Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa ...

Tài liệu Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa liposome doxorubicin (tt)

.DOC
31
165
64

Mô tả:

BÔÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÔÔ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ---------------KHÁNH THỊ NHI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊMLIPOSOME DOXORUBICIN Chuyên ngành CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC Mã số : 62 72 04 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI- NĂM 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ 2. PGS.TS. Nguyễn Minh Chính Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS. Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế Phản biện 3: GS.TS. Võ Xuân Minh Trường Đại học Dược Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Học viện Quân y vào hồi: giờ 00 ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc Gia 2. Thư viện Học viện Quân y DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt ADN ARN BP DC DĐVN DOPE DDAB DOX DPPC DPPE DPPS DSPA DSPC DSPE DSPE– PEG DSPG EPC EPG FDA HEPES HPC HPI HPLC KHV KTTP LUV MLV MVV PC Từ/cụm từ đầy đủ Acid deoxiribinucleic Acid ribonucleic Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia) Dược chất Dược điển Việt Nam Dioleoylphosphatidyl ethanolamin Dimethyldioctadecylammonium bromid Doxorubicin hydroclorid Dipalmitoylphosphatidylcholin 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid Distearoyl phosphatidylcholin Distearoyl phosphatidylethanolamin Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol Distearoyl phosphatidyl glycerol Egg-derived phosphatidylcholin Egg-derived phosphatidylglycerol Cục Quản Lý Thực Phẩm và Dược Phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid Phosphatidylcholin hydrogen hóa Phosphatidylinositolhydrogen hóa Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) Kính hiển vi Kích thước tiểu phân Liposome đơn lớp lớn (Large unilamellar vesicle) Liposome nhiều lớp đồng trục (Multilamellar vesicle) Liposome kép (liposome trong liposome) (Multivesicular vesicle) Phosphatidyl cholin PDI PEG SPC SUV TCCS Tf Tm USP UTTLT Chỉ số đa phân tán (polydispersity index) Polyethylenglycol Phosphatidyl cholin dầu đậu tương(Soy phospatidyl cholin ) Liposome đơn lớp nhỏ (Small unilamellar vesicle) Tiêu chuẩn cơ sở Nhiệt chảy hoàn toàn Nhiệt chảy lỏng (melting temperature) Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia) Ung thư tiền liệt tuyến 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành. Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome. Ngoài các đặc điểm của dạng thuốc hướng đích, liposome có ưu điểm lớn là tính tương hợp sinh học cao do có cấu tạo là các phospholipid. Trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox… với nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính. Tuy nhiên ở Việt Nam, nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa có chế phẩm nào được đưa vào nhằm phát triển một thế hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam. Hiện nay, dạng bào chế liposome đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết. Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến hành với 2 mục tiêu: 1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng TCCS, đánh giá độ ổn định chế phẩm. 2. Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u chuột thực nghiệm. *Những đóng góp mới của luận án: 1. Đã xây dựng được công thức bào chế liposome doxorubicin với các tá dược: Phosphatydin cholin, cholesterol. Liposome bào chế 2 được bằng phương pháp hydrat hóa film có kích thước dưới 150 nm; hiệu suất mang thuốc trên 85%. 2. Đã xây dựng được qui trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở qui mô phòng thí nghiệm. Thuốc tiêm đạt tiêu chuẩn chung của thuốc tiêm tĩnh mạch và tiêu chuẩn của hệ nano mang thuốc. 3. Đã xây dựng được phương pháp đánh giá về hóa lý và tác dụng in vivo trên động vật thực nghiệm của hệ nano liposome mang thuốc. Phương pháp có thể áp dụng để xây dựng công thức và đánh giá các hệ liposome mang thuốc khác. *Nội dung và cấu trúc mới của luận án: Luận án bao gồm 133 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng quan): 35 trang; chương 2 (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng và phương pháp nghiên cứu): 19 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu): 55 trang; chương 4 (bàn luận): 20 trang; kết luận và đề xuất: 2 trang. * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 153 tài liệu: 13 tài liệu tiếng Việt và 140 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề: Về dược chất: Các tính chất hóa lý và độ ổn định của doxorubicin; tác dụng dược lý, dược động học và các dạng bào chế đã lưu hành trên thị trường của doxorubicin. Liposome: khái niệm; phân loại liposome theo cấu trúc; sự phát triển của công nghệ liposome nhằm tăng cường khả năng hướng đích và kiểm soát giải phóng dược chất; thành phần cấu tạo của liposome; phương pháp bào chế liposome; phương pháp đánh giá liposome. Mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro và invivo: tổng 3 quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về loại tế bào ung thư và động vật thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm, cách xử lý số liệu và biện giải kết quả. CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Nguyên vật liệu - Nguyên liệu: Doxorubicin hydroclorid (DOX) đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ USP 28. Phosphatydin cholin đậu tương (SPC) và cholesterol (CHL) đạt tiêu chuẩn pha tiêm. Nguyên liệu, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dược điển hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo mục đích sử dụng). - Thuốc đối chiếu: Dung dịch tiêm doxorubicin “Ebewe” của nhà sản xuất Ebewe, Áo; hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin- Lipodox của hãng TTYBiopharm, Đài Loan. - Động vật thí nghiệm:  Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BAL C57/6, giống đực, khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng trung bình 20,0 ± 1,0 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.  Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mouse): chuột nhắt đực BALB/c, không có tế bào lympho T (nude mice, Foxn1 nu), nhập khẩu từ Công ty Charlie-River, Hoa Kỳ. - Tế bào ung thư:  Dòng tế bào ung thư Sarcoma TG180, do phòng thí nghiệm thực nghiệm trên chuột bạch của Bộ môn mô phôi – tế bào, khoa Sinh học, đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.  Tế bào ung thư tiền liệt tuyến (UTTTL) người dòng PC-3 (CRL1435), của ATCC, Hoa Kỳ. 4 1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Các trang thiết bị đã sử dụng đạt yêu cầu cho nghiên cứu bào chế, kiểm nghiệm và đánh giá sinh khả dụng. Các thiết bị đặc thù cho bào chế liposome: máy cất quay chân không, máy siêu âm, thiết bị ép qua màng (extruder), thiết bị lọc tiếp tuyến, hệ thống thẩm tích, tủ an toàn sinh học cấp III. Các thiết bị cho phân tích đánh giá: thiết bị đo kích thước tiểu phân, kính hiển vi điện tử truyền qua, máy đo quang phổ UV-vis, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao... và một số thiết bị dụng cụ thông thường khác. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế 2.3.1.1. Bào chế liposome doxorubicin *Phương pháp bào chế liposome chưa mang dược chất: - Hòa tan phospholipid, cholesterol trong cloroform rồi bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở 40 oC trong 12h để tạo lớp film mỏng trên thành bình cầu. Hydrat hóa lớp film bằng dung dịch đệm citrat ở 50oC với ở tốc độ 80 vòng/phút trong 2h để tạo hỗn dịch liposome. - Giảm kích thước liposome tạo ra bằng siêu âm hoặc bằng thiết bị nén nhiều lần qua màng polycarbonat có kích thước giảm dần từ 1000 nm đến 100nm. *Đưa DOX vào liposome: - Tạo chênh lệch pH hai bên màng liposome bằng cách điểu chỉnh pH tới 7,4 bằng NaOH hoặc bằng cách đổi môi trường đệm citrat thành đệm HEPES pH 7,4. Quá trình đổi đệm được tiến hành trên thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc thiết bị thẩm tích. 5 - Đưa DOX vào liposome: Sử dụng bể điều nhiệt nâng nhiệt độ hỗn dịch liposome đã tạo chênh lệch pH lên 60 oC, hòa tan DOX vào cho đạt nồng độ yêu cầu. Ủ trong thời gian nhất định để dược chất khuếch tán vào bên trong liposome. Sau đó để mẫu trở về nhiệt độ phòng và bảo quản ở nhiệt độ2-8oC. 2.3.1.2. Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin Thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml được bào chế tương tự như trên nhưng có kết hợp với biện pháp tiệt khuẩn phù hợp ở mỗi công đoạn và pha chế trong điều kiện vô khuẩn. 2.3.2. Phương pháp đánh giá các đặc tính liposome doxorubicin 2.3.2.1. Đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân (KTTP) và phân bố KTTP Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan. Cấu trúc: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản và cắt siêu mỏng. Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân: sử dụng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90. Sử dụng các thông số đường kính trung bình (dnm) và hệ số đa phân tán (PDI) để đánh giá. 2.3.2.3. Phương pháp định lượng doxorubicin * Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Nguyên tắc: Phá vỡ cấu trúc liposome bằng dung dịch Triton X100 10% rồi pha loãng tới nồng độ 10 µg/ml và đo quang phổ tử ngoại ở bước sóng 482 nm. Với dược chất tự do đo ở bước sóng 234 nm. * Phương pháp HPLC 6 Điều kiện: Cột C18, tốc độc dòng 1,3ml/ph, detector UV 254nm; pha động: Hỗn hợp dung môi acetonitril : methanol : nước : acid phosphoric theo tỉ lệ 450: 150 : 400 : 2. Hòa tan 1g natri lauryl sulfat trong 1 lít hỗn hợp trên rồi dùng dung dịch NaOH 2M điều chỉnh về pH 3,6±0,1. Căn cứ diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử tính toán ra nồng độ doxorubicin trong chế phẩm. *Định lượng dược chất tự do: Sử dụng phương pháp thẩm tích (Molecular weight cut offMWCO = 12 – 14 kD) để tách riêng dược chất tự do ra khỏi liposome. Định lượng doxorubicin trong môi trường ngoài túi thẩm tích bằng phương pháp đo quang phổ hoặc HPLC như trên. 2.3.2.4. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa Hiệu suất liposome hóa là phần trăm dược chất gắn vào bên trong liposome. Tách doxorubicin tự do bằng túi thẩm tích, sau đó định lượng doxorubicin trong liposome còn lại trong túi, so sánh với lượng doxorubicin ban đầu (toàn phần) để tính hiệu suất liposome hóa. 2.3.2.6. Phương pháp đánh giá độ ổn định của liposome Bảo quản liposome ở nhiệt độ 2-8oC. Đánh giá các chỉ tiêu: hình thái, cấu trúc tiểu phân, kích thước và phân bố kích thước tiểu phân, hàm lượng doxorubicin. 2.3.3. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin Với thuốc tiêm liposome doxorubicin, vẫn đánh giá toàn bộ các chỉ tiêu giống như của liposome doxorubicin nhưng đánh giá thêm các chỉ tiêu sau: pH, độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn:Theo DĐVN IV 7 Độ ổn định của chế phẩm trong thời gian bảo quản: Đánh giá sự thay đổi các chỉ tiêu của thuốc tiêm ở điều kiện bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC và điều kiện phòng thí nghiệm sau 24 tháng. 2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u động vật So sánh giữa các nhóm dùng thuốc: Nhóm chứng (dung dịch NaCl 0,9 %); nhómnghiên cứu (hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin nghiên cứu); nhóm đối chiếu: hỗn dịch liposome(Lipodox) và thuốc tiêm dung dịch doxorubicin tự do (EBEWE). 2.3.4.1. Trên chuột nhắt trắng Tế bào: Sử dụng tế bào Sarcoma TG180. Số lượng tiêm là 5×105 tế bào cho từng chuột để gây khối u cơ và u dưới da. Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian sống trung bình; thời gian sống thêm; kích thước khối u. 2.3.4.2. Trên chuột thiếu hụt miễn dịch Tế bào: Tế bào UTTTL người dòng PC-3 được tiêm lên chuột với số lượng 107 tế bào / chuột. Chỉ tiêu đánh giá: Kích thước khối u, trọng lượng chuột, thời gian sống. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin 3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS được sử dụng để định lượng doxorubicin trong quá trình nghiên cứu xây dựng công thức. Thẩm định một số chỉ tiêu như ảnh hưởng của tá dược, độ tuyến tính, độ lặp lại. - Qua đánh giá ảnh hưởng của tá dược, chọn bước sóng 482 nm để 8 định lượng dược chất toàn phần trong liposome và bước sóng 234 nm để định lượng dược chất tự do. -Tính tuyến tính: Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính của nồng đô Ô doxorubicin và mâ Ôt đô Ô quang ở các điều kiê Ôn khảo sát ở 2 bước sóng : 234nm ở pH 5,5 và 7,4 bước sóng 482 nm ở pH 5,5 và các pH khác nhau trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2 μg/ml đến 12 μg/ml (mức tin cậy 0,01). Như vậy có thể áp dụng phương pháp đo quang ở các khoảng nồng độ khảo sát cho mục đích nghiên cứu. - Độ lặp lại: Độ lệch chuẩn tương đối ở các điều kiện định lượng khác nhau đều có RSD < 2%, như vậy có thể thấy rằng phương pháp cho độ lặp lại tốt. 3.1.2. Phương pháp HPLC Phương pháp HPLC áp dụng để định lượng DC toàn phần và hiệu suất liposome hóa trong xây dựng tiêu chuẩn và theo dõi độ ổn định. Qua tham khảo USP thay đổi một số điều kiện sắc ký để phù hợp với định lượng liposome. Thẩm định phương pháp với các tiêu chí: độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, tính thích hợp hệ thống. - Tiến hành xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ từ 10 μg/ml- 100 μg/ml với 7 mẫu chuẩn doxorubicin pha trong pha động, mỗi mẫu phân tích 6 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính của nồng đô Ô doxorubicin và diện tích pic (y = 35,665x + 8,9508;R² = 0,99875). - Độ lặp lại: Pha độc lập 6 mẫu doxorubicin chuẩn với nồng độ chính xác 25,5μg/ml, tiến hành chạy sắc ký. Kết quả khảo sát cho thấy độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (RSD=1,004%< 2%), chứng tỏ phương pháp đủ độ chính xác để định lượng. - Tính thích hợp của hệ thống:Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần 9 cùng một dung dịch chuẩn DOX có nồng độ 40 µg/ml. Kết quả khảo sát cho thấy giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%, hệ số bất đối 0,6 < AF < 1,5; số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000. Chứng tỏ hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp cho phép phân tích định lượng doxorubicin toàn phần. - Độ đúng: Được khảo sát bằng phương pháp thêm chuẩn.Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 30, 40, 60 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 mẫu riêng biệt. Tiến hành chạy sắc ký định lượng lại lượng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó tính toán được % thu hồi. Kết quả khảo sát cho thấy lượng chất chuẩn thu hồi lại được nằm trong khoảng 98,35% đến 100,75%, RSD < 2%. Chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng. Kết luận: Phương pháp định lượng DOX bằng HPLC có tính thích hợp, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng cao. 3.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế liposome doxorubicin Tiến hành bào chế các mẫu liposome doxorubicin theo mô tả ở phương pháp nghiên cứu với thành phần công thức như sau: Bang 3.8: Các công thức bào chếế liposome doxorubicin Công thức 1.1 1.2 3.1 3.2 5.1 5.2 SPC mg 196 196 274 274 352 352 mmol 0,253 0,253 0,354 0,354 0,454 0,454 CHL mg 99 99 60 60 21 21 mmol 0,256 0,256 0,155 0,155 0,054 0,054 SPC : CHL mol:mol 49,7 : 50,3 49,7 : 50,3 69,5 : 30,5 69,5 : 30,5 89,3 : 10,7 89,3 : 10,7 DOX mg 25 50 25 50 25 50 mmol 0,043 0,086 0,043 0,086 0,043 0,086 Tổng Lipid : DOX mol:mol 11,8 : 1 5,9 : 1 11,8 : 1 5,9 : 1 11,8 : 1 5,9 : 1 Khảo sát các công thức với 2 cách tạo chênh lệch pH: điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH và đổi đệm Hespes. Kết quả thực nghiệm 10 cho thấy:Tạo chệnh lệch pH bằng phương pháp đổi đệm cho hiệu suất liposome hóa dược chất cao hơn so với phương pháp điều chỉnh pH bằng NaOH. Tỉ lệ mol lipid : DOX không ảnh hưởng tới hiệu suất liposome hóa dược chất. Tỉ lệ mol SPC:DOX là 70:30 cho liposome DOX có hiệu suất liposome hóa dược chất cao nhất (trên 60%). Liposome tạo ra vẫn có kích thước lớn (> 300 nm) và không đồng nhất (PDI > 0,4). Kết quả chụp hiển vi điện tử cho thấy liposome có cấu trúc đa lớp và đa khoang. Sau 1 tháng bảo quản, các liposome tạo ra đều có sự suy giảm rõ rệt về khả năng mang thuốc (EE chỉ còn dưới 50%), có hiện tượng sa lắng, tách lớp và kích thước tiểu phân cũng tăng lên tới hàng ngàn nm. Như vậy, cần phải nghiên cứu làm giảm KTTP cho liposome để tăng độ ổn định cũng như tăng khả năng hướng đích. Với các kết quả thu được, công thức 3.2 được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm xây quy trình bào chế liposome tốt hơn. 3.3. Kết quả xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 3.3.1.Nghiên cứu tìm biện pháp giảm kích thước liposome Nhằm tạo ra liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất, nghiên cứu làm giảm KTTP bằng siêu âm và nén qua màng: Phương pháp siêu âm: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu thiết bị siêu âm, thời gian siêu âm đến kích thước tiểu phân. Kết quả thực nghiệm cho thấy: Thiết bị siêu âm đũa (Labsonic) cho khả năng giảm KTTP tốt hơn so với bể siêu âm (Wiseclean).Thời gian siêu âm tăng sẽ làm KTTP giảm dần, hệ trở lên đồng nhất hơn. Tuy nhiên nếu thời gian siêu âm quá dài thì hệ lại trở lên kém đồng nhất. Với phương pháp siêu âm, lựa chọn thiết bị siêu âm đũa với tần số 30kHz, thời gian siêu âm 10 phút, thể tích siêu âm 10ml. Liposome 11 bảo chế theo phương pháp này cho kích thước khoảng 80 nm, PDI đạt dưới 0,3. Phương pháp nén qua màng: ép/ đùn 10 lần qua màng 400 nm rồi nén tiếp 20 lần qua màng 100 nm đạt kích thước khoảng 150 nm, PDI rất thấp (0,06) chứng tỏ hệ đồng nhất. So sánh hình ảnh chụp TEM của liposome được giảm kích thước bằng phương pháp siêu âm và nén/đẩy qua màng: Siêu âm Nén qua màng Hình 3.8: Ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương pháp giảm kích thước tiểu phân khác nhau Qua hình ảnh chụp TEM kết hợp với đo phân bố kích thước tiểu phân nhâ Ôn thấy liposome tạo ra bởi phương pháp nén qua màng phân bố kích thước đồng đều hơn (PDI thấp) nhưng có KTTP trung bình lớn hơn so với phương pháp siêu âm. Trong điều kiện nghiên cứu, chọn phương pháp siêu âm dễ dàng nâng qui mô bào chế hơn. 3.3.2 Quá trình đưa dược chất vào liposome - Đổi đệm: Hai phương pháp đổi đệm là thẩm tích và lọc tiếp tuyến được sử dụng để đổi môi trường bên ngoài liposome từ đệm citrat pH4 thành đệm HEPES pH 7,4. Liposome sau khi đổi đệm 12 được hòa tan DOX và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Kết quả thực nghiệm cho thấy: Phương pháp lọc tiếp tuyến có nhiều ưu điểm hơn thẩm tích, thời gian tiến hành ngắn, tốn ít đệm trao đổi, hiệu suất liposome hóa cao hơn. Đưa dược chất vào liposome: Thời gian ủ và nhiệt độ ủ có ảnh hưởng tới hiệu suất liposome hóa. Điều kiện liposome hóa thích hợp là ủ ở 50oC trong 30 phút.Sau khi ủ, DOX mới chỉ vào trong liposome đươc khoảng 40 -60%. Sau đó dược chất tiếp tục được khuếch tán vào trong liposome trong quá trình bảo quản, đạt hiệu suất là trên 80% sau 1 tuần. Từ các kết quả thu được, đề xuất thay đổi một số thông số và điều kiện bào chế hỗn dịch liposome doxorubicin như sau: - Siêu âm: Hỗn dịch liposome được chia thành các thể tích nhỏ (10ml) và được siêu âm trong thời gian 10 phút bằng thiết bị Labsonic. - Sử dụng phương pháp đổi đệm HEPES pH 7,4 bằng lọc tiếp tuyến để tạo chênh lệch pH qua màng. - DOX được phối hợp vào liposome tại nhiệt độ 50⁰C sau đó được bảo quản lạnh trong 1 tuần để đạt hiệu suất liposome hóa cao. 3.4. Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin Việc áp dụng kết quả nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin thu được vào bào chế thuốc tiêm chủ yếu là tìm biện pháp đảm bảo độ vô khuẩn cho thuốc tiêm và kiểm soát được các thông số trong quá trình bào chế. Ngoài các biện pháp tiệt khuẩn không thường về môi trường bào chế, dụng cụ, thiết bị, các dung dịch đệm... còn cần phải giải quyết các vấn đề đặc biệt sau: 13 - Liposome sau khi gắn DOX không thể tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc hoặc hấp tiệt khuẩn. Do đó cần phải sử dụng nguyên liệu vô khuẩn. - DOX hydroclorid có tốc độ hòa tan kém, dễ bị vón cục khi tiếp xúc với nước bởi hiện tượng dime hóa. Quá trình hòa tan DOX thực tế phải rắc từ từ dược chất vào hỗn dịch liposome cho đến khi tan hết để tránh bị vón cục, thời gian hòa tan DOX kéo dài và có nguy cơ ảnh hưởng đến độ bền của dược chất bởi nhiệt độ. Để giải quyết khó khăn này, dược chất được đông khô trước nhằm mục đích tăng tốc độ hòa tan và kiểm soát độ vô khuẩn cho DOX. Công thức đông khô không sử dụng tá dược tạo khung, vì vậy qua khảo sát, lựa chọn các thông số của thiết bị theo qui trình như sơ đồ ở hình 3.9. 14 Hình 3.9. Sơ đồ bào chế lọ vô khuẩnchứa doxorubicin đông khô Với các kết quả đã thu được, nghiên cứu đã đưa ra qui trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml với qui mô 50 lọ /mẻ được trình bày ở hình 3.10. 15 Hình 3.10. Sơ đồ tóm tắt qui trình bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2mg/ml Chế phẩm sau bào chế có hiệu suất liposome hóa 86,93± 0,4%, kích thước liposome 86,57 ± 1,03 d.nm, PDI= 0,274 ±0,03. Đánh giá thời gian hòa tan ban đầu và hiệu suất liposome hóa sau 1 tuần bảo quản 2-8 oC, kết quả thu được như sau: Bảng 3.27. Thời gian hòa tan DOX và hiệu suấết liposome hóa khi s ử dụng dược chấết đông khô Thời gian hòa tan DOX (phút) Hiệu suất liposome hóa (%) DOX thô DOX đông khô 10 ± 2 2 ± 0,5 76,58 ± 0,68 86,65 ± 0,27 3.5.Kết quảđề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn Dựa trên các kết quả nghiên cứu và khảo sát trên, đề xuất tiêu chuẩn liposome và cho thuốc tiêm liposome doxorubicin như sau: 3.5.1.1. Tiêu chuẩn liposome chưa mang dược chất Tính chất: Hỗn dịch liposome không màu, hơi đục mờ, đóng trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín.pH: 6,5 – 7,5.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 120 nm, PDI ≤ 0,30. 3.5.1.2. Tiêu chuẩn liposome doxorubicin Tính chất:Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín. pH: 6,0 – 8,0. Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của doxorubicin hydroclorid. KTTP: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm, PDI ≤ 0,30. Định lượng: Dược chất liposome hóa: không dưới 80%; Dược chất toàn 16 phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0- 115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi trên nhãn. 3.5.1.3. Tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Tính chất: Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín.Thể tích: 10ml + 10 %.pH: 6,0 – 8,0.Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của doxorubicin hydroclorid.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm; PDI ≤ 0,30.Định lượng:Dược chất liposome hóa: không dưới 80%; dược chất toàn phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi trên nhãn.Độ vô khuẩn: phải vô khuẩn. Nội độc tố vi khuẩn: không được nhiều hơn 2,2 EU/mg hoạt chất. Tiêu chuẩn được thẩm định tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương. 3.5.2. Đánh giá độ ổn định Trong thời gian theo dõi, các mẫu liposome bảo quản ở điều kiện khác nhau có sự biến đổi khác nhau. Ở nhiệt độ 2-8 oC và nhiệt độ phòng, hàm lượng dược chất toàn phần trong mẫu hầu như ít thay đổi do dược chất ổn định ở nhiệt độ thấp và được bao phủ phần lớn trong lớp vỏ phospholipid với pH thấp. Ở điều kiện 2-8 oC, sự biến đổi kích thước tiểu phân này không nhiều, nhưng ở điều kiện nhiệt độ phòng, có hiện tượng kết tụ làm tăng kích thước liposome, đồng thời lượng dược chất bị rò rỉ khỏi liposome khá lớn. Vì vậy đối với các chế phẩm này cần phải khống chế điều kiện bảo quản nghiêm ngặt, không thể dùng biện pháp lão hóa cấp tốc để dự đoán tuổi thọ của thuốc được. Với các kết quả thu được, sơ bộ kết luận thuốc có tuổi thọ 24 tháng.
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan