Tài liệu Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép cyprinus carpio trong nitơ lỏng

i MỤC LỤC MỤC LỤC ...................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT .............................................. vi TÓM TẮT .................................................................................................... vii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép ................................................................. 3 1.1.1. Hệ thống phân loại .................................................................................. 3 1.1.2. Phân bố ................................................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3 1.1.4. Đặc điểm sinh thái .................................................................................. 4 1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản .......................................... 4 1.2. Đại cƣơng về tinh trùng ................................................................................. 4 1.2.1. Quá trình tạo tinh trùng .......................................................................... 4 1.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh .............................................................................. 4 1.2.1.2. Giai đoạn sinh trưởng .......................................................................... 5 1.2.1.3. Giai đoạn thành thục ............................................................................ 5 1.2.2. Cấu tạo tinh trùng ................................................................................... 5 1.2.2.1. Phần đầu .............................................................................................. 6 1.2.2.2. Phần cổ ................................................................................................ 6 1.2.2.3. Phần đuôi ............................................................................................. 6 1.2.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng ............................................................ 6 1.2.3.1. Kích thước và số lượng......................................................................... 6 1.2.3.2. Đặc điểm vận động............................................................................... 7 1.3. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ................................................... 13 ii 1.3.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới ......................... 13 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam .......................... 16 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 18 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu ............................................... 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 18 2.2.1. Cá đực và vuốt tinh ............................................................................... 19 2.2.1.1. Cá đực................................................................................................ 19 2.2.1.2. Vuốt tinh............................................................................................. 19 2.2.2. Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh dịch cá ................................................. 19 2.2.2.1. Màu sắc tinh dịch ............................................................................... 19 2.2.2.2. Thể tích tinh dịch................................................................................ 19 2.2.2.3. Kiểm tra hoạt lực tinh trùng ............................................................... 20 2.2.2.4. Kiểm tra mật độ tinh trùng ................................................................. 21 2.2.3. Bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng ......................................... 22 2.2.4. Ảnh hưởng của chất bảo quản và chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh................................................................................................. 22 2.2.5. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh ................ 24 2.2.6. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh ............... 25 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 26 3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh.............................. 26 3.2. Ảnh hƣởng của chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh.......................... 27 3.3. Ảnh hƣởng của quy trình làm lạnh đến kết quả bảo quản tinh ...................... 29 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh ...................... 30 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.......................................... 32 4.1. Kết luận....................................................................................................... 32 4.1.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh ...................... 32 4.1.2. Ảnh hưởng của chất chống đông lên bảo quản tinh ............................... 32 4.1.3. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh ................ 32 4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên chất lượng tinh bảo quản .......... 32 iii 4.2. Đề xuất ý kiến ............................................................................................. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 34 iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Chiều dài, khối lƣợng, thể tích tinh dịch, màu sắc tinh dịch của cá chép đƣa vào thí nghiệm……………………………………………….... 20 Bảng 2.2. Hoạt lực ban đầu của tinh trùng……………………………….… 21 Bảng 2.3. Mật độ trung bình tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm (*109 tb/ml)... 22 Bảng 2.4. Thành phần các ion trong dịch tƣơng của một số loài cá [56]..…. 23 Bảng 2.5. Thành phần các chất bảo quản đƣợc sử dụng cho nghiên cứu…... 24 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình dạng ngoài cá chép [57]……... ……………………….…… 3 Hình 1.2. Cấu tạo tinh trùng [44]…………………………………………… 5 Hình 2.1. Quy trình nội dung nghiên cứu ………………………………….. 18 Hình 2.2. Các quy trình làm lạnh sử dụng cho thí nghiệm.…..…………….. 25 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh………… 26 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của các chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh…. 27 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh.. 29 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh…… 30 vi DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CCSE: Common carp sperm chất bảo quản. DMSO: Dimethyl sunfoxide. MET: Methanol. GLY: Glycerol. Đv: Đơn vị. GTTB: Giá trị trung bình. HL: Hoạt lực. TGHL: Thời gian hoạt lực. s: Giây. V: Thể tích. SD: Độ lệch chuẩn. tb: Tế bào. TGHL: Thời gian hoạt lực. tt: Tinh trùng. ctv: Cộng tác viên. TTTD: Thể tích tinh dịch. MSTD: Màu sắc tinh dịch. TT: Thứ tự. vii TÓM TẮT Bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng là phương pháp đã và đang được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều quốc gia bởi vì lợi ích của chúng trong công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gen. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, chất chống đông, quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng. Về thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất: tinh trùng được pha loãng trong các chất bảo quản (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 hoặc CCSE-4 và bổ sung 10% DMSO như là chất chống đông ở tỉ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Về thí nghiệm tìm ra chất chống đông tốt nhất: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung các chất chống đông như là DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol, và Methanol ở nồng độ là 10% với tỷ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Thí nghiệm về chất bảo quản và chất chống đông được bảo quản theo qui trình: hơi nitơ lỏng -76oC khoảng 6 phút và sau đó cho thẳng xuống nitơ lỏng -196oC. Thí nghiệm về quy trình làm lạnh: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung DMSO ở nồng độ 10% như là chất chống đông, sau đó tiến hành bảo quản theo ba quy trình: (1) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -20◦C trong 3 phút rồi chuyển xuống -76◦C trong 3 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (2) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -76◦C trong 6 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (3) đưa thẳng các cọng rạ vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất bảo quản CCSE-2, chất chống đông là DMSO ở nồng độ 10%, và quy trình làm lạnh (2) cho kết quả tốt nhất. Kết quả thí nghiệm này góp phần cung cấp thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng. Từ khóa: Cá chép, Cyprinus carpio, chất bảo quản, chất chống đông 1 MỞ ĐẦU Bảo quản tinh có vai trò quan trọng trong các chƣơng trình chọn giống và các chƣơng trình bảo tồn nguồn gen của vật nuôi. Bảo quản tinh sẽ góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di truyền phân tử áp dụng trong các chƣơng trình chọn giống. Nhờ bảo quản tinh có thể chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trƣờng hợp có hiện tƣợng lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực và cái. Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác. Ngoài ra, bảo quản tinh còn hạn chế tối đa việc lƣu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lƣợng di truyền do lai cận huyết [6]. Hiện nay, bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là phƣơng pháp đơn giản nhất của việc lƣu trữ tinh trùng cá trong thời gian dài. Từ các dữ liệu của Ashwood-Smith [13], Whittingham [52] và Stoss and Holtz [46] đã ƣớc tính thời gian lƣu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng là từ 200 đến 32.000 năm. Thành công của việc bảo quản lạnh tinh trùng từ các loài cá biển đến các loài cá nƣớc ngọt, Cloud và Patton [21] chứng minh rằng bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là một phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để bảo quản tinh trùng của nhiều loài cá. Cá Chép (Cyprinus carpio) là một trong những loài có giá trị kinh tế quan trọng đƣợc nuôi ở khắp châu Á và châu Âu. Sản lƣợng cá đƣợc nuôi toàn cầu chiếm khoảng 6,14% (3.172.488 tấn) tổng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới [22]. Ở Việt Nam, cá Chép là đối tƣợng nuôi có giá trị thƣơng phẩm, thịt thơm ngon và đƣợc nuôi khá phổ biến [8]. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh cá Chép Cyprinus carpio đƣợc công bố rộng rãi với nhiều phƣơng pháp bảo quản khác nhau. Tuy nhiên, hiện nay do quá trình di nhập cá Chép giữa các vùng trên cả nƣớc và di nhập cá Chép từ nƣớc ngoài dẫn tới quá trình lai tạp xảy ra nhiều làm cho biến đổi nguồn gen, nên việc lƣu trữ và bảo tồn giống thuần phục vụ công tác lai tạo, chọn giống là yêu cầu đặt ra của ngành thủy sản. Bên cạnh đó, do đặc điểm sinh lý, hóa của mỗi loài cá khác nhau nên việc tìm ra quy trình bảo quản tinh thích hợp cho từng loài cá trong điều kiện cụ thể là rất cần thiết [39]. 2 Và để góp phần cung cấp thêm thông tin về kỹ thuật bảo quản tinh cho các đối tƣợng thủy sản, đề tài: “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng” đƣợc thực hiện. Đề tài thực hiện gồm những nội dung chính sau đây: - Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của chất chống đông lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của quy trình bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản trong nitơ lỏng lên hoạt lực tinh trùng. Mục tiêu chính của đề tài là: - Tìm ra một số dung dịch bảo quản và chất chống đông phù hợp với việc bảo quản tinh trùng cá Chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam. - Góp phần bổ sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại Việt Nam. - Lƣu trữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ cho công tác lai tạo. Do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình viết báo cáo không thể tránh thiếu sót. Kính mong nhận đƣợc góp ý từ thầy, cô và các bạn để đồ án đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thu Hiền 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép 1.1.1. Hệ thống phân loại Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Cypriniformes Họ: Cyprinidae Giống: Cyprinus Loài: C. carpio Tên tiếng anh: Common carp. Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chép [57]. 1.1.2. Phân bố Trên thế giới: Cá chép (Cyprinus carpio) phân bố rộng khắp các vùng trên toàn thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc [8]. Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Cá có nhiều dạng hình nhƣ: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép đỏ, chép lƣng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v... [8]. 1.1.3. Đặc điểm hình thái Thân cá hình thoi, mình dây, dẹp bên. Viền lƣng cong, thuôn hơn viền bụng. Đầu cá thuôn, cân đối. Mõm tù, lƣng xanh đen, hai bên thân phía dƣới đƣờng bên vàng xám, bụng trắng bạc. Gốc vây lƣng và vây đuôi hơi đen. Vây đuôi và vây hậu môn đỏ da cam [8]. 4 1.1.4. Đặc điểm sinh thái Cá chép sống ở tầng đáy cá vực nƣớc, nơi có nhiều mùn bã hữu cơ, thức ăn đáy và cỏ nƣớc. Cá có thể sống đƣợc trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt, chịu đựng đƣợc nhiệt độ từ 0-40oC, thích hợp ở 20-27oC [8]. 1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản Thức ăn của cá khá đa dạng nhƣ mảnh vụn thực vật, rễ cây, các loài giáp xác (Copeporda, Decaporda, Gatstropoda), ấu trùng muỗi, ấu trùng côn trùng, thân mềm. Tuỳ theo kích cỡ cá và mùa vụ dinh dƣỡng mà thành phần thức ăn có sự thay đổi nhất định. Ngoài thức ăn tự nhiên có trong thuỷ vực thì cá còn ăn thức ăn nhân tạo nhƣ cám nổi [8]. Cá chép là loài có kích cỡ trung bình, lớn nhất có thể đạt tới 15-20kg. Tốc độ tăng trƣởng giảm dần theo chiều dài nhƣng lại tăng dần theo trọng lƣợng [8]. Cá chép thành thục ở 1+ tuổi. Sức sinh sản của cá lớn, khoảng 150.000-200.000 trứng/kg cá cái. Mùa vụ sinh sản kéo dài từ mùa xuân đến mùa thu nhƣng tập trung nhất vào các tháng xuân-hè khoảng tháng 3-6 và mùa thu khoảng tháng 8-9. Trứng cá chép ở dạng dính.Trứng cá sau khi đẻ bám vào thực vật thuỷ sinh. Ở các sông cá thƣờng di cƣ vào các bãi ven sông, vùng nhiều cỏ nƣớc. Cá thƣờng đẻ nhiều vào ban đêm, nhất là từ nửa đêm đến lúc mặt trời mọc hoặc đẻ nhiều sau các cơn mƣa rào, nƣớc mát [8]. 1.2. Đại cƣơng về tinh trùng 1.2.1. Quá trình tạo tinh trùng Tinh trùng trƣớc khi thành thục trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau cuối cùng mới phân hóa cao độ hình thành tế bào sinh dục đực hoàn thiện có năng lực thụ tinh. Quá trình tạo tinh trùng của cá diễn ra trong tinh sào [5], bắt đầu từ tế bào sinh dục nguyên thủy và trải qua các giai đoạn sau: 1.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh Từ tế bào sinh dục nguyên thủy phân chia nguyên nhiễm nhiều lần tạo thành các tinh nguyên bào. Tinh nguyên bào có một nhân to, chất nguyên sinh trong nhân phân bố đều. Đƣờng kính của tinh nguyên bào dao động từ 9-16 µm [1]. 5 1.2.1.2. Giai đoạn sinh trưởng Ở giai đoạn này, chất dinh dƣỡng do tinh nguyên bào hấp thụ đƣợc đồng hóa và chuyển thành nguyên sinh chất của tế bào. Do đó tế bào sinh trƣởng mãnh liệt, thể tích tăng lên và hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào cấp 1). Nguyên sinh chất trong nhân tế bào từ dạng hạt đã biến thành thể nhiễm sắc sợi mảnh hoặc thô chuẩn bị cho giai đoạn phân chia tiếp theo. 1.2.1.3. Giai đoạn thành thục Tinh bào sơ cấp trải qua 2 lần phân chia liên tục: - Lần 1: Từ 1 tinh nguyên bào sơ cấp phân chia giảm nhiễm hình thành 2 tế bào thứ cấp. Số lƣợng nhiễm sắc thể trong nhân giảm đi một nửa (thể đơn bội kép). - Lần 2: Tinh bào thứ cấp phân chia nguyên nhiễm tạo nên 2 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n. Nhƣ vậy, từ 1 tế bào sinh dục nguyên thủy sẽ tạo thành 4 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n. Tinh tử trải qua các quá trình biến thái đặc biệt để hình thành nên tinh trùng. 1.2.2. Cấu tạo tinh trùng Tinh trùng của các lớp động vật khác nhau thì khác nhau khá nhiều về hình thái, tuy nhiên tất cả đều có nét chung về hình thái có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1]. Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần cổ và phần đuôi. Hình 1.2. Cấu tạo tinh trùng [44]. 6 1.2.2.1. Phần đầu Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất di truyền vào trong trứng. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xƣơng đầu tinh trùng có cấu tạo đơn giản gần nhƣ hình tròn [1]. Đầu tinh trùng thƣờng rất to so với các phần khác. Trên cùng của đầu là thể đỉnh. Thể đỉnh có hình nhƣ chiếc mũ trùm xuống phía dƣới, trong nó chứa enzyme Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đƣờng cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh. Thể đỉnh do bộ máy Golgii tạo thành. Nhân tinh trùng nằm dƣới thể đỉnh, rất to và đơn độc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực. Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất khá mỏng [3]. 1.2.2.2. Phần cổ Phần cổ tƣơng đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng. Trong cổ chứa trung tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau. Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng. Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng đã đƣợc thụ tinh [3]. 1.2.2.3. Phần đuôi Đuôi tinh trùng cá là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài. Phần đầu của đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể. Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa và enzyme oxy phosphorine hóa do vậy nó có liên quan đến quá trình chuyển hóa năng lƣợng của tinh trùng. Phần cuối của đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở giữa và 9 đôi ở ngoại vi. Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động gặp trứng và tham gia vào quá trình thụ tinh. Sự di chuyển đƣợc thực hiện bằng cách chuyển động co duỗi lƣợn sóng và chuyển động đập của đuôi [3]. 1.2.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng 1.2.3.1. Kích thước và số lượng Kích thƣớc của tinh trùng thƣờng rất bé so với tế bào trứng của cùng 1 loài. Ví dụ: Hầu 75µm, tôm He 10µm, cá Rô 20 µm,….. [1]. 7 Ngƣợc lại với kích thƣớc tinh trùng có số lƣợng vô cùng lớn. Ví dụ: 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [3]. 1.2.3.2. Đặc điểm vận động a. Hoạt lực của tinh trùng Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động nhƣng khi rơi vào nƣớc nó vận động mạnh [1]. Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của nó và điều kiện môi trƣờng mà nó đang sống. Sự chuyển động và thời gian vận động của tinh trùng có thể giúp đánh giá đƣợc chất lƣợng tinh trùng. Persov (1941) (dẫn theo Trịnh Thị Nguyên [6]) đã đề nghị một bảng để đánh giá mức độ (5 mức: Mức 5:Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thƣờng thấy chỉ có một số ít tinh trùng dao động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, đã có một số tinh trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao động, 3 4 số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động) chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào môi trƣờng kích hoạt. b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng gồm: - Nhiệt độ: Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ hoạt động của tinh trùng tăng khi nhiệt độ tăng nhƣng thời gian sống của tinh trùng sẽ ngắn lại, vì nhiệt độ tăng làm tăng nhanh quá trình oxy hóa vật chất trong tinh trùng và sự tiêu hao năng lƣợng tăng lên. Tuy nhiên nếu nhiệt độ vƣợt quá giới hạn cho phép của phạm vi thích hợp thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng vận động và chết. Ở nhiệt độ thấp sự vận động của tinh trùng bị ức chế và tăng thời gian sống của tinh trùng. Tinh trùng có thể duy trì khả năng thụ tinh của mình khá lâu nếu đƣợc giữ ở nhiệt độ thấp 0-4oC [1]. Đây là cơ sở khoa học của việc bảo quản lạnh tinh trùng ở nhiệt độ thấp. Ví dụ: Tinh trùng cá chép bảo quản ở nhiệt độ 0-2ºC thì sống đƣợc 8 ngày. 8 - Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng: Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng cũng ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng. Đối với cá nƣớc ngọt, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng tƣơng đƣơng với dung dịch nƣớc muối NaCl 0,5% . Đối với cá biển, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tƣơng đƣơng với dung dịch nƣớc muối NaCl 0,75% [11]. - Ion kim loại: Tinh trùng nhạy cảm với ion kim loại hóa trị 2 và 3 hoặc acid, sự có mặt của các ion này làm cho tinh trùng kết vào nhau. Ở môi trƣờng kiềm hóa tinh trùng hoạt động tích cực hơn nhƣng mau chóng hết năng lƣợng và chóng chết [1]. - Độ pH của môi trƣờng cũng có liên quan đến sự vận động của tinh trùng: tinh trùng cá Hồi vận động tốt nhất khi pH=8,3 [11]. - Tuổi thọ của tinh trùng còn phụ thuộc vào chất lƣợng thành thục của cá. - Ảnh hƣởng của việc bảo quản lạnh tinh trùng: Quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cũng góp phần vào làm giảm chất lƣợng tinh trùng sau khi bảo quản. Một số nghiên cứu này cũng đã đƣợc nhiều tác giả công bố [19, 47]. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng bao gồm: Kỹ thuật chọn cá bố mẹ: Đây là khâu đầu tiên quan trọng vì chất lƣợng tinh trùng của cá đực có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục của nó và điều kiện đang sống. Khả năng vận động của tinh trùng chƣa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với thành thục vừa. Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Thao tác thu mẫu tinh: Trƣớc khi thu mẫu, dụng cụ cần đƣợc khử trùng và để nơi thoáng mát, cá bố mẹ phải đƣợc kiểm tra lại. Trƣớc khi thu mẫu nên lâu khô phần dọc theo bụng cá. Khi thu mẫu phải hết sức cẩn thận và nhẹ nhàng, tránh không để phân cá, máu chảy vào tinh dịch, nếu không tinh trùng dễ bị kích hoạt dẫn đến thời gian cất giữ ngắn. Nên lấy tinh dịch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát để tinh dịch không bị biến đổi, không nên lấy tinh dƣới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thƣơng. 9 Những ống đựng tinh dịch nên đƣợc để trên khay đá khô, không nên nắm trong tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tuổi thọ tinh trùng. Tinh dịch thu xong nên đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra và xử lý mẫu. Tinh dịch nên đƣợc vận chuyển ở nhiệt độ 0-4oC. Chất bảo quản: Chất bảo quản (chất bảo quản) là một dung dịch muối, có tác dụng làm tăng dung tích và duy trì trạng thái vô hoạt cũng nhƣ thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng. Nghiên cứu về Chất bảo quản không những có thể đạt đƣợc mục đích pha loãng tăng dung tích của tinh dịch mà còn có thể nâng cao tỉ lệ thụ tinh của tinh dịch, kéo dài thời gian sống cũng nhƣ tiết kiệm đƣợc nhiều tinh dịch. Lựa chọn chất bảo quản cần chú ý các điều kiện sau: - Có chất dinh dƣỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng. - Tránh đƣợc sự kích thích của nhiệt độ. - Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất trong tinh trùng. - Có pH thích hợp với pH tinh dịch. - Giúp tinh trùng sống nhƣng không vận động. Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ đƣợc tinh trùng ở trạng thái bất động. Chất bảo quản có thể đƣợc pha chế trƣớc và giữ trong tủ lạnh trƣớc khi sử dụng. Tỷ lệ pha loãng tối ƣu cần đƣợc xác định theo từng loài [50]. Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp. Một vài dung dịch đơn giản nhƣ dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [39] cũng cho hiệu quả tốt. Ở một số loài cá biển nhƣ cá Trích Clupea harengus và cá Đối Mugil cephalus [16]; các tác giả đã sử dụng thành công nƣớc biển pha loãng cho thêm chất chống đông. Những nghiên cứu gần đây trên cá Rô phi cho thấy sử dụng nƣớc pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột để pha loãng sẹ cũng có kết quả [39]. Gần đây một số tác giả đã sử dụng đƣờng để làm chất bảo quản cho một số loài cá nƣớc ngọt. Horváth và ctv [28] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là 350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá Chép. Yavas và Bozkurt [55] sử dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho 10 cá Trắm cỏ và kết quả tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt lực tinh trùng sau bảo quản là 83,4±2,1%. Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng góp phần vào sự thành công của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. Tỷ lệ pha loãng: Mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hƣởng đến quá trình đông lạnh, khi pha loãng tinh dịch, tinh dịch nào có mật độ tinh trùng cao thì khả năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có mật độ tinh trùng thấp [6]. Tỷ lệ pha loãng giữa tinh dịch và chất bảo quản có thể từ 1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ pha loãng lớn hơn 1:20 thƣờng cho tỷ lệ hoạt động của tinh trùng bảo quản thấp [7]. Theo Stein và Bayrle [45] tỷ lệ thích hợp cho cá Chép là 1:3; Legendre và Billard [33] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá Hồi là 1:3; Harvey [25] tỉ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá Rô phi là 1:5. Việc lựa chọn đƣợc tỷ lệ pha loãng thích hợp sẽ nâng cao sức sống của tinh trùng khi rã đông, vì vậy nghiên cứu để đƣa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần thiết [42]. Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: Chất chống đông (chất bảo vệ tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng. Chất chống đông đƣợc thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hƣởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông. Một số nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản không có chất chống đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tƣợng bị kết lại và tế bào bị phá hủy, dẫn đến tinh trùng bị chết. Hiện nay, các chất chống đông thƣờng đƣợc sử dụng nhất là DMSO, Glycerol và Methanol. Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông. Nồng độ chất chống đông phải thích hợp thì mới bảo vệ đƣợc các tế bào tốt nhất trong quá trình làm lạnh và rã đông. Nồng độ các chất chống đông của các loài cá khác nhau thì khác nhau, và nồng độ tốt nhất cho các loài cá thƣờng từ 10-15% bao gồm cả DMSO, Glycerol và Methanol. 11 Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá Rô phi vằn O. niloticus của Rana và McAndrew [43] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức nồng độ giống nhau. Có loài có phổ DMSO khá rộng nhƣ cá Đù đỏ (Sciaenop ocellatusa) 7-15%, nhƣng cá Hồi (Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng Methanol 10%. Tóm lại, việc lựa chọn chất chống đông và nồng độ các chất chống đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. Chất bảo vệ màng tế bào: Một lƣợng lớn các hợp chất hoặc hỗn hợp sinh học đƣợc trộn trong dung dịch làm lạnh với mục đích bảo vệ, ổn định bề mặt ngoài tế bào tinh trùng trong quá trình bảo quản. Baynes và Scott [14] đã chứng minh rằng việc thêm 5-10% lòng đỏ trứng gà vào dung dịch bảo quản sẽ làm tăng khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi rã đông. Thời gian cân bằng: Thời gian cần thiết để chất chống đông thẩm thấu vào tinh trùng gọi là thời gian cân bằng [51]. Trong hầu hết các trƣờng hợp, thời gian cân bằng có thể kéo dài từ 10 đến 30 phút nhƣng có thể thay đổi phụ thuộc vào chất chống đông đƣợc sử dụng. Nếu nồng độ chất chống đông cần thiết gây độc cho tế bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu vào tế bào cần đƣợc rút ngắn. Một số tài liệu cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết. Rana và McAndrew [43] đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hƣởng không có ý nghĩa tới hoạt lực tinh trùng cá Rô phi (O. niloticus) sau khi rã đông, vì trƣớc khi làm lạnh thời gian từ khi pha loãng đến khi đóng cọng đã mất khoảng 30 phút. Tốc độ hạ nhiệt: Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản lạnh là tốc độ hạ nhiệt. Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nƣớc ra khỏi các tế bào để các tinh thể băng không hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong các tế bào để không làm hỏng các thành phần trong tế bào [37, 38]. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hƣởng lớn đến thành công của việc bảo quản tinh, vì vậy cần tìm đƣợc chu trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu. Có nhiều phƣơng pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trƣớc khi chuyển vào lƣu giữ trong nitơ lỏng. Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó khoảng 3-10 cm, hoặc làm 12 lạnh trong đá. Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chƣơng trình hạ nhiệt đƣợc cài sẵn trong máy tính. Tốc độ làm lạnh đƣợc điều chỉnh với các tốc độ khác nhau tùy theo loài. Trong thực tế, phƣơng pháp làm lạnh thành công và thực tế nhất về bảo quản lạnh tinh trùng cá là phƣơng pháp làm lạnh hai bƣớc. Bƣớc đầu tiên là giảm nhiệt độ của tinh trùng từ nhiệt độ lƣu giữ (ví dụ, nhiệt độ lƣu giữ bình thƣờng tinh trùng cá Hồi là 4oC) đến khoảng -70oC. Tốc độ làm lạnh tối ƣu cho tinh trùng từng loài khác nhau ở bƣớc này là khác nhau. Bƣớc thứ hai là đƣa tinh dịch vào nitơ lỏng 196oC [21]. Theo Forgason và ctv [23] phƣơng pháp làm lạnh trong hơi nitơ lỏng ở mức cao vào khoảng 5-10cm trong khoảng thời gian từ 10-12 phút sau đó chuyển từ từ xuống nitơ lỏng, phƣơng pháp này không cần thời gian cân bằng. Moczarski [40] cũng làm lạnh tinh cá Chép Nhật bản trên bề mặt và cách nitơ lỏng 3-5cm. Phƣơng pháp của Bouysson và Chupin [10] đã thử nghiệm trên các mức nhiệt độ khác nhau trong nitơ lỏng nhƣ: nhiệt độ cách bề mặt nitơ lỏng 2mm là -80oC xuống -85oC, 4mm là -70oC xuống -75oC, và 20mm là -50oC xuống -55oC. Dung dịch tinh cá Hồi có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt 30-35oC / phút bằng chƣơng tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng đƣợc thụ tinh. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm ra qui trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu. Phƣơng pháp rã đông: Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải đƣợc rã đông để đƣa vào sử dụng. Do điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh nên cần áp dụng phƣơng pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh trùng sống lại sau khi rã đông. Tùy vào các loài cá khác nhau, tùy vào việc sử các chất chống đông và tùy vào điều kiện thí nghiệm mà tiến hành rã đông ở các thang nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau. Ví dụ Horvath và Urbanyri [27] rã đông tinh trùng cá Trê ở 40oC trong 5 giây, tỷ lệ vận động của tinh trùng đạt 50%. Yasui và ctv [54] rã đông tinh trùng cá Chạch Misgurnus anguillicaudatus ở nhiệt độ 25oC trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47%. Le và ctv [32] rã đông tinh trùng cá Đù 13 vàng Larimichthys polyactis ở nhiệt độ 37oC trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần lần lƣợt là 45,7±3,2% và 27,2±5,0% . Dựa vào những đặc điểm trên của tinh trùng, ngày nay ngƣời ta nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp và kín đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả. Đặc biệt là phƣơng pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới. 1.3. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng 1.3.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới Tình hình nghiên cứu chung: Trƣớc những năm 50 của thế kỉ XX, việc lƣu giữ tinh ban đầu chỉ là việc cất giữ tinh trong điều kiện nhiệt độ thấp nhƣ tủ lạnh hay đá khô. Tuy nhiên, kể từ khi công trình của Blaxter đƣợc công bố vào năm 1953 trên đối tƣợng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã đƣợc tiến hành phổ biến trên nhiều đối tƣợng thủy sản. Cho đến nay nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh đƣợc tiến hành trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [47] với việc sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [31] và một số chất làm chất chống đông nhƣ DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose. Tóm lại, ở các đối tƣợng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau. Và có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã đƣợc nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi nhƣ cá Trích [16]; cá Hồi ([14], [15], [17]); cá Mú đen [24]; cá Trê châu Âu [34]; cá Chình Nhật [41]; cá Chép ([35], [29], [49], [48], [30]); cá Đù vàng [32] ……. Đối với cá nƣớc ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [18] công bố kết quả bảo quản tinh 6 loài cá Rô phi bao gồm Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticus, Tilapia zilli, cá Rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. Độ pH của tinh dịch các loài cá Rô phi dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và 5% Methanol. Sau khi pha loãng tinh với tỉ lệ 1:1 nhanh chóng làm lạnh xuống -35oC và hạ tiếp tục với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng. Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt đƣợc sau 22 ngày