Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PEG hóa

  • Số trang: 57 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 67 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƢ N Ọ Ƣ NỘ N Ô T Ị LAN N N U O L POSOME OXORU K ÓA LUẬN TỐT N Ế N PE ỆP Ƣ NỘI – 2015 SĨ ÓA Ộ Y TẾ TRƢ N Ọ Ƣ NỘ N Ô T Ị LAN N N U O N PE LIPOSOME DOXORU K ÓA LUẬN TỐT N Ế ỆP Ƣ ÓA SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Văn Lâm 2. DS. Lê Phương Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội NỘI – 2015 L I CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể Ban Giám Hiệu và bộ môn Bào Chế trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới: ThS. Nguyễn Văn Lâm, DS. Lê Phương Linh Là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận. Em cũng trân trọng cám ơn PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ. Cô đã đƣa ra những góp ý quan trọng để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn. Xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên đã hỗ trợ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã thƣờng xuyên động viên, giúp đỡ để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Ngô Thị Lan MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................2 1.1. Doxorubicin ......................................................................................................2 1.1.1. Công thức, tính chất lý hóa .......................................................................2 1.1.2. Dƣợc động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trƣờng 2 1.2. Đại cƣơng về liposome ....................................................................................3 1.2.1. Khái niệm, cấu tạo.....................................................................................3 1.2.2. Phân loại ....................................................................................................4 1.2.3. Những nghiên cứu trong nƣớc về liposome ..............................................8 1.3. Liposome biến đổi bằng cách PEG hóa ...........................................................9 1.3.1. Khái niệm PEG hóa ...................................................................................9 1.3.2. Ƣu, nhƣợc điểm của liposome PEG hóa ..................................................9 1.3.3. Đặc tính của PEG ....................................................................................10 1.3.4. Ảnh hƣởng của thành phần PEG lên liposome .......................................11 1.3.5. Phƣơng pháp gắn PEG vào liposome......................................................13 1.3.6. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin PEG hóa trên thế giới ......14 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................16 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu ..............16 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................16 2.1.2. Nguyên vật liệu .......................................................................................16 2.1.3. Phƣơng tiện nghiên cứu ..........................................................................17 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................17 2.2.1. Phƣơng pháp bào chế liposome doxorubicin ..........................................17 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá liposome doxorubicin PEG hóa tạo thành .........19 2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu.......................................................................22 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ...............................................................................22 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................23 3.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn .....................................................................23 3.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml ........24 3.2.1. Lựa chọn nồng độ DSPE-PEG2000...........................................................24 3.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ngoài tới liposome doxorubicin PEG hóa ..28 3.3. Theo dõi độ ổn định của chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa .............32 3.4. Bàn luận .........................................................................................................37 3.4.1. Về lựa chọn thành phần vỏ lipid cho liposome. ......................................37 3.4.2. Về khảo sát một số yếu tố đến chất lƣợng liposome. .............................37 3.4.3. Về độ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa ......................40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................41 DANH MỤ Á KÍ ỆU, Á Ữ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 BP Dƣợc điển Anh 2 Chol Cholesterol 3 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam 4 DOX Doxorubicin 5 DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid 6 DSPC 1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin DSPE- (N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl- PEG2000 sn-glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt) 8 EE Hiệu suất liposome hóa 9 EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu 10 Glu Glucose 11 HEPES 12 HSPC Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa 13 Kl/kl Khối lƣợng/khối lƣợng 14 KTTP Kích thƣớc tiểu phân 15 LCL Long-circulating liposome - liposome tuần hoàn dài 16 LUV Large unilamellar vesicles - các liposome đơn lớp lớn 17 MPS Mononuclear phagocyte system - hệ đại thực bào đơn nhân 18 PDI Polydispersity index - chỉ số đa phân tán 19 PEG Polyethylen glycol PEG- 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N-Methoxy DSPE Polyethylene glycol 7 20 21 pHSLs 22 PP Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan sulfonic acid [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes] - liposome nhạy cảm với pH Phosphat 23 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành 24 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 25 TKKH Tinh khiết hóa học 26 TLs 27 Tt/tt [Thermosensitive (heat-triggered) liposomes] - liposome nhạy cảm với nhiệt Thể tích/thể tích DANH MỤ Á ẢNG ảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng................................................ 16 ảng 3.1. Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch DOX ở bước sóng 233 nm và 481 nm (pH 4).............................................................. 23 ảng 3.2. Độ ổn định của các công thức liposome chưa mang dược chất.. 25 ảng 3.3. Độ ổn định của công thức có 1 %mol DSPE-PEG2000………… 25 ảng 3.4. Độ ổn định của công thức có 5 %mol DSPE-PEG2000 ………… 26 ảng 3.5. Độ ổn định của công thức có 10 %mol DSPE-PEG2000….......... 26 ảng 3.6. Độ ổn định của mẫu có môi trường ngoài là HEPES pH 7,5 (HES) và Phosphat pH 7,5 (PP).................................................... 30 ảng 3.7. Công thức bào chế mẫu theo dõi độ ổn định................................. 33 DANH MỤ Á ÌN VẼ, Ồ THỊ ình 1.1. Cấu trúc liposome ................................................................. 4 ình 1.2. Kích thước một số loại liposome ............................................. 4 ình 3.1. Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ.......................... 23 Hình 3.2. Hình ảnh chụp TEM của ba công thức C1, C2, C3....................... 27 ình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại đệm tới hiệu suất liposome hóa.................................................................................. 29 ình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của 2 công thức sử dụng môi trường ngoài HEPES 7,5 và phosphat 7,5 30 ình 3.5. Hình thức sau 28 ngày của hai mẫu HEPES 7,5 và phosphat 7,5.................................................................................................. 31 ình 3.6. Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tá dược đẳng trương tới hiệu suất liposome hóa.................................................................................. 32 ình 3.7. Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M1 sau 6 tháng.... 33 ình 3.8. Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M2 sau 6 tháng.... 34 ình 3.9. Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M3 sau 6 tháng.... 34 ình 3.10. Đồ thị so sánh sự thay đổi KTTP, PDI của 3 công thức sau 6 tháng.............................................................................................. 35 Hình 3.11. Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa (EE%) 3 công thức sau 6 tháng.............................................................................................. 35 ình 3.12. Hình thức 3 công thức M1, M2, M3 sau 6 tháng......................... 36 1 ẶT VẤN Ề Hiện nay ung thƣ đang là một trong những bệnh nan y gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho nền y học hiện đại. Đặc thù của thuốc điều trị ung thƣ là có độc tính rất cao với tế bào và gây ra rất nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng trên cơ thể con ngƣời. Vì vậy mà ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho các bệnh nhân. Ngay từ khi ra đời dạng bào chế liposome đã tạo bƣớc đột phá lớn trong điều trị ung thƣ do những đặc điểm ƣu việt của nó nhƣ khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đƣa thuốc tới đích. Doxorubicin là một trong những thuốc chống ung thƣ đƣợc nghiên cứu khá sâu rộng trên thế giới và đã cho ra đời rất nhiều sản phẩm thƣơng mại nhƣ Doxil, Myocet. Tại Việt Nam, liposome mới đƣợc phát triển trong vài năm gần đây và trƣờng đại học Dƣợc là nơi đi tiên phong trong việc nghiên cứu về liposome doxorubicin. Các nghiên cứu bƣớc đầu đã đạt đƣợc những kết quả khích lệ, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại mới chỉ dừng lại ở việc bào chế liposome quy ƣớc với 2 thành phần là phospholipid và cholesterol. Liposome quy ƣớc rất dễ bị bắt giữ bởi đại thực bào và nhanh chóng thanh thải khỏi hệ tuần hoàn. Chƣa có nghiên cứu nào về việc sử dụng dẫn chất polyme nhƣ PEG để tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải của liposome. Hơn nữa các nghiên cứu cũng đang gặp khó khăn trong việc nâng cao độ ổn định cho chế phẩm. Để giải quyết các vấn đề này đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PE hóa” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính: 1. Bào chế và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng hỗn dịch liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml. 2. Theo dõi độ ổn định của liposome doxorubicin PEG hóa trong vòng 6 tháng 2 ƢƠN 1. TỔNG QUAN 1.1. Doxorubicin 1.1.1. ông thức, tính chất lý hóa Công thức phân tử: C27H29NO11.HCL. Khối lƣợng phân tử: 579,99 [30], [31]. - Tên khoa học: (8S, 10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-trideoxy- trideoxy-α-L-lyxohexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1methoxy-5,12-naphthacenedion [30]. - Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Dung dịch 5 mg/ml có pH từ 4 - 5,5. Tan trong nƣớc, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran. Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [30]. Nhóm amino của doxorubicin có Pka là 8,15; doxorubicin bao gồm cấu trúc anthraquinon thân dầu với đƣờng amin thân nƣớc ở trạng thái bị proton hóa [11], [15]. Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, ở nồng độ điều trị thì doxorubicin đƣợc cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng [30]. 1.1.2. ƣợc động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trƣờng 1.1.2.1. Dược động học Sau khi tiêm tĩnh mạch doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận. Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol. Khoảng 40 - 50% lƣợng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chƣa chuyển hóa, 5% bị đào thải qua nƣớc tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không 3 qua đƣợc hàng rào máu não nhƣng qua đƣợc nhau thai và bài tiết đƣợc qua tuyến sữa. Doxorubicin khi gắn với liposome PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thƣ có hệ mạch máu không bình thƣờng [30]. 1.1.2.2. Cơ chế tác dụng Doxorubicin là một thuốc thuộc nhóm anthracyclin [3]. Cơ chế tác dụng của doxorubicin đã đƣợc nghiên cứu sâu rộng. Doxorubicin là một tác nhân xen vào giữa phân tử ADN và ức chế topo-isomerase II. Doxorubicin hình thành gốc tự do, từ đó gây peroxy hóa lipid và có thể phá hủy ADN bằng cách phá vỡ chuỗi đơn, chuỗi kép và làm tổn thƣơng các base (purin và pyrimidin). Tuy nhiên ngƣời ta vẫn chƣa chứng minh đƣợc anthracyclin tạo ra các gốc tự do ở trong nhân, do đó cơ chế này vẫn còn đƣợc tranh cãi [15], [31]. 1.1.2.3. Chỉ định Ung thƣ vú, u xƣơng ác tính (sarcom xƣơng) và u xƣơng Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thƣ biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thƣ đƣờng tiết niệu và sinh dục: ung thƣ tử cung, ung thƣ bàng quang, ung thƣ tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [1]. 1.1.2.4. Các chế phẩm trên thị trường Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2 mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim. Thuốc tiêm liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet. Bột đông khô pha tiêm 10 mg, 20 mg, 50 mg, 150 mg: Adriblastina, Doxorubicina. 1.2. ại cƣơng về liposome 1.2.1. Khái niệm, cấu tạo Là một hệ mang thuốc gồm một nhân nƣớc ở giữa đƣợc bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm có kích thƣớc thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [6], [7], [8], [25]. 4 ình 1.1. Cấu trúc liposome [11] 1.2.2. Phân loại 1.2.2.1. Theo kích thước và số lớp Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong liposome – MVV), liposome đơn lớp lớn (LUV), liposome đơn lớp nhỏ (SUV), liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), liposome đa lớp nhỏ (OLV) [12], [32], [33]. ình 1.2. Kích thƣớc một số loại liposome [5] 1.2.2.2. Theo cấu tạo, thành phần Liposome quy ước Là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và cholesterol. Liposome quy ƣớc không đƣợc biến đổi bề mặt cũng nhƣ lớp vỏ nên chúng chỉ có chức năng nang hóa, bảo vệ dƣợc chất bên trong, nếu đƣờng dùng là tiêm tại chỗ thì liposome có tác dụng giải phóng dƣợc chất kéo dài [7], [27]. Liposome quy ƣớc có nhƣợc 5 điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và hệ thống lƣới nội mô ở gan và lách; khả năng hƣớng tới đích tác dụng còn kém và thụ động chủ yếu phụ thuộc vào kích thƣớc của liposome và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các mô ung thƣ; chƣa kiểm soát đƣợc khả năng giải phóng dƣợc chất. Mặc dù vậy, nếu tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào đơn nhân thì chính việc bắt giữ khi di chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ƣu điểm của các liposome quy ƣớc [27]. Liposome biến đổi. Là những liposome đƣợc biến đổi thành phần vỏ hoặc bề mặt để có những đặc tính mới. A. Biến đổi thành phần vỏ liposome bằng cách sử dụng các loại phospholipid khác nhau sẽ nhận đƣợc những liposome nhạy cảm với các tác nhân bên ngoài nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, từ tính. Khi nhận đƣợc các kích thích từ bên ngoài, lớp vỏ lipid sẽ biến đổi dẫn đến tăng tính thấm đối với dƣợc chất, do đó dƣợc chất sẽ nhanh chóng giải phóng ra khỏi liposome. Do vậy những liposome này gọi là những liposome kiểm soát giải phóng (trigger release). B. Biến đổi bề mặt liposome bằng các phân tử khác nhau sẽ đƣợc liposome tuần hoàn dài hay liposome vận chuyển chủ động đến đích tác dụng. Các chất hay đƣợc sử dụng để làm phối tử gắn lên bề mặt liposome vận chuyển chủ động là những chất có số lƣợng thụ cảm (receptor) lớn tại mô đích [7]. A. Liposome biến đổi thành phần vỏ Liposome nhạy cảm nhiệt độ [Thermosensitive (heat-triggered)liposomes - TLs] Hệ liposome đƣợc bào chế bằng các lipid có nhiệt độ chuyển pha (Tm) cao hơn nhiệt độ sinh lý, dƣợc chất đƣợc giải phóng tại vị trí khối u bằng cách tăng thân nhiệt tại chỗ. TLs có ƣu điểm là không phụ thuộc vào hiệu ứng EPR (hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu) do đƣợc kiểm soát trong suốt quá trình điều trị, thuốc đƣợc giải phóng rất nhanh trong các mạch máu của khối u, sau đó là sự hấp thu nhanh chóng của các tế bào xung quanh. Ngoài ra, thuốc đƣợc phân phối tới khối u ở dạng tự do, góp phần cải thiện sinh khả dụng và khả năng xâm nhập khối u. 6 Nhƣợc điểm chính khi sử dụng liposome loại này là không hiệu quả trong điều trị khối u đã di căn vì sử dụng TLs đòi hỏi phải có hiểu biết chính xác về vị trí khối u [14]. Tại thời điểm hiện nay công ty Celsion Corporation (USA) đã bào chế thành công thuốc tiêm liposome doxorubicin nhạy cảm nhiệt độ (ThermoDox) và đang thử nghiệm lâm sàng pha III trên bệnh nhân ung thƣ gan và pha II trên bệnh ung thƣ vú [7]. Liposome nhạy cảm ánh sáng (light-sensitive liposome) Liposome có thể đƣợc tạo thành với các lipid nhạy cảm với ánh sáng. Các tác nhân nhạy cảm ánh sáng nhƣ dẫn chất porphyrin, chlorins, phthalocyanines tạo ra oxy nguyên tử sau khi phơi nhiễm ánh sáng và đƣợc sử dụng để kích thích tiêu diệt các tế bào ung thƣ. Liposome nhạy cảm ánh sáng đƣợc ứng dụng nhiều trong điều trị những khối u nông [14]. Liposome nhạy cảm pH [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes – pHSLs] Đƣợc bào chế từ các phospholipid nhạy cảm với pH thấp (< 7), dƣới tác động của pH acid trong nội bào hoặc ở khối u, lớp vỏ liposome sẽ bị phá vỡ và giải phóng dƣợc chất ra khỏi liposome. Hệ phân phối thuốc chỉ có thể bị phá vỡ trong endosomes/lysosomes, giải phóng dƣợc chất theo cơ chế dung hợp với màng tế bào. Ví dụ điển hình cho liposome loại này là các liposome có thành phần lớp vỏ gồm dioleylphosphoethanolamine (DOPE) và cholesterylhemisuccinate (CHEMS). Những thành phần này gây ra sự mất ổn định màng liposome ở pH acid yếu, cho phép hợp nhất với màng endosome/lysosome và giải phóng thuốc vào trong tế bào chất [14]. Liposome có từ tính (Magnetic liposomes –MLs) Các phân tử sắt oxid Fe3O4 hoặc γ-Fe2O3 đƣợc gắn vào bên trong liposome, tạo nên các liposome có tính từ. MLs cho phép phân phối thuốc có kiểm soát nhờ tác dụng của một từ trƣờng bên ngoài. Các MLs có thể đƣợc dùng cho mục đích chẩn đoán bệnh, để chữa trị ung thƣ và kết hợp với các thuốc khác để giải phóng có kiểm soát cho các liệu pháp chữa trị hiệu quả và an toàn hơn. MLs chia làm hai loại là MLs cổ điển (classical ML) bao gồm một tiểu phân oxid sắt ~ 15 nm đƣợc bao quanh bởi 7 một lớp màng kép lipid. Khi bên trong chứa đầy các tiểu phân nano oxid sắt thì sẽ không còn cấu trúc nhân nƣớc. Loại này không cho phép gắn các thuốc thân nƣớc. Loại thứ hai bao gồm các liposome kích thƣớc khoảng 100 - 500 nm bao quanh một vài tiểu phân nano oxid sắt kích thƣớc 1 - 10 nm phân tán trong một nhân nƣớc, cho phép gắn đồng thời nhiều thuốc thân nƣớc [14]. Liposome giải phóng nhờ siêu âm [Echogenic (ultrasound-triggered) liposomes – ELs] Giải phóng thuốc có kiểm soát nhờ sóng siêu âm đã đƣợc nghiên cứu do đặc tính không xâm nhập và có khả năng xuyên qua cơ thể và tăng tính thấm ở hàng rào máu - mô và màng tế bào. Không khí đƣợc gắn trong ELs cho phép ELs phản ứng khi kích hoạt sóng siêu âm và nhờ đó mà thuốc đƣợc giải phóng khỏi liposome. Giải phóng thuốc có thể đƣợc điều chỉnh theo các thông số của sóng siêu âm [14]. B. Liposome biến đổi bề mặt Liposome tuần hoàn dài (long-circulating liposome): Đƣợc bào chế từ phospholipid trung hòa có nhiệt độ chảy cao, đƣợc bao bề mặt bằng các phân tử polyme thân nƣớc nhƣ PEG, vì vậy liposome có cấu trúc không gian cồng kềnh nên tránh đƣợc sự nhận diện của quá trình opsonin hóa làm tăng thời gian lƣu trú trong hệ tuần hoàn. Với kích thƣớc nhỏ (100 – 200 nm) liposome dễ dàng xâm nhập vào mô ung thƣ mà không qua đƣợc thành mạch của mô lành. Đây đƣợc gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu (EPR). Liposome tuần hoàn dài vận chuyển thuốc theo cơ chế thụ động dựa trên thời gian lƣu trú lâu trong hệ tuần hoàn của liposome và tính thấm cao của thành mạch mô ung thƣ [7]. Liposome vận chuyển chủ động (active targeted liposome): Đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng các phối tử (ligand) đƣợc nhận biết bởi các thụ cảm (receptor) trên bề mặt tế bào mô đích. Những liposome này đƣợc nghiên cứu để vận chuyển chủ động đến mô ung thƣ. Tế bào ung thƣ sản sinh ra rất nhiều các protein, hormon, enzym có tính kháng nguyên và những kháng nguyên này sẽ đƣợc nhận biết bởi các kháng thể tƣơng ứng. Trên bề mặt tế bào ung thƣ có chứa gấp nhiều lần kháng nguyên cũng 8 nhƣ thụ cảm so với các mô lành. Ví dụ nhƣ thụ cảm của các yếu tố tăng trƣởng (folat receptor, transferrin receptor), protein trên bề mặt tế bào nội mô ung thƣ [7]. 1.2.3. Những nghiên cứu trong nƣớc về liposome Tại ộ môn ào chế, ThS. Nguyễn Văn Lâm đã nghiên cứu và đƣa ra đƣợc công thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome DOX 2 mg/ml. Liposome đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và Chol (7 : 3, tỉ lệ mol), giảm kích thƣớc tiếu phân bằng siêu âm, đổi môi trƣờng ngoài liposome là amoni sulfat bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, tạo ra các liposome có sự chênh lệch pH hai bên màng. Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ thủy tinh có chứa bột đông khô của DOX và ủ ở 50 oC trong 15 phút. Kết quả tạo ra liposome DOX có kích thƣớc dƣới 200 nm, hiệu suất liposome hóa trên 80%. Đánh giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ƣu thế vƣợt trội của thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch, đặc biệt là trên khối u dƣới da [5]. Năm 2014 Nguyễn Thu Trang đã nghiên cứu và xây dựng đƣợc quy trình bào chế liposome DOX 2 mg/ml bằng phƣơng pháp pha loãng ethanol. Công thức bào chế gồm HSPC và Chol (10:3, kl/kl). Quá trình bào chế trải qua các bƣớc: Hòa tan HSPC, Chol trong ethanol và đệm citrat trong nƣớc, tiêm nhanh pha ethanol vào dung dịch đệm kết hợp khuấy trộn bằng máy đồng nhất hóa, cô đặc mẫu bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, đổi đệm bên ngoài liposome bằng HEPES pH 7,4 và gắn dƣợc chất. Liposome thu đƣợc có KTTP < 0,2 µm, PDI ~ 0,2 và hiệu suất liposome hóa đạt 90%. Nghiên cứu đã xây dựng đƣợc quy trình bào chế và đánh giá đƣợc sự ảnh hƣởng của tỉ lệ dung môi, nhiệt độ, ảnh hƣởng của quá trình làm giảm KTTP tới KTTP và hiệu suất liposome hóa. Nghiên cứu cho thấy bào chế liposome bằng phƣơng pháp pha loãng ethanol đã khắc phục đƣợc một số nhƣợc điểm của phƣơng pháp hydrat hóa film nhƣ thời gian bào chế dài, phải sử dụng phƣơng pháp làm giảm kích thƣớc tiểu phân, tuy nhiên phƣơng pháp này cũng còn tồn tại những hạn chế nhất định nhƣ tỉ lệ pha loãng ethanol quá lớn nên phải trải qua giai đoạn cô đặc để giảm thể tích đồng thời chƣa kiểm soát đƣợc lƣợng ethanol tồn dƣ trong chế phẩm thuốc tiêm [9]. 9 Nhìn chung các nghiên cứu trong nƣớc chủ yếu tập trung vào bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của liposome DOX quy ƣớc, chƣa có nghiên cứu nào về các liposome sử dụng dẫn chất polyme nhƣ PEG để làm tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải trong huyết tƣơng. 1.3. Liposome biến đổi bằng cách PE 1.3.1. Khái niệm PE hóa hóa Liposome PEG hóa còn đƣợc gọi là liposome ngụy trang. Để tồn tại lâu trong hệ thống tuần hoàn bề mặt vỏ các liposome đƣợc đƣa thêm nhóm thân nƣớc có kích thƣớc lớn, tƣơng hợp sinh học là PEG nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome để thoát khỏi quá trình opsonin hóa, sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lƣới nội mô tại gan. Các liposome PEG hóa hƣớng đích theo cơ chế thụ động, do thời gian lƣu hành trong tuần hoàn tăng nên thời gian tập trung ở mô đích tăng nhờ hiệu ứng EPR [23], [24], [27], [28]. 1.3.2. Ƣu, nhƣợc điểm của liposome PE Ƣu điểm của liposome PE hóa hóa - Ƣu điểm nổi bật nhất là giảm mạnh hấp thu vào MPS (hệ đại thực bào đơn nhân) và kéo dài thời gian tuần hoàn do đó cải thiện đƣợc sự phân bố vào các mô đƣợc tƣới máu [16], [19]. Blume và các cộng sự đã làm sáng tỏ đƣợc thời gian tuần hoàn trong máu tăng là do giảm tƣơng tác giữa các liposome với các protein trong huyết tƣơng và các protein trên bề mặt tế bào [19]. Liposome biến đổi bề mặt bằng cách PEG hóa sẽ hình thành một lớp nƣớc bao quanh liposome do tƣơng tác giữa polyme – PEG và phân tử nƣớc, nhờ đó mà ngăn cản đƣợc hiện tƣợng opsonin hóa [26], [29]. - Chuỗi PEG trên bề mặt liposome cũng giúp tránh đƣợc hiện tƣợng kết tụ các liposome nên cải thiện đƣợc độ ổn định công thức. Needham và các cộng sự (1992) đã chứng minh rằng sự có mặt của PEG trên bề mặt liposome tạo ra lực đẩy lớn giữa các lớp màng kép, lực này thắng đƣợc lực hút Van der Waals do đó liposome sẽ ổn định hơn nhờ tránh đƣợc lực gây kết tụ [17], [19]. 10 - Khác với liposome quy ƣớc, dƣợc động học của liposome PEG hóa không phụ thuộc vào liều. Việc tăng liều sử dụng ít làm tăng tốc độ thanh thải của thuốc, tốc độ thanh thải chỉ tăng nhanh trong trƣờng hợp liều rất thấp [13]. - Độc tính trên tim, suy tủy, rụng tóc và nôn giảm đáng kể so với doxorubicin truyền thống khi dùng với liều đạt hiệu quả tƣơng đƣơng [19]. Nhƣợc điểm của liposome PE hóa - Việc PEG hóa không giúp liposome hoàn toàn tránh khỏi sự hấp thu của các tế bào thuộc hệ thống lƣới nội mô. Moghimi và Szebeni (2003) đã kiểm tra một cách chính xác những cơ chế để đạt đƣợc thời gian tuần hoàn kéo dài của các liposome “ngụy trang”. Nghiên cứu cho thấy liposome PEG hóa không hoàn toàn trơ về mặt sinh học và đã có một số bằng chứng cho thấy rằng polyme có thể gây ra hoạt hóa hệ thống bổ thể [19]. - Liposome DOX PEG hóa làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu đồng thời cũng làm tăng cả thời gian tiếp cận với các mô lành trong cơ thể, do vậy có khả năng gây ra một số tác dụng không mong muốn khác [18]. 1.3.3. ặc tính của PE PEG là một polyether diol thẳng có nhiều đặc tính hữu ích  Tƣơng thích sinh học với cơ thể,  Hòa tan trong nƣớc và nhiều dung môi hữu cơ,  Độc tính thấp,  Tính kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch thấp,  Thải trừ tốt,  Dễ dàng hợp nhất polyme với lipid [19]. Những đặc tính này cho phép PEG đƣợc ứng dụng nhiều trong lâm sàng bao gồm cả lĩnh vực y sinh hóa [19]. PEG và dẫn chất của nó đƣợc sử dụng rộng rãi để cải thiện dƣợc động học và độ ổn định của các hệ mang thuốc [22]. Khối lƣợng phân tử và cấu trúc của phân tử PEG có thể đƣợc điều chỉnh cho từng mục đích cụ thể [19]. 11 1.3.4. Ảnh hƣởng của thành phần PE lên liposome Ảnh hưởng của tính linh động chuỗi PEG - Độ linh động của chuỗi PEG ảnh hƣởng tới thời gian tuần hoàn của liposome. Độ linh động càng cao thì khả năng ức chế hiện tƣợng opsonin hóa và sự phát hiện của các protein và kháng thể càng cao. Tuy nhiên độ linh động của PEG trên bề mặt liposome rất khó đƣợc đánh giá bằng các phân tích thí nghiệm, tác dụng của độ linh động PEG trên độ ổn định liposome chủ yếu đƣợc thảo luận trên cơ sở mô phỏng tính toán [10]. - Abe.K và các cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu đánh giá sự ảnh hƣởng của cholesterol tới độ linh động của chuỗi PEG với nồng độ cholesterol khảo sát từ 0-30 %mol. Kết quả phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cho thấy sự hợp nhất cholesterol vào trong lớp màng kép lipid làm tăng độ linh động của chuỗi PEG. Ngoài ra độ linh động chuỗi PEG cũng tăng đáng kể khi cholesterol bị loại bỏ khỏi lớp màng kép ở nồng độ trên 20 %mol [10]. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG - Việc sử dụng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR đã chứng minh `phân tử lƣợng của PEG trong PEG-lipids đƣợc gắn lên bề mặt liposome có ảnh hƣởng đến độ linh động của chuỗi PEG tại bề mặt liposome. Khối lƣợng phân tử PEG tăng sẽ làm tăng độ linh động trên bề mặt liposome [10]. - Trong hầu hết các trƣờng hợp, chuỗi PEG dài hơn sẽ làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu tốt hơn. Allen và cộng sự (1991) đã báo cáo rằng nồng độ liposome trong máu cao hơn khi sử dụng liposome SM/PC/Chol/DSPE-PEG với khối lƣợng phân tử PEG lớn hơn (PEG1900, PEG5000) so với liposome chứa PEG-lipid với PEG chuỗi ngắn hơn (ví dụ PEG750, PEG120). Sử dụng PEG2000 thu đƣợc gấp đôi lƣợng lipid còn lại trong huyết tƣơng so với công thức có PEG phân tử lƣợng 350 tới 750 [19]. - Một số nghiên cứu gần đây đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng độ dài chuỗi PEG của các liposome đƣợc PEG hóa lên thời gian bán thải ở invivo. Dos Santos và các cộng sự đã thấy rằng các liposome đƣợc PEG hóa với 5 %mol PEG350, PEG550, PEG750 thu
- Xem thêm -