Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (rice yellow stunt virus) ở miền bắc việt nam

  • Số trang: 74 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 69 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ LƯU THỊ THẢO NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (Rice yellow stunt virus) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số : 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI - 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan! Bản luận văn tốt nghiệp này ñược hoàn thành bằng sự nhận thức chính xác của bản thân. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lưu Thị Thảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Trân trọng cám ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình ñiều tra, tiến hành các thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Trân trọng cám ơn cán bộ Lãnh ñạo UBND và Trưởng ban khuyến nông, Trạm trưởng Trạm Bảo vệ thực vật huyện Ba Vì – Hà Nội, huyện Hiệp Hòa – Bắc Giang ñã hỗ trợ theo dõi, phối hợp ñánh giá tình hình diễn biến của bệnh vàng lụi trong quá trình thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 20 tháng 3 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Thảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục hình viii 1 ðẶT VẤN ðỀ i 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu 1 1.2 Mục ñích – yêu cầu 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam 4 2.2 Triệu chứng gây hại 6 2.3 Phân loại, hình thái và ñặc ñiểm bộ gen virus RYSV 7 2.4 Lan truyền của RYSV 10 2.5 Phương pháp chẩn ñoán virus bằng ELISA 11 2.5.1 Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng 11 2.5.2 Chế tạo kháng huyết thanh ña dòngñối với virus thực vật 12 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến nồng ñộ kháng thể 12 2.5.4 Các kỹ thuật ELISA 13 2.6 Chẩn ñoán virus RYSV bằng ELISA 14 3 ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nội dung nghiên cứu 15 3.2 ðịa ñiểm nghiên cứu chính 15 3.3 Vật liệu liệu nghiên cứu chính 15 3.3.1 Vật liệu thu thập mẫu cây và rầy 15 3.3.2 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn ñoán ELISA 15 3.3.3 Hóa chất, dung dịch ñệm, môi trường 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii 3.3.5 Các enzyme và kit thương mại 16 3.3.6 Các thiết bị chủ yếu 17 3.4 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1.Phương pháp ñiều tra bệnh ñồng ruộng 17 3.4.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu 17 3.4.3 Phương pháp bảo quản mẫu 18 3.4.4 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô lá 18 3.4.5 Phản ứng RT – PCR 19 3.4.6 ðiện di agarose 21 3.4.7 Dòng hóa và giải trình tự 21 3.4.8 Phân tích trình tự 22 3.4.9 Tinh chiết phân tử virus RYSV 22 3.4.10 Tạo kháng huyết thanh virus trên thỏ 23 3.4.11 Phương pháp ELISA 23 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 4.1 ðiều tra bệnh vàng lụi năm 2011 25 4.1.1 Triệu chứng bệnh vàng lụi tại các ñiểm ñiều tra 25 4.1.2 ðiều tra tình hình bệnh vụ xuân năm 2011 27 4.1.3 ðiều tra bệnh vụ mùa 2011 29 4.1.4 Phát hiện virus RYSV bằng RT-PCR trên các mẫu thu thập ngoài ñồng ruộng vụ xuân 2011 30 4.2 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu virus RYSV 33 4.2.1 Giới thiệu 33 4.2.2 Chuẩn bị nguồn vật liệu 33 4.2.3 Tinh chiết phân tử virus 34 4.2.4 Gây miễn dịch trên thỏ 35 4.2.5 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể virus 35 4.2.6 ðánh giá chất lượng của 2 nguồn kháng huyết thanh (huyết tương và 4.2.7 dịch trên tủa sau ly tâm máu ñông). 37 Kiểm tra nồng ñộ virus trong quá trình tinh chiết 40 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iv 4.2.8 ðánh giá ñộ hòa loãng của kháng huyết thanh 42 4.2.9 ðánh giá ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh 43 4.2.10 Kiểm tra nồng ñộ virus ở mẫu lá vàng và lá xanh trên cùng một cây bệnh. 44 4.2.11 ðánh giá về mẫu khô, mẫu tươi và mẫu nghiền, mẫu không nghiền 46 4.2.12 Kiểm tra nồng ñộ virus ở các bộ phận khác nhau của cây bệnh 47 4.2.13 Kiểm tra virus trong mẫu rầy xanh ñuôi ñen và một số loại cỏ tại Bắc Giang năm 2011 49 4.2.14.Ứng dụng ELISA kiểm tra virus RYYSV thu tại ở Hà Nội, Bắc Giang năm 2011 51 4.3 Xác ñịnh virus RYSV bằng giải trình tự 52 4.3.1 Nhân gen virus bằng RT-PCR 53 4.3.2 Dòng hóa sản phẩm RT-PCR 54 4.3.3 Kết quả giải trình tự 57 4.3.4 Kết quả tìm kiếm chuỗi tương ñồng trên ngân hàng gien 58 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 ðề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 62 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT RYSV : Rice yellow stunt virus Báo NNVN : Báo Nông nghiệp Việt Nam IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn TT BVTV : Trung tâm bảo vệ thực vật ðHNNHN : ðại học Nông nghiệp Hà Nội HTX : Hợp tác xã UBND : Ủy ban nhân dân DAS - ELISA : Double antibody sandwich - ELISA : National Center for Biotechnology Information : Polyacrylamide gel electrophoresis : Plate Trapped Entigen – ELISA NCBI PAGE PTA-ELISA OD CCSV Optical density Cynodon chlorotic streak virus Reverse Transcriptional – Polymerase Chain RT-PCR : KHT : Kháng huyết thanh CNSH : Công nghệ Sinh học Reaction Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vi DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 4.1 Bệnh vàng lá lúa vụ xuân năm 2011 tại một số tỉnh phía Bắc 27 4.2 Bệnh vàng lá lúa vụ mùa năm 2011 tại một số tỉnh phía Bắc 29 4.3 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân 2011 tại Hà- Nội. 31 4.4 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân năm 2011 tại Bắc Giang và Hòa Bình 32 4.5 Tóm tắt các bước tinh chiết phân tử virus RYSV từ mô lá lúa bệnh 35 4.6 ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh. 4.7 ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus RYYSV (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu ñông) 4.8 36 38 Kiểm tra ELISA hàm lượng virus RYSV trong các sản phẩm thu ñược trong quá trình tinh chiết phân tử virus 40 4.9 Xác ñịnh ñộ hòa loãng của kháng huyết thanh. 42 4.10 Xác ñịnh ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh 43 4.11 Thử nghiệm ELISA về nồng ñộ virus trên mẫu lá xanh và lá vàng trên cùng cây bệnh 45 4.12 ðánh giá về mẫu nghiền và mẫu không nghiền; mẫu khô và mẫu tươi 46 4.13 Kiểm tra nồng ñộ virus ở các bộ phận khác nhau ở cây bệnh 48 4.14 Kết quả kiểm tra RYSV trên mẫu rầy năm 2011 49 4.15 Kiểm tra ELISA một số loại cỏ thu thập ñược trong quá trình ñiều tra bệnh vàng lụi 50 4.16 Kết quả kiểm tra RYSV trên mẫu lúa vụ mùa 2011 51 4.17 RT-PCR nhân dòng 3 sản phẩm gen RYSV 54 4.18 Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn biến nạp 56 4.19 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng enzyme cắt giới hạn 57 4.20 Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR 57 4.21 Kết quả tìm kiếm trên ngân hang gen bằng phần mềm Blast 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Phân bố dịch bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam, 5 2.2. Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009) 8 2.3. Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata và Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985). 2.4. Sơ ñồ tổ chức bộ gen của RYSV ñược xây dựng dựa trên mẫu AB011257 bằng phần mềm NTI (hãng Invitrogen) 2.5. 9 10 Hìn thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV. Từ trái sang phải lần lượt là là N. nigropictus, N. cincticeps và N. virescens. 10 2.6. Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2000) 14 4.1. Một số triệu chứng ñiển hình của cây lúa bị bệnh vàng lá do RYSV tại miền Bắc vụ xuân 2011. 4.2. ðiều tra bệnh và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Hòa Sơn – Hiệp Hòa – Bắc Giang vụ xuân 2011 4.3. 31 Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa Bắc Giang vụ xuân 2011. 4.7. 30 Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa Hà Nội vụ xuân 2011. 4.6. 30 ðiều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Hòa Sơn – Hiệp Hòa – Bắc Giang vụ mùa năm 2011. 4.5. 28 ðiều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Phú Cường (Ba Vì – Hà Nội) vụ mùa năm 2011. 4.4. 27 33 Thu thập và bảo quản mẫu cây bệnh làm vật liệu tinh chiết virus RYSV Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 34 viii 4.8. ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh. 4.9. ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus RYYSV (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu ñông) 4.10 37 39 Kiểm tra ELISA ñánh giá hàm lượng virus ở các sản phẩm của quá trình tinh chiết. 41 4.11 ELISA ñánh giá ñộ hòa loãng của kháng huyết thanh 42 4.12. ELISA ñánh giá ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh 44 4.12. Elisa ñánh giá ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh và nồng ñộ virus trong mẫu lá xanh và lá vàng 4.13. 45 Kiểm tra ELISA ñánh giá mẫu tươi, mẫu khô; mẫu nghiền, không nghiền 47 4.14. Kiểm tra ELISA ñánh giá nồng ñộ virus ở các bộ phận của cây bệnh. 48 4.15. Elisa kiểm tra RYSV trên mẫu lúa vụ mùa 2011 52 4.16. Sơ ñồ bộ gen virus RYSV, vị trí các mồi và sản phẩm RT-PCR 53 4.17. RT-PCR dùng 2 tổ hợp mồi ñể nhân gen L và N của RYSV từ 2 mẫu lúa bệnh 1075 và 2011. M là thang DNA 1 kb (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb ñược chỉ bằng mũi tên. 4.18. Nuôi cấy các dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong môi trường LB lỏng chứa ampicillin 4.19 54 55 Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn biến nạp bằng cặp mồi Vector SeqFor và Vector SeqRev. M là thang DNA 100 bp (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb ñược chỉ bằng mũi tên. 4.20 56 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI. M là thang DNA 100 bp ( Fermentas) với 2 băng tham khảo ñược chỉ 4.21 bẳng mũi tên 57 Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần ñồ thị trình tự 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ix 1. ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng nhất ở các nước Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng. Khoảng 92% lúa gạo ñược sản xuất từ Châu Á. Việt Nam, trong nhưng năm gần ñây là một trong các quốc gia xuất khẩu gạo hàng ñầu của thế giới. Hiên nay, Việt Nam chỉ ñứng sau Thái Lan về xuất khẩu gạo, với lượng xuất khẩu khoảng 5 triệu tấn, chiếm 1/5 tổng lượng gạo xuất khẩu trên thế giới. Sản xuất lúa hiện ñang phải ñương ñầu với nhiều nguy cơ, ñặc biệt là sự tấn công của dịch hại, trong ñó có bệnh virus. Cho tới nay có hơn 15 virus gây bệnh cho lúa ñã ñược xác ñịnh, trong ñó có 12 virus ở Châu Á, 2 virus ở Châu phi, 1 virus ở Châu Âu và 1 virus ở Châu Mỹ (Hibino, 1996). Tại các nước Châu Á, bệnh virus hại lúa xảy ra ở nhiều vùng, từ năm này qua năm khác và gây thiệt hại hàng nghìn ha luá (Bos, 1992) Tại Việt Nam, bệnh vàng lùn do Rice grassy stunt virus (RGSV) và lùn xoắn lá do Rice ragged stunt virus (RRSV) ñã gây ra nhiều vụ dịch nghiêm trọng trên lúa tại miền Nam từ năm 2006. Gần ñây hơn, bệnh lùn sọc ñen so Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) ñã và ñang gây bệnh nghiêm trọng, ñặc biệt trên lúa mùa ở miền Bắc và miền Trung từ năm 2009 (Hà Viết Cường et al., 2009, Ngô Vĩnh Viễn et al., 2009). Tại Việt Nam, bệnh vàng lụi (còn gọi là bệnh vàng lá) xuất hiện ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ trước và ñược coi là dịch hại nguy hiểm nhất, ñược xác ñịnh do rầy xanh ñuôi ñen truyền, gây hại thành dịch tại nhiều tỉnh phía Bắc, ñặc biệt là các tỉnh miền núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006). ðến năm 19801981 bệnh xuất hiện trở lại và gây hại cục bộ trên các cánh ñồng Mường Thanh (ðiện Biên) và Phù Yên (Sơn La). Mặc dù vector truyền bệnh ñược biết là do rầy xanh ñuôi ñen nhưng virus gây bệnh vẫn chưa ñược nghiên cứu. Trong năm 2010, tại Bắc Giang, một bệnh trên lúa với triệu chứng vàng lá ñã xuất hiện và gây hại trên diện rộng. Các cây lúa bị bệnh sinh trưởng phát triển kém, lùn lụi. Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang, bệnh ñã xuất hiện từ năm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 1 2004 và diện tích nhiễm bệnh tới ~ 1000 ha năm 2009. Vụ mùa 2010 ở Bắc Giang, bệnh ñã xuất hiện ở 24/26 xã của huyện, trong ñó hai xã bị nặng nhất là Hòa Sơn và Thanh Sơn. Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tích bị bệnh của huyện là 108 ha, nhiều ruộng có tỷ lệ bệnh tới ~ 90 %. Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất hiện ở một số tỉnh như Hà Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An… Lúc ñầu bệnh ñã ñược cho là do các nguyên nhân sinh lý như ñất ñai, phân bón hoặc ngẹt rễ gây ra. Tuy nhiên, dựa vào ñánh giá triệu chứng, phân tích phân tử (PCR và giải trình tự), hiển vi ñiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang ñã ñược xác ñịnh chính xác là do virus Rice yellow stunt virus (RYSV) (Hà Viết Cường et al., 2010). Virus gây bệnh còn ñược biết với tên gọi là Rice yellow transitory virus (RYTV) ñã từng gây thành dịch nghiêm trọng tại tại nhiều tỉnh phía nam Nam Trung Quốc kể cả ðài Loan trong những năm 60 và 70 (Ou, 1985; Hibino, 1996). Do ñặc ñiểm giống nhau về triệu chứng, vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng lá Bắc Giang ñược ñề xuất là bệnh vàng lụi (Hà Viết Cường et al., 2010). Mặc dù tác nhân gây bệnh vàng lụi lúa tại Việt Nam ñã ñược xác ñịnh là do RYSV nhưng nhiều vấn ñề liên quan ñến virus ñều phải ñược nghiên cứu bao gồm: (i) bản thân virus (ñặc ñiểm hình thái, phân tử/di truyền, phân loại, chẩn ñoán…), (ii) các ñặc trưng sinh học (phạm vi ký chủ, quan hệ vector, tính chất gây bệnh, tính hướng mô, chức năng gen…), (iii) dịch tễ bệnh (ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố bệnh học là ký chủ - ñiều kiện ngoại cảnh - virus ñến sự phát triển bệnh trên qui mô quần thể) và (iv) phòng chống (các chiến lược và chiến thuật phòng trừ bệnh). Trong các nội dung nghiên cứu trên thì nghiên cứu chẩn ñoán chính xác bệnh là yêu cầu bức thiết vì triệu chứng ñiển hình của bệnh là bộ lá bị biến vàng, cây lùn nhưng lại có khả năng mất triệu chứng trong một số trường hợp dẫn tới bệnh rất dễ bị nhầm do các nguyên nhân khác. Xuất phát từ thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của TS. Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở miền Bắc Việt Nam” Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 2 1.2. Mục ñích – yêu cầu Mục ñích ðánh giá tình hình bệnh vàng lụi trên lúa năm 2011 tại một số ñịa ñiểm miền Bắc và phát triển kỹ thuật chẩn ñoán virus vàng lụi (RYSV) Yêu cầu • ðiều tra bệnh vàng lụi, kiểm tra virus bằng RT- PCR và ELISA. • Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu phân tử virus RYSV và ñánh giá các ñiều kiện ñể tối ưu hóa phản ứng ELISA. • Dòng hóa và giải trình tự một phần gen virus RYSV. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam Bệnh vàng lùn lúa (rice yellow stunt disease) ñược phát hiện ñầu tiên ở tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc) năm 1957 và ñược công bố chính thức năm 1965 (Fang et al. 1994). Cũng trong năm này, một bệnh trên lúa gọi là bệnh vàng tạm thời (rice transitory yellowing disease) ñã gây thành dịch ở ðài Loan (Chiu et al., 1965) và virus gây bệnh ñược gọi là RTSV (Rice transitory yellowing virus). Tại Việt Nam, bệnh “vàng tạm thời” tại ðài Loan ñã ñược dịch là bệnh “vàng lá di ñộng”. Tên bệnh “vàng tạm thời” và tên virus RTSV ñã xuất hiện trên nhiều tài liệu, chủ yếu do các tác giả Nhật Bản và ðài Loan, thậm chí ñể chỉ cả bệnh “vàng lùn” ở lục ñịa Trung Quốc (Shikita, 1972; Ou, 1985). Triệu chứng bệnh của 2 loại bệnh này trên cây lúa ñược mô tả giống nhau: lá lúa bị vàng, nhiều nhất là lá phía dưới, cây lúa còi cọc và giảm số nhánh ở các cây bị bệnh và làm giảm năng suất lúa. Bệnh “vàng lùn” hay bệnh “vàng tạm thời” ñã từng gây thành dịch tại nhiều tỉnh phía nam trong những năm 60 và 70 như ðài Loan (1960 – 1962, 1973 – 1980), các tỉnh phía nam sông Dương Tử như Quảng ðông (1964-1966, 1979), Phúc Kiến (1966, 1969, 1973), Chiết Giang (1970 – 1973) (Ou, 1985; Hibino, 1996). Tại Việt Nam, trong cùng thời gian, một bệnh biến vàng trên lúa gọi là bệnh “vàng lụi” do rầy xanh ñuôi ñen truyền ñã gây thành dịch ở miền Bắc, ñặc biệt tại các tỉnh miền núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006). Mặc dù mẫu bệnh vàng lụi của Việt Nam không ñược lưu giữ nhưng ñối chiếu bệnh “vàng lùn” hay “vàng tạm thời” của Trung Quốc và bệnh “vàng lụi” của Việt Nam thấy có nhiểu ñiểm giống nhau về (i) triệu chứng, (ii) vector và (iii) ñặc biệt là sự xuất hiện các vụ dịch trong cùng thời gian, tại các khu vực gần gũi về mặt ñịa lý. Rất có thể, bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam chính là bệnh “vàng lùn” hay “vàng tạm thời” tại Trung Quốc (Hà Viết Cường et al., 2010) (Hình 2.1). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 4 Hình 2.1. Phân bố dịch bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam, bệnh “vàng lùn” tại phía Nam Trung Quốc và “vàng tạm thời” tại ðài Loan (các hình tam giác ñỏ) trong những năm 60, 70 (Hà Viết Cường, Báo cáo hội thảo quốc gia Bệnh cây năm 2011 tổ chức tại ðH Nông nghiệp Hà Nội) Tại Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật ñã có nhiều nghiên cứu về bệnh vàng lụi trong những năm 1980-1981, mẫu bệnh ñược chụp trên kính hiển vi ñiện tử tại Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội và ñã kết luận bệnh vàng lụi xuất hiện ở các tỉnh miền núi phía Bắc giống như bệnh vàng lá di ñộng gây hại ở ðài Loan (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006). Gần ñây, tại Bắc Giang, một bệnh với triệu chứng vàng lá ñã xuất hiện và gây hại trên diện rộng. Các cây lúa bị bệnh sinh trưởng phát triển kém, lùn lụi. Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang, bệnh ñã xuất hiện từ năm 2004 nhưng vì là bệnh mới, không xác ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh nên không thống kê diện tích nhiễm. Các năm tiếp theo, Chi cục ñã thống kê mức ñộ gây hại của bệnh như sau: • Năm 2005:diện tích nhiễm (DTN) 60 ha ở Hiệp Hòa. • Năm 2006: Bệnh phát sinh rộng, chủ yếu ở Hiệp Hòa, DTN 200 ha với tỷ lệ bệnh trung bình 10-20%, diện tích nhiễm nặng 30 ha với tỷ lệ bênh 50-60%. Huyện tổ chức phòng trừ trên diện tích 100 ha, áp dụng các biện pháp như ñối với bệnh sinh lý nhưng không có kết quả. • Năm 2007: DTN 13 ha ở Hiệp Hòa, Lạng Giang. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 5 • Năm 2008: DTN > 1 ha ở Hiệp Hòa. • Năm 2009: DTN lên tới 914,5 ha, mất trắng > 4,5 ha, xuất hiện ở hầu hết các huyện, riêng Hiệp Hòa 600 ha. Các biện pháp phòng chống bệnh như ñối với bệnh sinh lý ñã ñược áp dụng trên diện tích 605 ha nhưng không có kết quả. • Vù mùa 2010, bệnh cũng xuất hiện trên diện rộng, ñặc biệt tại huyện Hiệp Hòa. Tại Hiệp Hòa, bệnh ñã xuất hiện ở 24/26 xã của huyện, trong ñó hai xã bị nặng nhất là Hòa Sơn và Thanh Sơn. Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tích bị bệnh của huyện là 108 ha, nhiều ruộng có tỷ lệ bệnh tới ~ 90 %. Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất hiện ở một số tỉnh như Hà Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An. Lúc ñầu bệnh ñã ñược cho là do các nguyên nhân sinh lý như ñất ñai, phân bón hoặc ngẹt rễ gây ra. Tuy nhiên, dựa vào ñánh giá triệu chứng, phân tích phân tử (PCR và giải trình tự), hiển vi ñiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang ñã ñược xác ñịnh chính xác là do virus RYSV (Rice yellow stunt virus). Do ñặc ñiểm giống nhau về triệu chứng và vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng lá Bắc Giang ñược ñề xuất là bệnh vàng lụi (Hà Viết Cường et al., 2010). 2.2. Triệu chứng gây hại Về triệu chứng, bệnh biến vàng tạm thời ở luá ñã ñược Ou (1985) mô tả như sau: (i) Triệu chứng ñiển hình là bộ lá biến vàng, cây lùn, ñẻ nhánh giảm. Hai ñến ba tuần sau cấy, một cây bệnh ñiển hình có 1-2 lá phía dưới bị biến vàng, sau chuyển thành vàng sáng hoặc vàng cam tối, cuối cùng các lá vàng này trở nên nhăn héo. Lá biến vàng thường bắt ñầu từ ñỉnh lá và trên cây thì các lá phía dưới biến vàng trước sau ñó mới lan lên các lá phía trên. Trên các lá biến vàng, có thể xuất hiện các chấm nhỏ màu nâu ñỏ (màu gỉ sắt). (ii) Trên giống mẫn cảm, cây bị lùn, giảm mạnh khả năng ñẻ nhánh, trỗ kém hoặc không trỗ. Cây nhiễm sớm có thể biểu hiện triệu chứng rõ rệt nhưng cây nhiễm muộn có thể không biểu hiện triệu chứng. Trường hợp nặng, cây có thể chết trước khi trỗ. (iii) Bệnh ñược gọi là “vàng tạm thời” vì cây bệnh, ñặc biệt trong ñiều kiện nhà kính, sau khi biểu hiện triệu chứng vàng lá ñiển hình, có thể phục hồi, thậm chí không biểu hiện triệu chứng. Nhiều khi, các dảnh trông bình thường hình thành từ một cây bệnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 6 2.3. Phân loại, hình thái và ñặc ñiểm bộ gen virus RYSV Phân loại RYSV hay RTYV là thành viên của chi Nucleorhabdovirus, họ Rhabdoviridae, bộ Mononegavirales (Walker et al., 2000). Tổng số loài virus thuộc họ Rhabdovirus ñược công nhận bởi ICTV cho tới năm 2009 là 51. Các rhabdovirus ñược phân loại chính thức vào 6 chi và một số chưa phân loại ñến chi. “Rhabdo” có nguồn gốc từ từ Hy Lạp “rhabdos” có nghĩa là “hình gậy” ám chỉ phân tử virus có hình nhộng (gậy ngắn). Các rhabdovirus gây hại thực vật chỉ thuộc 2 chi Nucleorhabdovirus và Cytorhabdovirus, còn lại là các virus ñộng vật. Trong số các rhabdovirus hại ñộng vật, Rabies virus (gây bệnh dại) là nguy hiểm nhất. Trong số các rhabdovirus hại thực vật, RYSV gây bệnh vàng lụi lúa là virus quan trọng nhất (Hà Viết Cường, 2010 b) Hình thái phân tử virus (virion) và tổ chức bộ gen Các rhabdovirus là các virus có bộ gen RNA, sợi ñơn, không phân mảnh, cực âm, kích thước 11-15 kb, chiếm khoảng 1-2% khối lượng phân tử virus. Bộ gen virus chứa ít nhất 5 khung ñọc mở (open reading frame, ORF) không liên tục theo chiều từ ñầu 3' - 5' (chú ý RNA của virus là cực âm) theo thứ tự sau: 3'- N- P- M-GL-5'. Các ORF ñược phiên mã thành mRNA và dich mã ñộc lập thành các protein cấu trúc sau: • N: protein nucleoprotein. Bên trong tế bào, N ñóng vai trò cân bằng giữa quá trình phiên mã các gen virus và tái sinh bộ gen virus do tác ñộng ñến sự nhận biết các dấu hiệu phiên mã. • L: protein lớn (large protein). L là một RdRp. • M : protein tạo protein nền (matrix protein). M còn ñược kí hiệu là M1, M ñóng vai trò ñiều khiển quá trình phiên mã của virus, ức chế phiên mã của kí chủ, ảnh hưởng tới sự gây bệnh. • P : protein ñược phosphryl hóa (phosphorylated protein). P còn ñược ký hiệu là M2. P là một cofactor của protein L và do ñó cần thiết cho quá trình tái sinh của virus. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 7 • G : protien ñược glycosyl hóa (glycosylated protein).G lắp ráp thành trimer ñể tạo thành gai vỏ. Có chức năng quan trọng trong xâm nhập tế bào, tương tắc với vector. Ngoài ra, ở ñầu 3' và 5' của bộ gen virus có lần lượt 2 chuỗi leader và trailer. Các rhabdovirus nhìn chung có cấu trúc phân tử phức tạp, thuộc nhóm có vỏ bọc. Phần lớn các rhabdovirus có hình con nhộng nhưng một số có hình viên ñạn (hình nhộng nhưng với một ñầu phẳng hơn). Các rhabdovirus có kích thước khá lớn, dài 100 – 430 nm và ñường kính 40-100nm. Về cấu trúc chi tiết, các phân tử protein N liên kết chắt với phân tử RNA genome theo kiểu ñối xứng xoắn ñể tạo thành phân tử ribonucleoprotein (RNP). Phân tử RNP lại liên kết với protein L và P ñể tạo thành phức hợp nucleocapsid. Phức hợp này ngập trong một lớp protein nền ñược cấu tạo bởi protein M. Toàn bộ cấu trúc trên lại ñược bao bọc bởi một lớp màng kép lypid chứa các gai vỏ nhô lên bề mặt và ñược cấu tạo bởi các protein G (glycoprotein). Mỗi một gai vỏ là một trimer gồm 3 phân tử protein G lắp ráp thành (Hình 2.2). Hình 2.2. Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009) ðặc ñiểm hình thái của RYSV ñã ñược Shikata và Chen công bố lần ñầu tiên vào năm 1969. Các quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử dung lát cắt siêu mỏng mô lá lúa cho thấy RYSV có hình ñầu ñạn ñặc, có vỏ bọc, kích thước 94 nm x 180 - 210 nm. Trong tế bào, các phân tử RYSV hình thành nhiều tại phần ngoại vi của nhân tế bào (Shikata & Chen, 1969; Fang et al., 1994; Ou, 1985) (Hình 2.3). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 8 Hình 2.3. Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata và Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985). Bộ gen ñầy ñủ của RYSV ñược công bố ñầu tiên vào năm 2003 từ nguồn virus phân lập tại Trung Quốc (Huang et al., 2003). Tiếp theo, năm 2010, trình tự toàn bộ bộ gen của một mẫu RTYV từ Nhật Bản cũng ñược công bố (Hiraguri et al., 2010). So sánh trình tự của mẫu RTSV này với mẫu RYSV thấy chúng ñồng nhất tới 98,5 % trên toàn bộ gen và trình tự amino acid của 7 protein của virus RYSV và RTYV giống nhau trong phạm vi từ 82,3 ñến 99,7% (Hiraguri et al., 2010). Dựa trên kết quả so sánh này, Hiraguri et al. (2009) ñã kết luận RTYV và RYSV là thành viên của cùng một loài và các tác giả ñã gửi mẫu RTSV lên Ngân hàng gen với tên RYSV. Theo luật ưu tiên, Ủy ban phân loại và danh pháp virus quốc tế (ICTV) ñã phê chuẩn tên virus ñại diện cho loài này là RYSV. RYSV có tổ chức bộ gen giống như của các rhabdovirus khác. Tổ chức bộ gen ñầy ñủ của mẫu RYSV (mã truy cập AB011257, Huang et al., 2003) cho thấy virus có có bộ gen RNA mạch thẳng, sợi ñơn, cực âm, kích thước khoảng 14 kb. Virus có một chuỗi nucleotide khoảng 203 nucleotide gọi là leader ở ñầu 3’, một chuỗi 181 nucleotide gọi là trailer ở ñầu 5’. Virus mã hóa 7 protein, theo thứ tự từ trái sang phải là N-P-3-M- G-6-L. Tuy nhiên chỉ có 5 protein cấu trúc có mặt ở phân tử virus là N, P, M, G, L (Fang et al., 1994; Luo và Fang, 1998; Huang et al., 2003). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 9 Leader N P 3 M G 6 L 3’ Trailer 5’ RYSV -AB011257, kích thước 14042 nucleotides Hình 2.4. Sơ ñồ tổ chức bộ gen của RYSV ñược xây dựng dựa trên mẫu AB011257 bằng phần mềm NTI (hãng Invitrogen) 2.4. Lan truyền của RYSV Virus RYSV thuộc nhóm gây hại ở bó mạch phloem như các loại virus khác của chi nucleorhabdovirus (Nault và Ammar, 1989). Các nghiên cứu lan truyền cho thấy RYSV (hay RTYV) ñược truyền theo kiểu bền vững tái sinh (virus nhân lên trong vector) nhưng không truyền qua trứng (Chiu et al., 1965; 1968; Shieh et al., 1970; Chen và Shikata, 1971). Ba loài rầy xanh ñã ñược ghi nhận truyền RYSV (hay RTYV) là N. nigropictus, N. cincticeps và N. virescens (Hình 2.5), trong ñó hiệu quả truyền bệnh cao nhất là của N. Nigropictus, tiếp theo là N. cincticeps và thấp nhất là N. virescens ; nhìn chung ñối với rầy N. nigropictus, hiệu quả truyền của rầy ñực cao hơn rầy cái, còn ñối với 2 loại rầy còn lại thì không có sự khác biệt ñáng kể (Inoue, 1978). Hình 2.5. Hìn thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV. Từ trái sang phải lần lượt là là N. nigropictus, N. cincticeps và N. virescens. Chiu et al. (1965), Chiu & Jane (1967) khi nghiên cứu 3 loài rầy này ñã cho biết khoảng 41- 62% cá thể rầy có khả năng truyền virus. Thời gian chích nạp của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 10
- Xem thêm -