hoạt tính trong dải pH từ 2-11, đạt cực đại ở pH 6-7; bền ở pH 4-8; hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70oC, đạt cực đại ở 60oC. Tính bền của A. oryzae asparaginase đạt đƣợc 2 giờ ở 37oC, pH 4-8, không bị bất hoạt ở nồng độ muối cao [24]. Novozymes A/S đã thiết kế thành công vector biểu hiện asparaginase từ A. oryzae trong chủng biến đổi gen A. oryzae. Asparaginase tái tổ hợp đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng ở quy mô nhỏ với hoạt tính enzym là 14280 IU/g, còn ở quy mô công nghiệp là 3500 IU/g. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong dải pH từ 2-9, tối ƣu ở pH 4-5 và trong dải nhiệt độ từ 20-65oC với nhiệt độ tối ƣu khoảng 500C và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ trên 70oC. Chế phẩm enzym dạng lỏng có màu nâu, trong suốt, hoạt tính enzyme đạt từ 2375-2625 IU/ml, pH: 4,3-4,7. Chế phẩm bột có dạng hạt nhỏ, màu trắng, hoạt tính enzyme đạt từ 9500-10500 đơn 11
- Xem thêm -