Tài liệu Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đỗ Minh Trung NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đỗ Minh Trung NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Lê Văn Đông 2. GS.TS. Đặng Thị Thu HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ĐOAN Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc màng dây rốn thành tế bào xương” mã số: 106.99.174.09 do Học viện Quân y chủ trì. Luận án cũng sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực Miền Nam và ứng dụng vào điều trị bệnh ở người” mã số ĐTĐL 2007-03 do Công ty cổ phần hóa dược phẩm Mekophar chủ trì và Học viện Quân y là đơn vị phối hợp thực hiện. Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nghiên cứu sinh Đỗ Minh Trung LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thượng tá PGS.TS Lê Văn Đông - Chủ nhiệm Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự, Trưởng phòng ProteinĐộc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và GS.TS Đặng Thị Thu, Nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Tô Kim Anh Viện trưởng, PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, PGS.TS Khuất Hữu Thanh, TS. Lê Quang Hòa cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu & phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Đại tá GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó Giám đốc Học viện Quân y cùng các cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất -Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Đỗ Minh Trung năm 2013 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT.......................................................... i DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................ iv ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................ 1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.................................................................................................. 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI .....................................................................................................................4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................................. 5 1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc .............................................................................. 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài ................................................................ 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước................................................................. 6 1.1.3. Tế bào gốc ..................................................................................................................... 7 1.1.4. Phân loại tế bào gốc....................................................................................................... 10 1.1.5. Tế bào gốc trung mô...................................................................................................... 14 1.1.5.1. Khái niệm ................................................................................................................... 14 1.1.5.2. Đặc điểm..................................................................................................................... 14 1.1.5.3. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô.............................................................. 15 1.1.5.4. Các nguồn tế bào gốc trung mô .................................................................................. 19 1.2. Ứng dụng của tế bào gốc ................................................................................................ 21 1.3. Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp ...... 22 1.4. Dây rốn, tế bào gốc từ dây rốn ...................................................................................... 27 1.4.1. Mô học, giải phẫu và chức năng.................................................................................... 27 1.4.2. Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn.................................................................... 27 1.4.3. Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng .................................................... 28 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................... 32 2.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................................... 32 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:................................................................................................... 32 2.1.2. Hóa chất và Máy móc thiết bị........................................................................................ 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 34 2.2.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người ............................................ 34 2.2.1.1. Thu thập và bảo quản dây rốn .................................................................................... 34 2.2.1.2. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người................................................ 34 2.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô màng dây rốn .............................................. 35 2.2.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc ................................................................................. 35 2.2.2.1. Định danh tế bào gốc bằng dấu ấn bề mặt................................................................. 35 2.2.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn ......................................... 36 2.2.3. Biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương............ 36 2.2.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản và nồng độ chất cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương ............................................................................................................ 36 2.2.3.2. Kiểm tra sự tích lũy canxi của tế bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red ............. 38 2.2.3.3. Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô........... 38 2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) ................................................... 38 2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................... 39 2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy ...................................................... 43 2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tế bào ................................................................................... 44 2.2.7. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu...................................................................... 44 2.2.8. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất........................................................ 45 2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch ............................................................ 45 2.2.8.2. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên chuột ........................................................................................................................................ 45 2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin...................................................................................... 46 2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu......................................................................................... 46 2.2.11. Đạo đức trong nghiên cứu......................................................................................... 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 44 3.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người .......... 47 3.1.1. Thu thập mẫu dây rốn.................................................................................................... 47 3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính .................. 47 3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô................................................................................................ 47 3.1.2.2. Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào......................................................... 49 3.1.3. Khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc....................................... 52 3.1.4. Thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô ................................................... 54 3.1.5. Khảo sát số lần cấy chuyển mô ..................................................................................... 60 3.1.6. Khảo sát thời gian cấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào............................................. 62 3.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc .................................................................................... 64 3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt............................................................................ 64 3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn............................................. 67 3.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương .............. 69 3.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương ................................................................................................................. 69 3.3.2. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương ........................................................................................................................ 71 3.3.3. Thời gian biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương ... 75 3.3.4. Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase (ALP) ........................................................... 78 3.3.4. Biệt hóa tế bào ............................................................................................................... 80 3.4. Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tạo xương.................................................................................. 84 3.5. Kết quả bước đầu thử nghiệm cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô trên động vật.................................................................................................................................................89 KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 93 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................... 95 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................................... 109 PHỤ LỤC ............................................................................................................................... 110 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ALP Alkaline phosphatase: phosphatase kiềm AsA Ascorbic acid AsAP L-ascorbic acid 2 phosphat AT Adipose Tissue: Mô mỡ BM Bone Marrow: Tủy xương bp Base pair: cặp base BSA Bovine Serum Albumin BU Busulfan CD Cluster of Differentiation cDNA Complementary deoxyribonucleic acid COL I Colagene type I CY Cyclophosphamide DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM-LG Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose DMSO Dimethyl Sulfoxide D-PBS Dulbecco's Phosphate buffer saline EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid F12 Nutrient Mixture F12 FBS Fetal brovine serum: Huyết thanh bào thai bê FITC Fluorescein isothiocyanate HBV Hepatitis B Virus HCV Hepatitis C Virus HIV Human Immunodeficiency Virus HLA Human leukocyte antigen: Kháng nguyên bạch cầu người IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthin ICM Inner Cell Mass: Khối tế bào bên trong IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium MSC Mesenchymal Stem Cell: Tế bào gốc trung mô OC Osteocalcin ON Osteopontin PBS Phosphate buffer saline pNPP P-Nitrophenyl phosphate i RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse trancriptase Polymerase chain reaction ß-GP ß-glycerolphosphate TBG Tế bào gốc TBTX Tế bào tạo xương TGF-β Transforming growth factor beta UC Umbilical Cord: Dây rốn UCB Umbilical Cord Blood: Máu dây rốn ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô trong tái tạo xương ......................... 21 Bảng 2.1: Thành phần môi trường biệt hóa được khảo sát...................................................... 37 Bảng 2.2: Nồng độ chất cảm ứng biệt hóa được khảo sát ....................................................... 37 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ................................................................... 39 Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào tạo xương bằng kỹ thuật RT-PCR..40 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn ................................... 48 Bảng 3.2: Nuôi cấy mô phân lập tế bào................................................................................... 51 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập tế bào .......................... 52 Bảng 3.4: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác nhau ở những nồng độ khác nhau............................................................................................ 72 Bảng 3.5: Kết quả OD khả năng tích tụ canxi của tế bào biệt hóa .......................................... 77 Bảng 3.6: Hoạt tính Alkaline phosphatase ............................................................................. 79 Bảng 3.7: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa ............................. 82 Bảng 3.8: Hoạt tính Alkaline phosphatase của tế bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn ........................................................................................................................... 83 Bảng 3.8: Kết quả gây suy giảm miễn dịch chuột bằng Busulfan 20mg/kg và Cyclophosphamide 50mg/kg. .................................................................................................. 90 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau của tế bào gốc tạo máu.................................................................................................... 8 Hình 1.2: Các hình thức phân bào ........................................................................................... 8 Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ tế bào gốc ....................................................................... 9 Hình 1.4: Phân loại tế bào gốc theo loại mô hay theo nguồn gốc .......................................... 12 Hình 1.5: Sự thay đổi, biểu hiện các dấu ấn trong quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế bào tạo xương và tế bào mỡ ...................................................................................................... 17 Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ các nguồn khác nhau.................... 20 Hình 1.7: Ứng dụng của Tế bào gốc trung mô được thử nghiệm trên lâm sàng .................... 22 Hình 1.8: Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn.................................................................................. 29 Hình 1.9: Hình ảnh phác thảo về nuôi cấy, tuyển chọn, cấy ghép tế bào gốc trung mô (MSCs: ) từ tủy xương ............................................................................................................. 30 Hình 3.1: Kết quả nhuộm HE xác định cấu trúc dây rốn......................................................... 47 Hình 3.2: Tách màng dây rốn và cắt thành từng mảnh nhỏ..................................................... 48 Hình 3.3. Nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào .................................................................. 50 Hình 3.4: Kết quả khảo sát các môi trường phân lập tế bào.................................................... 53 Hình 3.5: Kết quả thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô................................. 55 Hình 3.6: Kết quả hình ảnh phân lập tế bào gốc trung mô của 10/ 15 mẫu dây rốn ............... 58 Hình 3.7: Kết quả khảo sát số lần cấy chuyển mô phân lập tế bào. ....................................... 61 Hình 3.8: Kết quả nhuộm HE của các miếng mô nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô qua các lần cấy chuyển. ................................................................................................................. 62 Hình 3.9: Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô .................................................................. 63 Hình 3.10: Kết quả phân tích biểu hiện một số marker bề mặt của tế bào thu nhận được sau khi cấy chuyền 3 lần ................................................................................................................ 65 Hình 3.11: Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ ......................................... 68 Hình 3.12: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red .... 70 iv Hình 3.13: Giếng nuôi cấy và tế bào được biệt hóa ở các thời gian khác nhau được nhuộm với alizarin red......................................................................................................................... 76 Hình 3.14: Kết quả xác định canxi theo thời gian biệt hóa tế bào........................................... 77 Hình 3.15: Hoạt tính Alkaline phosphatase ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau ..... 78 Hình 3.16: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red .... 80 Hình 3.17: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa ............................. 81 Hình 3.18: Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase trong 10 mẫu tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn..................................................................................................... 83 Hình 3.19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA của tế bào gốc trung mô ....................... 85 Hình 3.20: Xác định dấu ấn ß-Actin, OC, ON của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn .............................................................................................. 87 Hình 3.21: : Xác định dấu ấn ALP, COL của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào .... 88 Hình 3.22: Hình ảnh sau 1 tháng cấy ghép tế bào tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch 90 Hình 3.23: Nốt can xi sau khi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin.............................. 91 Hình 3.24: Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương .... 92 v ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau. Vì vậy, có thể sử dụng TBG để tạo ra tế bào mới thay thế cho các tế bào bị tổn thương hoặc mất chức năng, đem lại triển vọng trong điều trị một số bệnh nan y có liên quan đến thoái hóa hoặc thiếu hụt tế bào [8,11,14,15,19, 40,77,99]. Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp và có xu hướng ngày càng tăng, gây thiệt hại lớn về kinh tế do chi phí điều trị cũng như thiệt hại do giảm sức lao động và nghỉ việc. Chỉ riêng tại Mỹ, thống kê năm 1999 cho thấy chi phí cho nhóm bệnh này chiếm tới 2,5% GDP (khoảng 225 tỷ USD) nhưng năm 2004 đã lên tới 849 tỷ USD chiếm tới 7,7% GDP. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về dịch tễ các bệnh xương khớp đã được tiến hành: tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi tại Hà nội là 23% và tại thành phố Hồ Chí Minh là 17%. Cùng với sự gia tăng về tuổi thọ, ngoài các bệnh loãng xương và một số bệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái hóa khớp và cột sống đang trở thành vấn đề quan trọng. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, công nghệ tế bào gốc đã mở ra một hướng mới trong điều trị các bệnh về xương khớp và đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số bệnh viện trong nước. Các kết quả điều trị cho thấy việc điều trị bằng tế bào gốc nói chung và các tế bào gốc trung mô nói riêng có kết quả tốt trong tái tạo xương, sụn [30, 124, 138]. Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả [5,6,7,9,10,16]. Phương pháp điều trị thường là tiêm trực tiếp các tế bào gốc từ tuỷ xương vào ổ gãy xương. Khi được tiêm vào ổ gãy xương, các TBG trung mô của tủy xương biệt hoá in vivo thành các tế bào tạo xương (TBTX) và tái tạo lại ổ gãy xương. Ngoài ra các TBG trung mô từ tuỷ xương có thể được phân lập và biệt hoá ex vivo thành các tế bào tạo xương trước khi được ghép trở lại ổ khuyết xương của bệnh nhân [11,13,14,16]. Tuy nhiên, qui trình thu thập TBG từ tủy xương tương đối phức tạp và số lượng TBG thu được không nhiều, nhất là ở bệnh nhân gãy xương lâu liền do nguyên nhân bệnh lý của xương và tủy xương. Dây rốn trẻ sơ sinh là nguồn cung cấp TBG có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ thuật cũng như đạo đức. Dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm TBG tạo máu, TBG biểu mô, TBG trung mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton hay trong lớp 1 màng bao dây rốn. TBG dây rốn được thu thập ngay khi sinh và có thể bảo quản đông lạnh hay lưu giữ trong ngân hàng như một nguồn TBG dự trữ để sử dụng bất kỳ khi nào cho chủ nhân sinh học của mẫu tế bào. TBG trung mô từ dây rốn tương tự như các TBG trung mô ở tủy xương, do đó có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy xương [49,50,64]. Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa thành tế bào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổ gãy xương. Theo cách này, các TBG trung mô được phân lập, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitro thành các tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi có hình dạng giống tế bào tạo xương (gọi tắt là tế bào dạng tế bào tạo xương hay tế bào dạng tạo xương) bằng cách bổ sung các yếu tố kích thích biệt hóa và tạo xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, các vitamin và canxi. Đặc biệt, để điều trị các khuyết hổng xương lớn như mất đoạn xương, các tế bào tạo xương còn được nuôi trong các giá đỡ giá đỡ tế bào, tạo thành vật liệu thay thế xương (hay xương nhân tạo). Từ đây, khi cấy ghép, các tế bào tạo xương trong đoạn xương nhân tạo sẽ kết hợp với các tế bào khác từ tổ chức xương lân cận hình thành cấu trúc xương mới hàn gắn khuyết hổng xương [12,13,14]. Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương” với các mục tiêu sau: 1. Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn người làm vật liệu để biệt hóa tế bào. 2. Biệt hoá in vitro tế bào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trị tổn thương xương. 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Nghiên cứu áp dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh. 2. Nghiên cứu minh chứng kiểm định tế bào phân lập được từ màng dây rốn người theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô. 3. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in vitro (môi trường cơ bản, chất cảm ứng, thời gian ...). 4. Nghiên cứu một số biến đổi của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tế bào tạo xương. 5. Thử nghiệm cấy ghép tế bào dạng tạo xương thu được sau biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn người lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất. 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI Từ nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt hóa trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất. Đây là công trình lần đầu được nghiên cứu một cách hệ thống về quy trình thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương tại Việt Nam, mở ra một tiềm năng mới cho lĩnh vực y học tái sinh/tái tạo sử dụng công nghệ tế bào gốc. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 1.1.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài Nghiên cứu đầu tiên về TBG được thực hiện bởi Ernest A. McCulloch và James E. Till vào năm 1960. Theo các tác giả này thì TBG được chia thành hai nhóm: TBG phôi và TBG ở các mô của người trưởng thành. Năm 1981, Evans và Kaufman và Martin phân lập được TBG phôi từ phối tế bào bên trong của phôi túi (blastocyst) chuột nhắt [71]. Năm 1998, James Thomson và cộng sự ở đại học Wisconsin-Madison (Mỹ) đã thu nhận dòng TBG phôi người [71]. Năm 2001, Tìm ra một số phương pháp định hướng TBG biệt hóa in vitro tạo ra các mô có thể dùng cho ghép mô. Năm 2003, Tạo được noãn bào từ TBG phôi chuột. Điều này gợi ý rằng TBG phôi có thể có tính toàn năng, bằng thực nghiệm có thể làm một tế bào “trẻ lại”. Năm 2005, các nhà nghiên cứu ở Đại học Kingston (Anh) đã tuyên bố phát hiện trong máu cuống rốn một liên loại TBG giống TBG phôi, chúng được thu nhận và gọi là TBG giống TBG phôi phân lập từ máu cuống rốn (CBEs - Cord-blood-derived Embryoniclike stem cells) [43]. Nhóm nghiên cứu này cũng đã thành công khi thử nghiệm biệt hóa các TBG nói trên thành các tế bào có chức năng sinh lý trưởng thành. Tháng 7/2005, Phan Toàn Thắng tại Đại học Quốc gia Singapore đã phân lập được nguồn tế bào gốc mới từ dây rốn người. Các tế bào gốc này có khả năng ứng dụng cao trong điều trị. Tháng 8/2006, Kazutoshi Takahashi và Shinya Yamanaka đã tạo ra các TBG vạn năng cảm ứng iPS (induced pluripotent stem cells: Tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng). Tháng 10/2007, Mario Capecchi, Martin Evans và Oliver Smithies đã nhận giải thưởng Nobel y sinh học cho các thành tựu nghiên cứu về TBG phôi trên chuột tạo ra các cá thể con biến đổi di truyền mong muốn. Tháng 2/2008, nhóm nghiên cứu của nhà khoa học Baetge, của hãng Novocell (San Diego, Mỹ) đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc phôi người thành tế bào sản xuất insulin, các tế bào này đã được thử nghiệm điều trị tiểu đường trên mô hình chuột và đã có kết tốt. 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước Năm 1995, Bệnh viện Huyết Học-Truyền Máu Thành phố Hồ Chí Minh lần đầu sử dụng tuỷ xương (thực chất là liệu pháp tế bào gốc tạo máu) để ghép điều trị cho 1 bệnh nhân 27 tuổi bị bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) [25]. Tiếp đó, năm 1996 thực hiện ghép tế bào gốc máu ngoại vi tự thân để điều trị bệnh lý ác tính về máu. Năm 2002 bệnh viện này tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn để điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (ALL) [25]. Sau đó Viện Huyết học truyền máu Trung ương cũng bắt đầu tiến hành nghiên cứu ghép tuỷ xương để điều trị bệnh suy tuỷ, một số bệnh lý máu ác tính. Từ năm 2004, Trung tâm Huyết học và Truyền máu - Bệnh viện TW Huế cũng đã triển khai ghép tế bào gốc từ máu ngoại vi để điều trị bệnh Lơ-xe-mi cấp [17]. Tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, năm 2004 đã tiến hành các ca ghép tế bào máu từ máu tự thân cho các bệnh nhân ung thư máu. Năm 2007, Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 tiến hành ghép tế bào gốc từ tủy xương điều trị tổn thương xương khó lành hoặc khớp giả [13,14]. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh tiến hành các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn [22, 23]... Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên của Việt Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn. Hiện tại ở Việt Nam đang có một số ngân hàng tế bào gốc được thành lập. Đó là ngân hàng tế bào gốc MekoStem của Công ty cổ phần Mekophar; ngân hàng TBG của Viện Huyết học - Truyền máu thành phố Hồ Chí Minh. Viện bỏng quốc gia, Học viện Quân y trong nhiều năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt kết quả tốt. Viện bỏng quốc gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương, vết bỏng [1]. Năm 2012 cũng tại Học viện Quân y đã phân lập thành công tế bào gốc từ màng ối người [2]. Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu được triển khai ở các cơ sở nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc phôi gà cũng đã được tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và Thành phố Hồ Chí Minh. Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép tế bào gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các khuyết hổng mô và suy chức năng tế bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là con số lớn hơn. Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế. Đó là nguồn tế 6 bào gốc còn hạn chế (mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp dụng tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu quả cao. Tại nước ta, vết thương khuyết hổng xương do chấn thương hoặc do các bệnh lý khác nhau là vấn đề thường gặp trên lâm sàng. Hậu quả thường dẫn đến xương không liền, khớp giả và các dị tật ảnh hưởng lớn đến vận động của bệnh nhân. Để điều trị các tình trạng này đã có nhiều biện pháp điều trị khác nhau được tiến hành như ngoại khoa cố định xương, ghép xương tự thân hoặc ghép xương khác gen đồng loài (xương tươi, xương đông khô), ghép xương dị loài, ghép bột xương... Tuy nhiên các biện pháp này không giải quyết được triệt để và nhiều trường hợp vẫn để lại dị tật như chi ngắn chi dài. Gần đây Bệnh viện Việt Đức Hà Nội và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã tiến hành đề tài sử dụng ghép tuỷ xương tự thân (trong đó có các TBG) vào vết thương xương khó liền để điều trị, trong đó có các trường hợp khớp giả xương chày [13,14]. Song song với hướng ứng dụng lâm sàng đối với các TBG tự thân, các nghiên cứu biệt hoá TBG từ tuỷ xương, từ máu dây rốn thành tế bào xương cũng đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc của Trường Đại học KHTN, ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Các tác giả đã tạo ra được các tế bào tích tụ can-xi được hiển thị bằng các phương pháp nhuộm và kiểm tra các dấu ấn đặc hiệu. 1.1.3. Tế bào gốc Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau (hình 1.1) và có khả năng tự thay mới (SelfRenewal) [2,11,12,20,21,44,50,59]. Các tế bào này là các tế bào chưa biệt hóa (Unspecialized Cell) hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau nhưng chưa kết thúc quá trình biệt hóa (tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào ít tiềm năng, tế bào đơn tiềm năng), do vậy chúng có thể đi theo nhiều hướng khác nhau để tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau. 7 Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau của TBG tạo máu (nguồn: Terese Winslow). Tự thay mới là khả năng của các TBG tạo ra các tế bào giống hệt chúng về mức độ biệt hóa. Thông thường các tế bào phân chia theo kiểu đối xứng (Symetric): từ 1 tế bào tạo ra 2 tế bào giống hệt nhau; các TBG là các tế bào có khả năng phân chia không đối xứng (Asymetric): từ 1 tế bào tạo ra 2 tế bào không giống nhau (hình 1.2), 1 tế bào giống hệt tế bào ban đầu về mức độ biệt hóa, tế bào còn lại đã biệt hóa hơn sẽ tiếp tục phân chia như vậy để tạo thành các tế bào, cơ quan chuyên biệt. Khả năng tự thay mới và đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt chính là cơ sở cho những tiềm năng ứng dụng to lớn của công nghệ TBG. Hình 1.2: Các hình thức phân bào Nghiên cứu về TBG có thể cho ta thêm những hiểu biết về quá trình biệt hóa tế bào và sự phát triển của cơ thể người. Bản chất của quá trình biệt hóa là việc tắt các gen trong 8