Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú her2 trong tảo chlamydomonas reinhardtii

TrÇn ThÞ HuyÒn Trang MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………. 1 Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………………………...... 3 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú………………………………………………..... 3 1.1.1. Khái niệm ung thư vú (UTV)............................................................................ 3  1.1.2. Phân loại............................................................................................................ 3  1.1.3. Nguyên nhân gây UTV...................................................................................... 6  1.1.4. Các phương pháp điều trị ung thư vú………………………………………… 8 1.2. Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú……………………………….  9 1.2.1. Cấu trúc của gen HER2......................................................................................  9 1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên HER2………………………………………………...  9 1.2.3. Cơ chế hoạt động của thụ thể HER2……………………………………….....  11 1.3. Ung thư vú dương tính HER2.............................................................................. 11 1.4. Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2……………………………. 13 1.4.1 Khái niệm............................................................................................................ 13 1.4.2. Kháng thể đơn dòng và ứng dụng điều trị ung thư vú....................................... 16 1.5. Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng………………………………... 18 1.5.1. Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma…………………………………. 18 1.5.2. Phương pháp tái tổ hợp……………………………………………………...... 19 1.6. Các hệ thống biểu hiện gen truyền thống………………………………………. 20 1.6.1. Hệ thống biểu hiện tế bào vi khuẩn…………………………………………... 20 1.6.2. Hệ thống biểu hiện tế bào nấm men………………………………………….. 21 1.6.3. Hệ thống biểu hiện tế bào động vật có vú…………………………………...... 21 1.6.4. Hệ thống biểu hiện tế bào thực vật…………………………………………… 21 1.6.5. Hệ thống biểu hiện vi tảo…………………………………………………...... 22 1.7. Hệ biểu hiện tảo Chlamydomonas reinhardtii………………………………...... 23 1.7.1. Đặc điểm sinh học…………………………………………………………..... 23 1.7.2. Ứng dụng của tảo Chlamydomonas reinhardtii trong công nghệ gen……...... 25 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 1.8.Phương pháp chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardti thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………………….. 27 1.8.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………... 28 1.8.2. Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens………………………… 29 1.8.3. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen……………………………………… 29 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……………………………………. 31 2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................ 31 2.1.1. Sinh phẩm.......................................................................................................... 31 2.1.2. Hoá chất và môi trường………………………………………………………. 31 2.1.3. Thiết bị máy móc …………………………………………………………….. 33 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………… 33 2.2.1. Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli ………………………………. 33 2.2.2. Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR……………………………………… 35 2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ………………………………………... 36 2.2.4. Phương pháp thu DNA từ gel agarose………………………………………... 36 2.2.5. Phương pháp cắt, gắn AND…………………………………………………... 37 2.2.6. Phương pháp biến nạp plasmid vào E. coli…………………………………… 38 2.2.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA…………………………. 39 2.2.8. Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp xung điện……………………………………………………………… 39 2.2.9. Phương pháp chuyển gen vào tảo C. reinhardtii nhờ A. Tumefaciens………... 41 2.2.10. Phương pháp đếm tế bào…………………………………………………….. 42 2.2.11. Phương pháp kiểm tra biểu hiện gen GUS bằng nhuộm hoá mô tế bào……. 42 2.2.12. Phương pháp tách ADN tổng số của tảo…………………………………….. 42 2.2.13. Phương pháp tách protein tổng số từ tảo……………………………………. 43 2.2.14. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide………………………. 43 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………………………………... 45 3.1. Khuếch đại đoạn gen mã hoá kháng thể tái tổ hợp từ vector pStrepHis1525/antiHER2 ...………………………………………………………... CNSHK810 45 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………………………………………... 51 3.3. Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào vi khuẩn A. tumefaciens…………... 58 3.4. Chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardtii……………………... 60 3.4.1. Phương pháp và điều kiện chuyển gen vào tảo C. reinhardtii thông qua A. tumefaciens………………………………………………………………………….. 60 3.4. 2. Kiểm tra sự chuyển gen antiHER2 vào tảo C. reinhardtii bằng phản ứng PCR…………………………………………………………………………….......... 63 3.5. Kiểm tra sự biểu hiện gen GUS………………………………………………… 66 3.6. Kiểm tra sự biểu hiện của gen antiHER2 trong tảo C. reinhardtii……………... 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………………….. 71 Kết luận……………………………………………………………………………… 71 Kiến nghị…………………………………………………………………………….. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 73 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………………... CNSHK810 80 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. tumefaciens DNA RNA AS bp BRCA C. reinhardtii CBB CBD CTAB ddNTP dNTP E. coli EDTA EGFR ER EtBr Fab Fc Fv GF GUS HER2 Ig Kb kDa LB MAbs MAPK mARN Agrobacterium tumefaciens Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Acetosyringone Base pair Breast cancer = ung thư vú Chlamydomonas reinhardtii Coomasie Brilliant Blue Chitin Binding Domain Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Dideoxyonucleotit triphosphat Deoxyonucleotit triphosphat Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Epidermal Growth Factor Receptor = Thụ thể các yếu tố tăng trưởng biểu bì Estrogen Ethidium bromide Fragment antigen binding Fragment cristallisable Fragment constant Growth Factor β-glucuronidase Human Epidermal Growth Factor Receptor Immunoglobulin Kilobases kiloDaltons Left Border Monoclonal antibody = Kháng thể đơn dòng Mitogen-activated protein kinases Messenger acid ribonucleic CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang Nos NPTII PCR PI3K PR RB scFv SDS SDS-Page Taq T-DNA TAE TAP TE Ti-plasmid TNM UTV v/ph VH Vir VL X- Glu Nospaline synthease Neomycin phosphotransferase gene Polymerase chain reaction Phosphoinositide 3-kinases Progesterone receptor Right border single chain Fv Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Thermus aquaticus polymerase Transfer- DNA Tris acid acetic EDTA Tris-Acetate-Phosphate Tris- EDTA Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Tumor- nodes - metastasis Ung thư vú Vòng/phút Variable region of heavy chain = vùng biến đổi của chuỗi nặng Virulence region = vùng gây độc Variable region of light chain = vùng biến đổi của chuỗi nhẹ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Một số mảnh kháng thể đơn chuỗi 16 3.1 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen AntiHER 2 47 3.2 3.3 3.4 3.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBI101 và pJet1.2 mang gen antiHER2 bằng BamH I và Sac I Thành phần phản ứng ghép nối giữa gen antiHER2 vào pBI101 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại đoạn AntiHER2 từ ADN tổng số của tảo C. reinhardtii Tỷ lệ chuyển gen GUS 53 55 64 67 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên Hình Trang 1.1 Các dạng ung thư vú 5 1.2 Cấu trúc của protein HER2 10 1.3 Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2 12 1.4 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể 14 1.5 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi 16 1.6 Cấu tạo tế bào tảo Chlamydomonas reinhardtii 24 1.7 Vòng đời của Chlamydomonas 25 3.1 Cấu trúc kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu HER2 46 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi AntiHER2F /AntiHER2R 48 3.3 Sơ đồ vector PJET1.2/blunt 48 3.4 Vi khuẩn E. coli mang vector tái tổ hợp mọc trên môi trường có 49 chứa Amppicllin sau 15 giờ nuôi cấy ở 370C 3.5 Sản phẩm cắt pJet1.2 tái tổ hợp bằng Enzyme giới hạn BamH I, 50 Sac I 3.6 Đoạn T- DNA của vector chuyển gen pBI101 52 3.7 Sản phẩm cắt loại bỏ gen GUS của pBI101 bằng 2 enzyme 54 BamH I, Sac I 3.8 Kết quả tách plasmid từ E. coli TG1 đã biến nạp pBI101 tái tổ hợp 55 3.9 Kết quả sản phẩm PCR từ plasmid tách từ khuẩn lạc E. coli TG1 56 sau biến nạp 3.10 Một đoạn Chromatograph của gen antiHER2 57 3.11 Kết quả biến nạp vector pBI101 tái tổ hợp vào A. tumefaciens 59 sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC 3.12 Kết quả sản phẩm PCR từ khuẩn lạc A. tumefaciens biến nạp 59 3.13 Hình thái tế bào tảo C. reinhardtii trên môi trường TAP sau 7 61 ngày nuôi cấy. CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 3.14 Tảo C. reinhardtii chuyển gen sau 2 tuần nuôi cấy trên môi 63 trường TAP 3.15 Kết quả tách ADN tổng số của tảo C. reinhardtii chuyển gen 63 3.16 Kết quả sản phẩm PCR từ ADN tổng số tảo C. reinhardtii 65 chuyển gen 3.17 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen GUS trong tảo C. reinhardtii 67 chuyển gen 3.18 Kết quả điện di kiểm tra protein tổng số của tảo C. reinhardtii CNSHK810 68 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghiệp, đời sống vật chất của con người ngày một nâng cao, nhưng mặt trái của sự phát triển đó là tạo ra hàng loạt các yếu tố gây ô nhiễm môi trường như hoá chất, phóng xạ là những nhân tố đầy rủi ro có thể gây ung thư - căn bệnh hiểm nghèo và là nỗi hoang mang của toàn nhân loại. Ước tính, năm 2010, Việt Nam có ít nhất 126.300 ca ung thư mắc mới trong đó, ung thư vú, dạ dày, phổi, đại trực tràng vẫn gặp nhiều nhất [71]. Ung thư vú là loại ung thư thường thấy ở phụ nữ, chiếm 25% tỷ lệ tử vong do ung thư ở các nước phát triển. Theo tổ chức y tế thế giới WHO, năm 2004, ước tính có khoảng 1,2 triệu người trên toàn thế giới bị ung thư vú. Trên toàn thế giới, tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư vú gia tăng đều đặn hằng năm, ung thư vú ở phụ nữ được xếp vào hạng nguy cơ hàng đầu, nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau ung thư phổi. Nếu không được điều trị, dạng ung thư này nhanh chóng gây nguy hiểm tới tính mạng, nhưng có phản ứng tốt nếu được điều trị sớm [52,59]. Liệu pháp kháng thể đơn dòng đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đã tìm ra nhiều kháng nguyên đích để điều trị bệnh ung thư. Đối với mỗi dạng ung thư có một vài kháng nguyên đặc trưng cho từng loại, với ung thư vú đó là kháng nguyên HER2. Protein HER2 được mã hoá bởi gen HER2 (Human Epidermal Growth Factor), thuộc họ các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì. Khi biểu hiện quá mức thụ thể HER2 sẽ làm tế bào phân chia không thể kiểm soát dẫn đến ung thư. Sự biểu hiện quá mức của HER2 được xác định trong 25 35% bệnh nhân ung thư vú và một số bệnh ung thư khác như ung thư buồng trứng, ung thư tử cung... Vì vậy, trên thế giới rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu để sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp tạo ra các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho sự chẩn đoán và mang lại hiệu quả cao hơn trong điều trị ung thư vú [52,59]. Tuy nhiên, sau khi có được gen tái tổ hợp thì việc biểu hiện để thu nhận và tinh sạch các kháng thể tái tổ hợp này là một vấn đề nan giải. Hiện nay, có rất nhiều hệ biểu hiện được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm cả 1 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang prokaryote và eukaryote. Trong những năm gần đây, khả năng chuyển gen vào tảo để sản xuất kháng thể tái tổ hợp, vaccin, protein diệt sâu hay sản xuất hydro sinh học đã được chứng minh. Tảo lục đơn bào Chlamydomonas reinhardtii được biết đến là một hệ thống biểu hiện có khả năng sản xuất các phân tử protein hiệu quả với chi phí thấp, tốc độ phát triển nhanh, có khả năng lắp ráp các phân tử phức tạp để hình thành phân tử hoạt tính, rất an toàn và khả năng tinh sạch protein tái tổ hợp đơn giản [14,47]. Vì vậy, tảo này được xem là tế bào chủ có tiềm năng rất lớn cho việc sản xuất các protein thuốc cho điều trị bệnh trong đó có kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2 trong tảo Chlamydomonas reinhardtii” Mục tiêu của đề tài: - Thiết kế được vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2. - Nghiên cứu chuyển gen kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 vào trong tảo Chlamydomonas reinhardtii. - Nghiên cứu khả năng biểu hiện của kháng thể trong tảo Chlamydomonas reinhardtii. 2 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú 1.1.1. Khái niệm ung thư vú (UTV) Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư tế bào tăng sinh một cách vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo các cơ chế phát triển bình thường. Ða số bệnh ung thư sẽ hình thành nên các khối u. Khác với các khối u lành tính chỉ phát triển tại chỗ, có vỏ bọc xung quanh và thường rất chậm, các khối u ác tính (ung thư) có xu hướng xâm lấn sang các tố chức lành tính xung quanh. Hiện nay, có trên 200 loại ung thư khác nhau đã được phát hiện [3]. Ung thư vú là bệnh ung thư bắt nguồn từ mô vú. Nguyên nhân chủ yếu của bệnh UTV là do sự phát triển bất thường của các tế bào kiến tạo nên các thành phần của vú, cụ thể như do sự bất thường bắt nguồn từ ống tuyến được gọi là ung thư ống tuyến (ductual carcinomas), hay sự phát triển bất thường của các tiểu thuỳ dẫn đến ung thư tiểu thuỳ (lobular carcinomas) [65]. Có nhiều loại ung thư vú khác nhau với mức độ lan truyền, mức độ xâm lấn và mức độ tác động đến gen khác nhau và mỗi loại ung thư lại có mức độ lành tính, ác tính khác nhau. Tuy nhiên, có 1 điểm chung là UTV nếu không được chẩn đoán sớm và chữa trị kịp thời, các tế bào ung thư sẽ phát triển nhanh chóng trong vú, đi vào các mạch máu hay mạch bạch huyết, chạy tới các hạch, có thể xâm lấn sang các bộ phận khác, gây ra đau đớn cho bệnh nhân và cuối cùng sẽ dẫn đến tử vong [3,31]. 1.1.2. Phân loại UTV có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển, bệnh học, mức độ bệnh, thụ thể, sự có mặt hay vắng mặt của các gen đặc trưng cho bệnh. - Theo giai đoạn phát triển (TNM): Là phương pháp phân loại UTV dựa vào kích thước của khối u (T), khối u dù có hay không lan sang u hạch (N) ở nách, và khối u đã di căn (M) hay lây lan sang các phần khác của cơ thể. Các giai đoạn chính: 3 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang Giai đoạn Tis là ung thư biểu mô tại chỗ, giai đoạn tiền ác tính, có biểu hiện. Giai đoạn từ 1-3 là giai đoạn ung thư sớm và có khả năng chữa khỏi được. Giai đoạn 4 là giai đoạn ung thư di căn và không có khả năng chữa khỏi [65]. - Theo bệnh học: Theo phương pháp này UTV được chia thành 2 dạng chính là ung thư biểu mô ống dẫn hay tiểu thùy. Ung thư ở các mô khác được xem như là loại ung thư hiếm gặp [65]. Ung thư biểu mô tại chỗ (Carcinoma in situ): Các tế bào ung thư trong biểu mô tăng sinh nhanh chóng, không xâm lấn sang các mô xung quanh. Ung thư xâm lấn (Invasive carcinoma) thì có sự xâm lấn sang các mô xung quanh. - Theo cấp độ bệnh: Các tế bào bình thường qua quá trình biệt hóa sẽ hình thành nên các cơ quan khác nhau trong cơ thể với các chức năng riêng biệt. Với các tế bào ung thư, do mất đi sự phân hoá, tế bào trở nên hỗn độn, mất trật tự, các tế bào sẽ phân chia không kiểm soát được. Các nhà nghiên cứu bệnh học cho rằng các tế bào có sự phân hoá tốt (giai đoạn thấp), mức phân hoá ở mức độ vừa phải (giai đoạn trung bình), và mức phân hoá kém (giai đoạn cao). Các trường hợp ung thư ở mức độ phân hoá kém thì được chẩn đoán là bệnh rất nặng [65]. - Theo tình trạng thụ thể: Mỗi tế bào đều có các thụ thể đặc trưng trên bề mặt tế bào, trong tế bào chất và nhân. Với các tế bào UTV, 3 loại thụ thể đặc trưng là thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và HER2/neu. Tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các loại thụ thể này các nhà khoa học đã chia UTV thành các dạng dương tính ER (ER+), âm tính ER (ER-), PR+, PR-, HER2+, HER2-. Các tế bào mà không có các thụ thể này thì được gọi là dạng cơ bản hay âm tính với cả ba thụ thể. Căn cứ vào tình trạng thụ thể có thể chẩn đoán loại ung thư vú và xác địch chính xác mục tiêu điều trị [17,58,65]. Như vậy, UTV rất đa dạng về cả khía cạnh triệu chứng lâm sàng, tác nhân gây bệnh và đặc điểm hình ảnh. Hiện nay có nhiều hệ thống phân loại UTV, trong đó hệ thống phân loại phổ biến hiện nay là hệ thống phân loại của Tổ chức Y tế thế giới WHO. Hệ thống này phân loại UTV thành 4 kiểu chính [63]. 4 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang - Ung thư không xâm lấn (tại chỗ) : ung thư ống tuyến tại chỗ ung thư tiểu thùy tại chỗ - Ung thư xâm nhiễm: ung thư ống tuyến xâm nhiễm ung thư tiểu thùy xâm nhiễm - Ung thư viêm nhiễm - Bệnh paget núm vú . Các dạng ung thư vú được thể hiện ở Hình 1.1. I II III IV Hình 1.1. Các dạng ung thư vú I-ung thư ống tuyến tại chỗ; II- ung thư tiểu thùy tại chỗ; III- ung thư ống tuyến thâm nhiễm; IV- ung thư tiểu thùy thâm nhiễm. Trong đó: ở hình ảnh tuyến vú: A: ống tuyến; B: tiểu thuỳ; C: vùng giãn nở của ống tuyến để giữ sữa; D: núm vú; E: mô mỡ; F: cơ ngực; G: thành ngực, ở hình phóng to: A: tế bào ống/tiểu thuỳ bình thường; B: tế bào ống/tiểu thuỳ ung thư; C: màng rìa; D: lõi ống. 5 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 1.1.3 . Nguyên nhân gây UTV Có rất nhiều nguyên nhân gây nên UTV tiêu biểu như giới tính, tuổi tác, mức độ hormone. Trong một nghiên cứu công bố năm 1995, những nguyên nhân nêu trên chiếm khoảng 47% trong tổng số các ca UTV, chỉ 5% là do yếu tố di truyền [65]. Tuổi tác và tiền sử sinh sản - Tiền sử bệnh nhân: Những phụ nữ đã bị ung thư vú ở 1 bên thì nguy cơ mắc bệnh ở bên vú còn lại sẽ cao hơn [65]. - Tiền sử gia đình: nếu trong gia đình có mẹ, chị hay em gái bị ung thư vú thì nguy cơ bị bệnh ung thư vú của họ là rất cao. Các nguy cơ sẽ cao hơn nếu các thành viên của gia đình bị ung thư vú trước 40 tuổi [65]. - Tuổi tác: Tuổi càng cao thì nguy cơ UTV càng cao. Phần lớn phụ nữ da trắng mắc bệnh UTV ở tuổi 50 đến 60. Tuổi dậy thì, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liên quan chặt chẽ với UTV. Người ta đã chứng minh rằng ở những phụ nữ có kinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao hơn so với phụ nữ bình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển UTV. Mãn kinh muộn sau tuổi 55 và mãn kinh muộn một năm tỉ lệ UTV tăng 3 %. Phụ nữ chưa mang thai có nguy cơ mắc UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có mang thai. Phụ nữ sinh con lần đầu càng sớm thì nguy cơ mắc UTV càng thấp và tỉ lệ này tăng 3% cho mỗi năm chậm sinh con lần đầu. Sinh con sau 30 tuổi có nguy cơ bị UTV cao gấp từ 2 - 5 lần so với nhóm sinh con trước tuổi 19 [23,37,43]. Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai trong thời gian dài với UTV. Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1 lần. Những cuộc nghiên cứu mới nhất cho thấy phụ nữ dùng các loại thuốc như Prempro, Provera hay Premarin sau khi tắt kinh có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTV [37,43]. 6 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang Yếu tố di truyền Đột biến ở một số gen có thể làm cho tế bào bình thường chuyển thành dạng ác tính. Năm 1994, người ta tìm thấy sự liên quan giữa đột biến gen ức chế khối u BRCA-1 và BRCA-2 nằm trên nhiễm sắc thể 17 và 13 với bệnh UTV, ung thư buồng trứng và một số loại ung thư khác. Do nằm trên nhiễm sắc thể thường, các gen này có thể di truyền từ bố hoặc mẹ (xác suất là 1/2). Những phụ nữ mang các gen này có nguy cơ bị UTV cao. Nếu nguyên nhân do những rủi ro trong cuộc sống thì khả năng ung thư vú là 12% thì phụ nữ có 1 trong những gen này thì có nguy cơ bị khoảng 60%. Khoảng 5% các trường hợp UTV có đột biến gen BRCA1 và thường bị bệnh khi còn trẻ. Đột biến gen BRCA-2 cũng có nguy cơ gây UTV ở nữ tương đương với nguy cơ đột biến gen BRCA-1 [23,37,43]. Đột biến gen p53 và một số gen khác cũng liên quan với nguy cơ UTV. Những hội chứng do các rối loạn về di truyền như hội chứng Li-Fraumeni, hội chứng Cowden, hội chứng Muir, giãn mạch thất điều cơ cũng có thể làm xuất hiện UTV. Những nghiên cứu gần đây cho thấy có khoảng 10% UTV do di truyền [23]. Các yếu tố dinh dưỡng và môi trường Chế độ và thói quen ăn uống ăn thức ăn giàu chất béo, sử dụng rượu bia, thuốc lá, phóng xạ có ảnh hưởng tới khả năng mắc UTV. Một số loại thực phẩm, thuốc reserpin, cafein, thuốc xịt tóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ làm tăng nguy cơ phát triển UTV. Nhiều nghiên cứu gần đây cũng cho thấy các hợp chất hữu cơ chứa Clo như PCBs (polychlorinated biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ mắc UTV [9,43]. Ngoài ra, còn một số yếu tố rủi ro khác như vấn đề liên quan đến chủng tộc như phụ nữ da trắng thì mắc ung thư vú nhiều hơn là phụ nữ Châu Á, Châu phi, Châu Mỹ La tinh [65]. 7 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 1.1.4 . Các phương pháp điều trị ung thư vú Các phương pháp truyền thống: bao gồm phương pháp phẫu thuật, hóa trị và xạ trị. Trong điều trị ung thư vú chúng ta nên kết hợp các phương pháp trên thì mới đạt hiệu quả tốt. Việc lựa chọn phương pháp điều trị cần dựa vào mức độ xâm lấn theo sự chẩn đoán và khả năng tái phát lại bệnh. Ung thư giai đoạn 1 được điều trị với phương pháp phẫu thuật cắt khối u kết hợp hoặc không kết hợp với chiếu phóng xạ. Ung thư giai đoạn 2 và 3 với tiên lượng xấu và rủi ro bị tái phát bệnh cao thì phải điều trị bằng cách phẫu thuật (phẫu thuật cắt khối u hay cắt toàn bộ vú có hoặc không kết hợp với việc cắt cả u hạch), phóng xạ, và hoá trị liệu. Nếu ở giai đoạn 4, ung thư đã di căn thì không có khả năng chữa trị và sẽ được kiềm chế bằng cách kết hợp của tất cả các cách điều trị trên từ phẫu thuật, phóng xạ, hoá trị và các liệu pháp mục tiêu. Các cách điều trị này sẽ làm kéo dài thời gian sống của bệnh nhân ung thư giai đoạn 4 lên khoảng 6 tháng [35,50,65]. Các phương pháp hiện đại: hiện nay, trong điều trị ung thư vú liệu pháp ngăn cản hormone và sử dụng kháng thể đơn dòng đang được chú ý. - Liệu pháp ngăn cản hormone: một số loại ung thư vú yêu cầu cần phải có estrogen để có thể tiếp tục phát triển. Chúng có thể được nhận diện bằng cách xác định sự có mặt của thụ thể estrogen (ER+) và thụ thể progesterone (PR+) trên bề mặt của chúng. Loại ung thư vú này có thể điều trị bằng thuốc ngăn cản quá trình tạo ra estrogen hay ngăn cản các thụ thể như loại thuốc tamoxifen hay loại ức chế aromatase [65]. - Kháng thể đơn dòng: Đây là phương pháp khá phát triển trong việc điều trị ung thư vú do HER2+. Trastuzumab (Herceptin), một loại kháng thể đơn dòng của HER2 đã được sử dụng rất hiệu quả và rộng rãi trong điều trị UTV dương tính HER2. Tuy nhiên giá cả các loại kháng thể đơn dòng này rất cao vì vậy các kháng thể đơn dòng khác cũng đang được nghiên cứu và thử nghiệm nhằm nâng cao hiệu quả và giảm giá thành sản phẩm [35,65]. 8 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang 1.2. Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú 1.2.1. Cấu trúc của gen HER2 Gen HER2 thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì HER (Human Epidermal Growth Factor Receptor) được nghiên cứu phát hiện ra với tên HER-2 và c-erbB-eerG bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985 (Coussens et al., 1985; Semba et al., 1985). Tuy nhiên các nghiên cứu sau đó cho thấy hai gen này hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu (HER2). Nó còn có các tên gọi khác như v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL. HER2 nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm động, ở vị trí q11.2 q12.0, HER2 là một gen tiền ung thư (proto-oncogen) có chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đó exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài 48 bp, gen này có 3 bản sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655). Mặc dù kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra mRNA trưởng thành với khoảng 1800 bp [18,31,34,53,68]. 1.2.2 . Cấu trúc kháng nguyên HER2 HER2 là thành viên của họ thụ thể các yếu tố tăng trưởng biểu bì có hoạt tính tyrosine kinase (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trên bề mặt tế bào ở người, nó tương đương với protein neu ở chuột [18,34,68]. Các thành viên của họ thụ thể này có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản, biệt hóa và phát triển của tế bào. Thụ thể có hoạt tính tyrosine kinase là các thụ thể nằm trên bề mặt tế bào có ái lực cao đối với các yếu tố phát triển (GF – Growth Factor) có bản chất là polypeptide, các cytokine và các hormone. Thụ thể tyrosine kinase có vai trò điều hòa, giúp cho các quá trình trong tế bào được diễn ra bình thường, ngoài ra nó còn có vai trò quan trọng trong việc hình thành và phát triển của nhiều dạng ung thư trong đó có UTV [10,11,12]. Họ các thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô gồm 4 loại thụ thể: HER-1, HER-2, HER-3 và HER-4. Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều 9 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang nhất là HER-2, khối lượng phân tử khoảng 185 kDa (còn được gọi là p185HER2), cấu trúc không gian của nó gồm 3 phần: + Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể. Nằm ở vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng trưởng biểu mô. + Vùng xuyên màng lipit. + Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được phosphoryl hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể (Hình 1.2). Hình 1.2. Cấu trúc của protein HER2 [46] Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal) Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 amino acid, vùng chuyển màng đơn chuỗi dài 22 amino acid và vùng tyrosine kinase nội bào được gồm 580 amino acid. Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I bao gồm các gốc amino acid từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II từ 196 319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -630 10 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang (SEQ4). Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt. Sự hoạt hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm hoạt hóa một dãy các quá trình dẫn đến sự nhị hợp (dimer) giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian cho các quá trình sinh học như sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào [10,15,16]. 1.2.3 . Cơ chế hoạt động của thụ thể HER2 HER2 là một thụ thể không cần liên kết phối tử, có thể biểu hiện trong nhiều loại mô của con người và biểu hiện quá mức trong 25-35% các ca ung thư vú. Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúc của nó luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với ligand, làm cho nó có khả năng bắt cặp hình thành trạng thái dimer với bản thân nó hoặc với các thành viên khác trong họ như HER1, HER3, HER4 ở trạng thái đã liên kết với ligand để hoạt động. Quá trình nhị hợp vùng ngoại bào làm hoạt hoá vùng xuyên màng của thụ thể, dẫn đến sự tự phosphoryl hóa hàng loạt gốc Tyrosine của vùng nội bào. Các gốc đã được phosphoryl hoá đó hoạt động như một trung tâm liên kết của protein có chứa Src homology 2 (SH2) hoặc vùng liên kết phosphotyrosine (PTB). Nó còn gồm có các protein liên kết như Shc, Crk, Grb2, Grb7, kinase như phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein phosphatase tyrosine SHP1 và SHP2 và yếu tố trao đổi nucleotide guanidin như SOS. Mỗi thụ thể đều có một vùng liên kết riêng khác biệt, qua đó sẽ hình thành các phức hệ protein nối khi có sự phosphoryl hóa. Điều này dẫn đến hàng loạt các con đường mà chúng kích hoạt. Hai con đường quan trọng nhất được hoạt hoá bởi sự nhị phân trong họ HER là PI3K/Akt kích hoạt cho các tế bào khối u sống sót và con đường hoạt hoá MAPK (mitogen – Activated protein kinase) kích thích quá trình biệt hoá tế bào. Cả hai con đường này đều dẫn truyền tín hiệu đến đích cuối cùng là nhân và kích hoạt sự hoạt động của gen đích [10,11,18,34,53]. 1.3 . Ung thư vú dương tính HER2 Sự biểu hiện quá mức của HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa HER2 với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3). Đó cũng là những tín hiệu khởi 11 CNSHK810 TrÇn ThÞ HuyÒn Trang đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau. Tuy nhiên mối liên quan giữa các con đường đó là rất khó để có thể xác định. Dưới đây là một đề xuất của Moasser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2 (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2 Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa. Tăng dimer HER2-EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào. Sự tăng dimer hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer HER2HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào. Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 làm tăng isoform hiếm ∆HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu. Một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng trong những tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của những sự thay đổi biểu hiện gen ở mức dư thừa [52]. 12 CNSHK810