Tài liệu Nghiên cứu bào chế phytosome rutin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN TƢ ĐẠT NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME RUTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN TƢ ĐẠT NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME RUTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC KHÓA: QH2012.Y NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI ThS. NGUYỄN VĂN KHANH HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS. TS. Nguyễn Thanh Hải ThS. Nguyễn Văn Khanh Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời thầy cũng luôn động viên để tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện, giúp tôi hoàn thiện được khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô bộ môn Bào chế và Công nghê dược phẩm cùng các thầy cô các bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Dược cổ truyền, Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên Khoa Y Dược - ĐHQGHN, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động viên, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 6 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Tƣ Đạt MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về Rutin ........................................................................................2 1.1.1. Lịch sử phát triển ..............................................................................................2 1.1.2. Tên gọi – công thức phân tử .............................................................................2 1.1.3. Tính chất chung .................................................................................................3 1.1.4. Định tính Rutin .................................................................................................3 1.1.5. Định lượng Rutin ..............................................................................................3 1.1.6. Tác dụng của rutin ............................................................................................4 1.1.7. Một số nguồn dùng để chiết xuất rutin .............................................................5 1.1.8. Một số phương pháp chiết xuất rutin từ cây hoa hòe........................................6 1.1.9. Ứng dụng của Rutin ..........................................................................................6 1.1.10. Một số dạng bào chế của rutin ........................................................................7 1.2. Phytosome ..........................................................................................................7 1.2.1 Khái niệm ..........................................................................................................7 1.2.2 Thành phần của phytosome ..............................................................................7 1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome .............................................8 1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome ...............................................................................8 1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome .........................................................9 1.2.6 Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome .........................10 1.2.7. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome .................................................................................................................11 1.2.8. Đánh giá về các thông số vật lý, hóa học và sinh học của phytosome ...........12 1.2.9. Sự khác nhau giữa phytosome và liposome ....................................................12 1.2.10. Một số nghiên cứu về phytosome ............................................................14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 17 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị, đối tƣợng nghiên cứu .........................................17 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất ......................................................................................17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu...........................................................................17 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................18 2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................18 2.2.1. Chiết xuất, định lượng rutin từ hoa hòe ..........................................................18 2.2.2. Bào chế phytosome rutin và đánh giá một số đặc tính của phytosome bào chế được 18 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................18 2.3.1. Chiết xuất rutin từ hoa hòe..............................................................................18 2.3.2. Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang ...............................................22 2.3.3. Bào chế phytosome rutin ................................................................................22 2.3.4. Xác định độ tan, hệ số phân bố của rutin, phytosome rutin vừa bào chế .......22 2.3.5. Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân .................................................24 2.3.6. Phương pháp đánh giá 1 số đặc tính của phytosome ......................................24 2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid ..25 2.3.8. Nghiên cứu độ ổn định của phytosome rutin ..................................................25 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................25 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 26 3.1. Chiết xuất rutin từ hoa hòe ..........................................................................26 3.1.1. Chiết xuất ........................................................................................................26 3.1.2. Định lượng rutin trong hoa hòe.......................................................................26 3.2. Định lƣợng rutin bằng phƣơng pháp đo quang .........................................27 3.3. Khảo sát hệ số phân bố dầu nƣớc và độ tan trong các môi trƣờng của rutin....... ...................................................................................................................28 3.4. Phƣơng pháp làm giảm kích thƣớc tiểu phân bằng phƣơng pháp siêu âm....... ......................................................................................................................29 3.5. Bào chế phytosome Rutin .............................................................................30 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng ....................................................30 3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng .................................................33 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol rutin:phospholipid ....................................35 3.6. Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa rutin và phospholipid trong phytosome ................................................................................................................39 3.6.1. Phổ hồng ngoại (FTIR) ...................................................................................39 3.6.2. Phân tích nhiễu xạ tia X ..................................................................................40 3.6.3. Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) ....................................................................40 3.7. Nghiên cứu sự ổn định của phytosome rutin ..............................................42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu 1 H-NMR Nội dung Phổ cộng hưởng từ hạt nhân DĐVN Dược điển Việt Nam DSC Phân tích nhiệt vi sai FTIR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin) KTTP Kích thước tiểu phân NSX Nhà sản xuất PC Phosphatidylcholin PDI chỉ số phân bố KTTP SEM Kính hiển vị điện tử quét SKD Sinh khả dụng TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua XRD Nhiễu xạ tia X (XRay diffraction) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Sự khác nhau cơ bản giữa phytosome và liposome 14 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 17 Bảng 3.1 Hàm lượng rutin và quercetin trong sản phẩm thu được 26 Bảng 3.2 Độ hấp thụ quang của rutin theo nồng độ tại bước sóng 500nm 26 Bảng 3.3 Độ hấp thụ quang của rutin theo nồng độ tại bước sóng 257nm 28 Bảng 3.4 Một số đặc tính của rutin 29 Bảng 3.5 KTTP, PDI, thế zeta của phytosome rutin theo thời gian siêu âm 29 Bảng 3.6 Một số đặc tính của phytosome rutin theo nhiệt độ phản ứng 31 Bảng 3.7 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo nhiệt độ phản ứng 32 Bảng 3.8 Một số đặc tính của phytosome rutin theo thời gian phản ứng 33 Bảng 3.9 Hình ảnh phytosome rutin bào chế được 34 Bảng 3.10 Một số đặc tính phytosome rutin theo tỷ lệ mol phản ứng 35 Bảng 3.11 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo tỷ lệ mol rutin:phospholipid 36 Bảng 3.12 Một số đặc tính mẫu 1 sau thời gian 1 tháng và 2 tháng 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo Rutin 2 Hình 1.2 Cấu tạo của phytosome 7 Hình 1.3 Sự khác nhau giữa phytosome và liposome 14 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất rutin từ hoa hòe 20 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang theo nồng độ 26 Hình 3.2 Quét độ hấp thụ quang của dung dịch rutin chuẩn ở bước sóng 800-200nm 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang của rutin theo nồng độ tại bước sóng 257 nm 28 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI của hỗn dịch phytosome theo thời gian siêu âm KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo nhiệt độ phản ứng KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo thời gian phản ứng 30 32 34 Hình 3.7 KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo tỷ lệ mol rutin: phospholipid 36 Hình 3.8 Sơ đồ bào chế phytosome rutin 38 Hình 3.9 Sơ đồ bào chế phytosome rutin 38 Hình 3.10 Phổ hồng ngoại của rutin, phosphatidylcholin và phytosome rutin. 39 Hình 3.11 Phổ nhiễu xạ tia X của rutin, phosphatidylcholin và phytosome rutin 40 Hình 3.12 Phân tích nhiệt quét vi sai của rutin, PC và phytosome rutin 41 Hình 3.13 KTTP, PDI mẫu 1 sau thời gian 1 tháng và 2 tháng 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xu hướng sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong phòng và chữa bệnh ngày càng tăng. Rutin hay còn gọi là vitamin P,là một flavonoid tự nhiên, phân bố rộng rãi trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong cây hòe, được trồng và mọc hoang nhiều ở Việt Nam và đặc biệt hàm lượng rutin trong hoa hòe ở Việt Nam cao hơn nhiều lần so với các nước khác [11]. Rutin mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như là chất chống oxi hóa, tăng độ bền thành mạch, chống viêm, hạ huyết áp, giảm mỡ máu… [28]. Tuy nhiên, rutin lại có độ tan và sinh khả dụng của thấp. Nguyên nhân của vấn đề này là do dược chất có kích thước phân tử lớn và kém tan trong nước nên khó được hấp thu vào cơ thể. Để khắc phục nhược điểm này, các nghiên cứu trên thế giới gần đây đã thực hiện theo nhiều hướng khác nhau như tạo phức hợp với cylcodextrin, phức hợp với phospholipid, nano polyme... Một trong những dạng bào chế được quan tâm gần đây là bào chế phytomsome. Phytosome rutin là phức hợp giữa rutin và phospholipid có ưu điểm làm tăng sinh khả dụng đường uống và tăng tính thấm của dược chất qua da. Ở nước ta chưa có công trình nào nghiên cứu về phytosome rutin. Do vậy nhằm góp phần vào nên công nghệ dược phẩm nước ta, nâng cao hiệu quả điều trị các dược chất có nguồn gốc dược liệu thì việc bào chế phytosome có ý nghĩa hết sức quan trọng, hứa hẹn là tiềm năng trong việc điều trị một số bệnh qua da như thấp khớp, viêm khớp, đau nhức. Để góp phần bước đầu ứng dụng công nghệ phytosome cho các dược chất ít tan có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome rutin” với hai mục tiêu chính: 1. Bào chế được phytosome rutin bằng phương pháp bốc hơi dung môi. 2. Đánh giá một số đắc tính của phức hợp phytosome rutin bào chế được. 1 1.1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN Tổng quan về Rutin 1.1.1. Lịch sử phát triển Năm 1842, lần đầu tiền rutin được phân lập từ lá cây cửu lý hương – Ruta Graveolens L bởi dược sĩ người Đức – Weyb. Nhưng phải 100 năm sau, rutin mới bắt đầu được sử dụng nhiều trong y học [2]. Hlasiwetz và nhiều người khác đã bắt đầu nghiên cứu về cấu trúc của rutin. Perkin đã xác nhận được công thức phân tử của rutin là C27H30O16 và chỉ ra gốc đường gắn vào vị trí số 3 của quercetin. Charaux là người đầu tiên phân lập được phân đường của rutin là 1 disaccharid và gọi nó là rutinose. Sau đó, Zemplés và Gerecs đã thủy phân rutin lấy từ hạt Rhammus Utilis bằng enzym và thu được rutin [3]. 1.1.2. Tên gọi – công thức phân tử Rutin là 1 loại vitamin P. Chữ P là chữ đầu của chữ perméabilité, tiếng Pháp có nghĩa là tính thấm. Rutin có công thức phân tử là C27H30O16. Hình 1.1: Công thức cấu tạo Rutin - Trọng lượng phân tử 610,51 DvC, trong đó phần trăm về khối lượng của C, O, H lần lượt là 53,11%, 41,94%, 4,95%. - Tên theo IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-({[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6methyloxan-2-yl]oxy}methyl)oxan-2-yl]oxy}-4H-chromen-4-on Hoặc: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-βD-glucopyranosyloxy]-4H-chromen-4-one. - Tên gọi khác: Quercetin-3-rutosid, rhamnoglucosid, Rutosise, Sclerutin, Sophorin. 2 Eldrin, Oxerutin, Quercetin-3- 1.1.3. Tính chất chung - Tinh thể dạng bột hình kim màu vàng nhạt hay vàng hơi xanh lục, không mùi, không vị. Để ra ánh sáng có thể sẫm màu. - Tinh thể kết tinh ngậm 3 nước và chuyển sang dạng khan khi sấy 12 giờ ở 110oC và 10 mmHG [4]. - Rutin khan màu nâu, có tính hút tẩm. Nhiệt độ nóng chảy: 183-194oC. - Độ tan: Rutin rất khó tan trong nước lạnh (1/7.000), tan trong nước sôi (1/200), khó tan trong cồn (1/650), tan trong cồn sôi (1/60) [34]. - Tính tan + Tan trong pyridin, formamid. + Ít tan trong acetol, etyl acetat. + Không tan trong cloruafom, eter, benzen [4]. - Do cấu trúc là 1 glycosid nên rutin dễ bị thủy phân bởi các men có sẵn trong dược liệu hoặc các acid. Với dung dịch kiềm thì nó ít bị ảnh hưởng, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc của rutin mới bị phá vỡ, cụ thể là rutin sẽ mở vòng C tạo thành 1 dẫn chất acid thơm và 1 dẫn chất phenol [10]. 1.1.4. Định tính Rutin - Phản ứng cyanidin: dung dịch rutin trong cồn khi thêm Magnesi và acid clohidric đặc cho màu tím đỏ. - Phản ứng với NaOH cho màu tùy thuộc theo nồng độ và thời gian, đặc biệt khi phản ứng với dung dịch NaOH 1% cho màu vàng chanh. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% cho màu xanh lục. Sắc kí: dùng sắc kí lớp mỏng và sắc kí giấy. - Hiện màu bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 366nm hoặc bằng hơi amoniac soi đèn tử ngoại [10]. 1.1.5. Định lượng Rutin Rutin có thể định lượng bằng những phương pháp sau: - Phương pháp cân [3]. - Phương pháp đo quang [10]. - Phương pháp quang phổ. - Phương pháp đo iod. - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [2]. 3 1.1.6. Tác dụng của rutin Rutin có nhiều đặc tính dược lý (ví dụ như hoạt động chống oxy hóa) đã được khai thác trong y học của con người và dinh dưỡng. Thông thường, nó được sử dụng như một kháng sinh, kháng nấm, và chất chống dị ứng. Tuy nhiên, nghiên cứu hiện nay đã cho thấy tác dụng dược lý của nó trong điều trị các bệnh mãn tính khác nhau, chẳng hạn như ung thư, tiểu đường, cao huyết áp và tăng cholesterol [27].  Tác dụng trên hệ tim mạch Rutin ức chế kết tập tiểu cầu, cũng như giảm tính thấm mao mạch, tăng độ bền thành mạch làm loãng máu và cải thiện lưu thông máu, có tác dụng làm giảm tính thẩm thấu của mao mạch do chúng có khả năng làm co mạch cũng như có sự ảnh hưởng của rutin đối với chuyển hóa Adrenalin. Rutin phục hồi sự đàn hồi của mao mạch bị tổn thương, tăng sức đề kháng, duy trì tình trạng bình thường của mao mạch, đảm bảo mao mạch giữ được chức năng trao đổi chất. Rutin có thể cải thiện chức năng nội mô bằng cách gia tăng sản xuất oxit nitric trong các tế bào nội mô của con người. Oxit nitric có vai trò làm giãn nở các mạch máu, nó giúp kiểm soát sự lưu thông máu đến các bộ phận của cơ thể. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rutin có thể giúp ngăn ngừa cục máu đông, do đó có thể được sử dụng để điều trị bệnh nhân có nguy cơ bị các cơn đau tim và đột quỵ [27].  Tác dụng trong điều trị đái tháo đƣờng Rutin có thể sử dụng như là một tác nhân tiềm năng để kiểm soát đường huyết thông qua tăng cường hoạt tính của thụ kinase phụ thuộc insulin, do đó tăng khả năng kết hợp giữa đường và insulin và do đó gây tăng vận chuyển đường và tăng sự hấp thu glucose. Rutin có tác dụng trong hoạt động trị đái tháo đường, bằng cách ức chế viêm cytokin matory và cải thiện các cấu chống oxy hóa và lipid huyết tương ở chế độ ăn uống nhiều chất béo kết hợp với streptozotocin gây ra đái tháo đường type 2. Do đó Rutin có thể sử dụng hữu ích khi phối hợp cùng với các thuốc chữa đái tháo đường chuẩn. Ngoài ra, rutin cũng có tác dụng điều trị biến chứng đục thủy tinh thể trong đái tháo đường [27].  Tác dụng chống viêm Rutin có thể dùng để điều trị các bệnh viêm thông qua sự ức chế của protein HMGB1, được tiết ra bởi các tế bào miễn dịch, có tác dụng như 1 cytokin trung gian làm giảm viêm. Hoạt tính kháng viêm của rutin có thể là do tác dụng của nó 4 trong những biểu hiện phức tạp ASC (là các protein dạng hạt giống apoptosis) làm trung gian viêm. Rutin gây hiệu ứng chống viêm trong tia cực tím da chuột B-chiếu xạ bằng cách ức chế sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 và cảm ứng nitric oxit synthase. Dạng muối natri của rutin có tác dụng làm giảm nhẹ phù nề của tĩnh mạch khi bị viêm [27].  Tác dụng đối với các bệnh thần kinh Rutin bảo vệ, chống lại những ảnh hưởng suy thoái thần kinh tích lũy prion bằng cách tăng sản xuất các yếu tố neurotropic và ức chế apoptosis kích hoạt con đường trong các tế bào thần kinh. Rutin có thể có những lợi ích lâm sàng cho bệnh prion và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác. Oxit nitric có thể có khả năng được tham gia trong các tác dụng bảo vệ thần kinh của rutin chống thâm hụt đầu chấn thương gây ra nhận thức, viêm thần kinh, và apoptosis. Rutin là một tác nhân đầy hứa hẹn cho việc điều trị bệnh Alzheimer vì có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, và các hoạt động oligomer-giảm β-amyloid. Rutin có nhiều tiềm năng điều trị cho thiếu hụt nhận thức gắn với điều kiện liên quan đến hypoperfusion não mãn tính, chẳng hạn như chứng mất trí mạch máu và bệnh Alzheimer. Rutin có thể bảo vệ chống lại suy giảm trí nhớ không gian gây ra bởi trimethyltin. Synaptophysin và hệ dopaminergic có thể liên quan đến tổn thương thần kinh trimethyltin gây ra trong vùng hippocampus [27]. 1.1.7. Một số nguồn dùng để chiết xuất rutin - Người ta tìm thấy rutin có ở 62 họ thực vật với khoảng 150 loài thực vật, trong đó có 70 loài thuộc 28 họ có chứ rutin ở dạng vết [13]. - Trong cây, rutin chủ yếu phân bố ở hoa (cây hòe, cây tam giác mạch), lá (cây bạch đằng, cây tam giác mạch). - Tuy có nhiều loài thực vật chứa rutin nhưng rutin chỉ được tách chiết từ những cây nguyên liệu có hàm lượng rutin cao như Ruta graveolens L có khoảng 2%, Fagopyrum esculentum Moench có khooảng 4%, Fagopyrum tataricum L có khoảng 6%, Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell có khoảng 8%, Sophora japónica L có khoảng 18%. - Các vùng nguyên liệu chính để sản xuất rutin trên thế giới là: Sophora japónica L., Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell, Fagopyrum tataricum L và Fagopyrum esculentum Moench [9]. - Ở nước ta, hàm lượng rutin trong hoa hòe rất cao (khoảng 25-35%). So với một số dược liệu khác như tam giác mạch (2-3%), bạch đàn (10%) thì hàm lượng 5 rutin chứa trong hoa hòe là rất nhiều [12]. Mặt khác, cây hoa hòe mọc hoang khắp nơi và được trồng nhiều ở Nam Định, Thái Bình, Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An. Vì vậy, nguồn chiết xuất rutin của nước ta chủ yếu là hoa hòe. 1.1.8. Một số phương pháp chiết xuất rutin từ cây hoa hòe Phương pháp chiết xuất rutin chủ yếu dựa trên tính tan khác nhau của rutin trong các dung môi khác nhau. Một số phương pháp chiết xuất thường dùng như: - Chiết bằng nước sôi: phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước sôi và nước lạnh, có thể chiết bằng áp suất thường hoặc áp suất cao. Dùng nước sôi để chiết rutin trong hoa hòe, dịch chiết để nguội sẽ có tủa rutin, lọc lấy tủa thu được rutin. - Chiết bằng kiềm loãng: dựa vào cấu trúc nhóm chức –OH phenol tự do ở vị trí thứ 3’, 4’ tạo muối dễ tan trong môi trường kiềm. Dùng nước kiềm để chiết rutin, sau đó acid hóa lại dịch chiết để rutin kết tủa, lọc lấy tủa thu được rutin. - Chiết bằng cồn: phương pháp này dựa trên độ tan khác nhau của rutin vào cồn sôi và cồn lạnh. Dùng cồn sôi để chiết rutin, dịch chiết đem cô đặc sau đó để nguội rutin sẽ kết tủa, lọc lấy tủa thu rutin [5]. 1.1.9. Ứng dụng của Rutin - Rutin được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, công nghệ nhuộm màu thực phẩm, công nghệ bao màu. - Trong y học, rutin được dùng phòng và chống những biến cố của xơ vữa động mạch, các trường hợp suy yếu tĩnh mạch, xuất huyết như tử cung xuất huyết, ho ra máu, đại tiện ra máu, chảy máu cam. Là thuốc điều trị trĩ, chống dị ứng, thấp khớp. Ngoài ra còn dùng trong các trường hợp tổn thương về da do bị nhiễm bức xạ, làm cho vết thương chóng lành sẹo [12]. - Trong khoa mắt, rutin có thể được dùng cho các trường hợp viêm võng mạc có xuất hiện xuất huyết, chảy máu ở đáy mắt [10]. - Rutin có thể sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với các thuốc khác để nâng cao điều trị như: - Vitamin C: làm tăng cường tác dụng của vitamin C đặc biệt là khả năng hấp thụ thuốc vào các cơ quan khác nhau. Thường được dùng trong biểu hiện tổn thương mao mạch, xuất huyết dưới da, cao huyết áp. - Vincamin: dùng để chữa các chứng rối loạn tâm thần, cải thiện trí nhớ, chức năng thần kinh giác quan ở người già. - Nicotinamid: dùng trong các biểu hiện chức năng hay tổn thương thực thể của suy tĩnh-bạch mạch, giãn tĩnh mạch nguyên phát hay các cơn đau trĩ. 6 - Ngoài ra còn có thể phối hợp với cholin, khellin, papaverin. 1.1.10. Một số dạng bào chế của rutin Rutin được bào chế dưới dạng viên hay dạng hòa tan trong nước dùng uống, ở dạng đơn độc hay phối hợp với nhiều dược chất khác nhau. - Dạng viên: viên bao phim: Rutin. Mevon 500, Ido rutin, Vinca rutin (phối hơp vincamin và rutin), viên bao đường: Rutin C (phối hợp Rutin và vitamin C). - Dạng hòa tan trong nước: rutin thường được chuyển thành dạng muối hoặc chất dẫn dễ tan trong nước như morpholylethylrutosid, rutosid, natripropylsulionat [12]. 1.2. Phytosome 1.2.1 Khái niệm Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [28,33]. Thuật ngữ "Phyto" nghĩa là “thực vật” trong khi “some” có nghĩa là “giống như tế bào”, thường được gọi là herbosome trong nhiều tài liệu khác. Thế hệ phytosome đầu tiên được ra đời bằng việc kết hợp giữa hợp chất polyphenol với phospholipid trong dung môi không phân cực [21]. Hình 1.2: Cấu tạo của phytosome 1.2.2 Thành phần của phytosome Phytosome là phức hợp được tổng hợp bởi một phân tử phospholipid tự nhiên hay tổng hợp (phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin hay phosphatidyiserin) phản ứng với một hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết từ dược liệu [16]. Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan trong nước và phospholipid. Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [18]. 7 - Phospholipid là các phân tử lipid nhỏ cấu tạo bởi một glycerol trong đó, hai gốc rượu gắn với hai acid béo, gốc còn lại gắn với nhóm phosphat [16]. - Dược chất: Hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và nhóm phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất. 1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome  Phân loại Phospholipid gồm 3 loại: - Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecithin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG),… - Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC), disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE),… - Một số loạiphospholipid khác: như sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin,…). Phospholipid được sử dụng chủ yếu là từ đậu nành và trứng, đặc biệt là phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào.  Vai trò của phospholipid trong phytosome - Do phospholipid là hợp chất hai chức có chứa một nửa phosphatidyl ưa dầu và một nửa cholin ưa nước nên có khả năng cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất tự nhiên. Phần nửa ưa nước (nhóm cholin) gắn với hợp chất tự nhiên, trong khi nửa phần phosphatidyl tan trong lipid dạng đuôi và bao bọc các thành phần liên kết cholin [11]. - Ngoài vai trò là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế bào trong cơ thể. - Đồng thời, phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô, thành tế bào trong cơ thể [20,31,32]. 1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome  Ƣu điểm 8 - Phytosome dễ tan trong dung môi dầu và nước nên tăng khả năng hấp thụ dược chất, gia tăng sinh khả dụng, dẫn đến giảm liều dùng và tăng được hiệu quả điều trị. - Phospholipid vừa là chất mang, vừa có tác dụng bảo vệ gan. Cholin có trong phospholipid giúp bổ sung cholin cho gan, bảo vệ gan khỏi nhiễm mỡ. - Do phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng của thuốc tại gan. - Giữa các phân tử phosphatidylcholin và các hoạt chất có hình thành các liên kết hóa học nên dạng bào chế phytosome có ổn định cao. - Hướng hoạt chất đên mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào. - Phytosome giúp tăng tính thấm, hấp thu qua da nên được dùng nhiều trong mỹ phẩm. Đặc biệt, do phytosome có đặc tính thân dầu nên hoạt chất dễ vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid. - Phytosome giúp tăng thời gian bán thải của một sô hoạt chất nên tăng thời gian tác dụng của hoạt chất trong cơ thể, tăng tác dụng sinh học của hợp chất [12,28,33].  Nhƣợc điểm - Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại như: diclomethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường. - Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu áp suất cao 3000-4500 psi [23]. 1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome Các phương pháp bào chế phytosome là: - Phương pháp bốc hơi dung môi. - Phương pháp kết tủa trong dung môi. - Phương pháp siêu tới hạn. Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô. Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp. Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi. Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay; tiến hành khuấy trộn, cách thủy hồi lưu 9 trong một khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để hình thành liên kết trong phức hợp. Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome. Từ lớp màng phytosome này, có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo hỗn dịch phytosome thô hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay. 1.2.6 Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome Mục đích của quá trình này là tạo ra phytosome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức và độ tan cho dược chất. Những tiểu phân có kích thước càng nhỏ sẽ có diện tích bề mặt tiếp xúc càng lớn; từ đó, khả năng giải phóng dược chất nhanh hơn cũng như độ ổn định cao hơn so với những tiểu phân kích thước lớn hơn. Phytosome được làm giảm KTTP bởi các tác dụng của lực cắt. Các phương pháp được sử dụng để làm giảm và đồng nhất kích thước là siêu âm, đùn ép qua màng, đồng nhất hóa áp suất cao… - Siêu âm: Đây là một trong những phương pháp phổ biến để làm giảm kích thước tiểu phân phytosome. Nguyên tắc là sử dụng sóng siêu âm để làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân. Quá trình siêu âm phụ thuộc nhiều yếu tố ảnh hưởng như: cường độ, tần số siêu âm, thời gian, thể tích mẫu, kiểm soát nhiệt độ trong quá trình siêu âm. Trong đó, cường độ và tần số là hai thông số rất quan trọng của siêu âm [36]. Nhược điểm của phương pháp này là làm tăng nhiệt cục bộ, từ đó tăng quá trình thủy phân và oxy hóa phospholipid cũng như ảnh hưởng đến dược chất không bền với nhiệt. Siêu âm que giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, nên cũng có ảnh hưởng đến độ ổn định của phytosome bào chế [24,25,26]. - Đồng nhất hóa áp suất cao: Nguyên tắc của phương pháp là dưới áp suất của khí trơ, nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa. Nén tuần hoàn nhiều vòng cho đến khi thu được kích thước mong muốn. Ưu điểm của phương pháp này là dễ nâng cấp quy mô, kích thước thu được khá đồng nhất [7]. - Đùn ép qua màng: Hỗn dịch phức hợp được đùn ép qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng. Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch phức hợp được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, xếp đồng trục và kích thước xác định, ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp. Các tiểu phân có kích thước 10 lớn hơn lỗ màng sẽ đi qua màng, các tiểu phân nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó hỗn dịch sau đùn ép có kích thước đồng nhất. Ưu điểm của phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ. 1.2.7. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome Để xác định cấu trúc của phytosome cũng như đánh giá tương tác phân tử giữa dược chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phân tích nhiệt quét vi sai (DSC), phổ nhiễu xạ tia X (XRD).  Phân tích phổ hồng ngoại (IR) Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại. Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết [14]. Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó. Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.  Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) Phân tích nhiệt vi sai là phương pháp đánh giá nhanh và tin cậy để sàng lọc sự tương hợp hoạt chất và tá dược và cung cấp các thông tin tối đa về sự tương tác giữa các chất. Với các dữ liệu về dòng nhiệt thay đổi theo nhiệt độ, trên phổ DSC có thể thu được các pic tương ứng với điểm thu nhiệt-nóng chảy hoặc toả nhiệt - kết tinh. Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử được đặt trong buồng kín và gia nhiệt để chúng có cùng nhiệt độ. Sự chênh lệch nhiệt lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ của 2 mẫu bằng nhau cho biết thông tin về quá trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian quét. Nhiệt lượng chênh lệch này được xác định như một hàm của sự chênh lệch nhiệt độ tức thời giữa 2 mẫu. Khi dược chất và tá dược có tương tác với nhau sẽ làm các quá trình nhiệt bị thay đổi, điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên đồ thị DSC [22]. Mục đích: Từ những phân tích về sự thay đổi trên đồ thị DSC có thể chứng minh được sau khi tạo thành phức hợp, có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha của 11