Tài liệu Nghiên cứu bào chế Liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THUÝ NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THUÝ NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Văn Lâm 2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Văn Lâm ThS. Nguyễn Tuấn Quang Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Phạm Thuý Ngọc Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2 1.1. Về liposome .................................................................................................. 2 1.1.1. Khái niệm ............................................................................................2 1.1.2. Thành phần của liposome ....................................................................2 1.1.2.1. Phospholipid .....................................................................................2 1.1.2.2. Cholesterol và dẫn chất .....................................................................3 1.1.2.3. Dược chất và một số chất khác .........................................................5 1.1.3. Các phương pháp bào chế liposome ....................................................5 1.1.3.1. Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp pha loãng ethanol) ......5 1.1.3.2. Phương pháp hydrat hoá film ...........................................................7 1.1.3.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo ..........................................................8 1.1.3.4. Một số phương pháp bào chế liposome khác: ..................................8 1.2. Về amphotericin B ....................................................................................... 8 1.2.1. Công thức hoá học và tính chất lý hoá ................................................8 1.2.2. Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng .................................................9 1.2.3. Một số chế phẩm chứa amphotericin B trên thị trường.....................10 1.3. Về liposome amphotericin B ..................................................................... 12 1.3.1. Lịch sử phát triển liposome amphotericin B .....................................12 1.3.2. Cơ chế và tác dụng của liposome amphotericin B ............................12 1.3.3. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B. .....................13 1.3.3.1. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B trên thế giới ... ........................................................................................................13 1.3.3.2. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphoteicin B tại Việt Nam ... ........................................................................................................14 Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu .................. 16 2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18 2.3.1. Phương pháp bào chế liposome amphoteiricin B ..............................18 2.3.2. Phương pháp đánh giá liposome amphotericin B .............................18 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN ................................ 21 3.1. Nghiên cứu lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế ................ 21 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện hoà tan của amphotericin B ............21 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cô đặc thể tích .................23 3.1.2.1. Đánh giá đặc tính lipsome phụ thuộc vào quá trình lọc tiếp tuyến 23 3.1.2.2. Đánh giá hàm lượng amphotericin B tự do ....................................25 3.2. Khảo sát ảnh hưởng một số thông số của quy trình bào chế tới đặc tính liposome ................................................................................................................ 26 3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước ..........................26 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phối hợp hai pha ........................................29 3.2.3. Ảnh hưởng của lực khuấy trộn hai pha .............................................30 3.3. Đề xuất quy trình bào chế liposome amphotericn B .............................. 32 3.3.1. Quy trình bào chế ..............................................................................32 3.3.2. Đánh giá đặc tính liposome amphotericin B sau bào chế .................34 3.4. Bàn luận ...................................................................................................... 35 3.4.1. Về phương pháp đánh giá..................................................................35 3.4.2. Về lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế .........................35 3.4.3. Về khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng tới quy trình bào chế .................37 3.4.4. Về đặc tính liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol ... ...........................................................................................................39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 41 Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ TT Viết tắt 1 ACN Acetonitril 2 AmB Amphotericin B 3 AUC Diện tích dưới đường cong 4 BHA Butylat hydroxyanisol 5 BHT Butylat hydroxytoluen 6 Chol Cholesterol 7 DMA N,N-dimethylacetamid 8 DMPC α-Dimyristoylphosphatidylcholin 9 DMPG l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 10 DMSO Dimethyl sunfoxid 11 DOPC Dioleyl phosphatidylcholin 12 DOPE Dioleyl phosphatidylethanolamin 13 DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholin 14 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) 15 DSPC Distearoylphophatidylcholin 16 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 17 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 18 HPLC 19 HSPC 20 IC50 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholin) Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory concentrations) Kích thước tiểu phân 21 KTTP 22 L-AmB 23 LD50 Liều gây chêt trung bình 24 LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp 25 Lo 26 LTT Lọc tiếp tuyến 27 N/D Nước/dầu 28 NMR Chụp cộng hưởng từ hạt nhân 29 NSX Nhà sản xuất 30 PC Phosphotidylcholin 31 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 32 PE Phosphatidylethanolamin 33 PG Phosphatidylglycerol 34 PS Phosphotidylserin 35 SEM 36 SPC 37 Tc 38 TEM 39 TKHH 40 TLC Sắc kí bản mỏng 41 USP United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 42 UV Tử ngoại 43 VLDL Lipoprotein tỷ trọng rất thấp 44 Zaverage Kích thước tiểu phân trung bình Liposome amphotericin B Trạng thái tinh thể lỏng sắp xếp một cách có trật tự Kính hiển vi điển tử quét ( Scanning electron microscope) Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholin) Nhiệt độ chuyển dạng Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) Tinh khiết hóa học Danh mục các bảng Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B 11 Bảng 2.1 Nguyên liệu 16 Bảng 3.1 Các điều kiện chuẩn bị pha ethanol 22 Bảng 3.2 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome 24 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào quá trình lọc tiếp tuyến Bảng công thức bào chế các mẫu liposome có tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước khác nhau Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào nhiệt độ pha nước Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào lực phân tán hai pha Đặc tính các mẫu liposome sau bào chế 24 26 27 29 31 34 Danh mục các hình vẽ, đồ thị Số hiệu Hình 1 Hình 2 Hình 3 Hình 4 Tên hình vẽ Sự phân bố của cholesterol và phospholipid trong lớp màng liposome Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol Công thức hoá học của amphotericin B Chuẩn bị pha ethanol có và không sử dụng điều kiện hoà tan Phân bố KTTP theo thể tích các công thức M8.33, M10.33, M15.33, M20.33 Phân bố KTTP theo thể tích các công thức M4.33, M6.33, Hình 5b M8.33 Hình 6 Sơ đồ tóm tắt các bước tiến hành quy trình Hình 5a Hình 7 Ảnh chụp TEM của chế phẩm liposome AmB Trang 4 6 9 22 27 28 33 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế kỉ 20-21 có thể nói là thời gian bùng nổ của ngành công nghệ nano. Các ứng dụng của ngành công nghệ này đã đem lại những hiệu quả mạnh mẽ, phong phú và đa dạng. Đặc biệt trong công nghệ Dược, nano đã trở thành một xu hướng nghiên cứu được đông đảo các nhà khoa học đón nhận và hưởng ứng. Sự ra đời của liposome là một trong những thành quả lớn theo xu hướng này. Liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao, khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tác dụng, tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của thuốc. Bởi vậy, nghiên cứu và ứng dụng liposome như một mảnh đất mới mẻ, thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của giới khoa học trên thế giới cũng như Việt Nam. Amphotericin B là dược chất được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng, nhưng gây tác dụng phụ rất nặng nề trên nhiều cơ quan, đặc biệt là thận. Tuy nhiên khi bào chế amphotericin B dưới dạng liposome, các nhà khoa học nhận thấy chế phẩm mang những thay đổi lớn về tính chất dược lý theo chiều hướng tích cực, tác dụng hiệu quả trong việc giảm độc tính thuốc và giúp tăng liều điều trị. Tại Bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội đã có các nghiên cứu về liposome amphotericin B bằng phương pháp hydrat hoá phim và bốc hơi pha đảo. Để phát huy ưu điểm, đồng thời giải quyết một số nhược điểm trong nghiên cứu trước, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol” tiến hành nhằm mục tiêu: + Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol. + Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính liposome amphotericin B. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Về liposome 1.1.1. Khái niệm Liposome là dạng đặc biệt của vi nang, bao gồm một vỏ phospholipid kép có đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [1]. 1.1.2. Thành phần của liposome 1.1.2.1. Phospholipid Là thành phần cơ bản cấu tạo nên liposome, có bản chất lưỡng tính vừa thân dầu vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo no hoặc không no. Khi các phospholipid tự đóng vòng để tạo thành liposome thì đầu phân cực sẽ hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước, chuỗi acid béo sẽ quay vào trong, tạo ra lớp lipid kép [1]. Các phospholipid gồm nhiều loại: + Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecitin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidyl serin (PS), phosphatidylglycerol (PG),… + Phospholipid tổng hợp: Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), Disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), Dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), Dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE), Dipalmitoyl phosphatidylcholin (DPPC),… + Một số lipid khác như sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin,…) Khi lựa chọn phospholipid cần chú ý: + Mức độ bão hòa: Các phospholipid không no (phosphatidylcholin lòng trắng trứng, phosphatidylglycerin,..) dễ bị oxy hóa dẫn đến hỏng màng, gây rò 3 rỉ dược chất, ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome. Vì thế, khi bào chế phải thêm các chất chống oxy hóa như tocoferol, BHA, BHT,… + Khả năng tích điện: Phospholipid tích điện sẽ tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ liposome nên làm tăng dung tích của khoang nước, do đó làm tăng khả năng đưa các dược chất thân nước vào liposome, đồng thời tạo lực liên kết tĩnh điện với dược chất. + Nhiệt độ chuyển dạng: Liên quan đến hiện tượng chuyển pha của phospholipid (xảy ra ở nhiệt độ nóng chảy mà tại đó phân tử lipid chuyển từ trạng thái gel có cấu trúc bền vững sang trạng thái tinh thể lỏng với cấu trúc lỏng lẻo). Nhiệt độ chuyển pha của lipid phụ thuộc vào chiều dài và mức độ no của chuỗi acid béo cũng như đặc điểm của nhóm phân cực. Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có Tc>37ºC. + Mức độ tinh khiết: Tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng mà có thể lựa chọn các loại phospholipid có độ tinh khiết khác nhau phù hợp do các nhà sản xuất khác nhau cung cấp sẵn trên thị trường. 1.1.2.2. Cholesterol và dẫn chất Cholesterol được cho vào thành phần bào chế liposome với tỷ lệ thích hợp để làm tăng độ vững chắc cho màng liposome và có tác dụng như một hệ đệm lỏng, điều chỉnh thể chất của lớp lipid kép, làm giảm tính thấm nước của liposome. Như vậy, tỷ lệ giữa phospholipid và cholesterol có vai trò quan trọng, quyết định đặc điểm và sự ổn định của màng. Nếu không có cholesterol thì lớp phospholipid sẽ dễ tương tác với protein huyết tương như albumin, transferin,…làm giảm độ ổn định của liposome. Có thể phối hợp cholesterol với phospholipid với tỷ lệ rất cao (100- 200%) nhưng trong liposome thì tỷ lệ này thường là 20- 30%, tỷ lệ cholesterol quá cao cũng có thể ảnh hưởng ngược lại đối với sự bền vững của màng. Sự phân bố của 4 cholesterol và phospholipid trong cấu trúc lớp màng liposome được thể hiện ở Hình 1. Phospholipid được kí hiệu giống hình ô với cấu trúc lưỡng thân, đầu thân nước hướng ra ngoài, đầu kị nước hướng vào trong, . Cholesterol được kí hiệu hình tròn, nằm phân bố vào trong lớp kép phospholipid. Hình 1: Sự phân bố của cholesterol và phospholipid trong lớp màng liposome [1]. Các phân tử phospholipid có một đầu hướng ra môi trường nước, phần đuôi hướng vào phía bên trong. Các phân tử cholesterol xếp xen kẽ giữa phần đuôi của các phân tử phosphlipid và được “che” bởi sự sắp xếp liên tục của các phần đầu phân tử phospholipid (1a), màng có cấu trúc ổn định khi tỷ lệ cholesterol và phospholipid phù hợp (1b), khi tỷ lệ cholesterol dư thừa sẽ đẩy tách phần đầu của các phân tử phospholipid làm cho phospholipid không che được cholesterol phía bên trong (1c), khi cholesterol tiếp xúc với nước sẽ kết tinh tạo thành mảng cholesterol monohydrat làm ảnh hưởng đến sự ổn định của lớp màng cholesterol (1d). Ngoài cholesterol có thể dùng các dẫn chất khác của sterol như hydroxycholesterol, acid cholestenoic,…để kết hợp với phospholipid khi bào chế liposome [1]. 5 1.1.2.3. Dược chất và một số chất khác Dược chất được dùng trong bào chế các dạng thuốc liposome khá đa dạng, thường là các dược chất cần tập trung tại đích, các dược chất khó thấm như dược chất điều trị ung thư, một số kháng sinh, enzyme; hoặc để giảm độc tính của thuốc như amphotericin B. Dược chất có thể được gắn vào liposome theo một trong hai cách là gắn thụ động (thực hiện trong quá trình tạo liposome) hoặc gắn chủ động (thực hiện sau khi đã hình thành liposome). Do liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân dầu và thân nước nên hệ vận chuyển này thích hợp với diện rộng dược chất. Một số liposome còn sử dụng các chất khác làm thay đổi đặc tính của vỏ liposome như các polyme thân nước (kéo dài thời gian tuần hoàn), các chất diện hoạt (để tăng tính thấm qua da),…[1], [4], [5]. 1.1.3. Các phương pháp bào chế liposome 1.1.3.1. Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp pha loãng ethanol) Phương pháp được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn gọi là phương pháp pha loãng ethanol, hoặc phương pháp tiêm ethanol. Trong các phương pháp bào chế liposome, phương pháp pha loãng ethanol có ưu điểm nổi bật là tạo ra liposome kích thước nhỏ, tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm. Quy trình bào chế của phương pháp này khá đơn giản: Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol. Bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước hoặc hệ đệm, vừa bơm vừa khuấy [7]. Cơ chế của phương pháp được sơ lược trong Hình 2 như sau: 6 PL tự do trong Lớp kép PL Lớp kép PL lớn ethanol trong nước lên về kích Liposome thước Hình 2: Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol [20]. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol được mô tả trải qua bốn giai đoạn chính. Giai đoạn 1: phospholipid hoà tan trong ethanol, tồn tại ở trạng thái tự do. Giai đoạn 2: khi tiêm nhanh dung dịch pha ethanol vào nước, ethanol nhanh chóng pha loãng hoặc chuyển thành pha khí, chuyển phospholipid sang pha nước. Ở trong pha nước, phospholipid có xu hướng tập hợp thành lớp kép. Giai đoạn 3: lớp kép phospholipid lớn lên về kích thước. Giai đoạn 4: lớp kép đóng vòng thành liposome. Mỗi giai đoạn đều đóng vai trò quan trọng trong hình thành liposome. Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành và kích thước lớp kép sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kích thước liposome. Bởi vậy trong phương pháp pha loãng ethanol, các yếu tố ảnh hưởng tới giai đoạn phối hợp dung dịch phospholipid vào nước cũng ảnh hưởng nhiều tới đặc tính liposome. Các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng tạo liposome theo phương pháp này có thể là: nồng độ phospholipid trong ethanol, đường kính bơm tiêm, áp suất bơm, môi trường tạo liposome, tốc độ khuấy môi trường,…[11], [13], [23], [24], [29]. Các dung môi có thể thay thế ethanol trong phương pháp này là propanol, isopropanol, glycerin, propylen glycol,… 7 Dược chất được liposome hoá bằng phương pháp pha loãng ethanol cũng rất đa dạng. Dược chất có thể được gắn theo cơ chế thụ động (gắn trong quá trình tạo liposome): dược chất thân nước được hoà tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hoà tan trong pha alcol. Dược chất cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động (tạo liposome trước rồi nạp dược chất sau): thường áp dụng với dược chất thân nước. Theo cơ chế thụ động, dược chất thân dầu đạt được hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~100%), còn dược chất thân nước đạt hiệu suất gắn rất thấp (~16%); kích thước và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất. Từ đó cho thấy, phương pháp pha loãng ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hoá dược chất thân dầu [16]. Liposome thu được có kích thước nhỏ (khoảng 100nm), tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm [1], [7], [23]. Bởi phương pháp pha loãng ethanol là phương pháp có các ưu điểm: quy trình đơn giản, cho liposome kích thước nhỏ, đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm, đặc biệt thích hợp với dược chất thân dầu nên nghiên cứu đã chọn phương pháp này để bào chế liposome AmB. 1.1.3.2. Phương pháp hydrat hoá film Phương pháp này ra đời sớm hơn phương pháp pha loãng ethanol, do Bangham đề xuất, cho đến nay đây vẫn là một phương pháp được sử dụng nhiều vì tính tiện ích, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị kỹ thuật cao. Quy trình tiến hành qua các bước sau: Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (chloroform, methanol, dicloroethan…). Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay ở nhiệt độ thích hợp, phospholipid sẽ tạo thành màng mỏng bám lên thành bình cất quay. Thêm dung dịch nước có hệ đệm để hydrat hóa, quay hoặc lắc mạnh để tạo thành liposome. Dược chất được phối hợp vào liposome trong quá trình điều chế: Dược chất 8 thân nước thì hòa vào dung dịch nước, dược chất thân dầu thì cho vào dung dịch phospholipid. So với phương pháp pha loãng ethanol, liposome thu được thường là loại nhiều lớp, có kích thước không đồng nhất (từ 50 -1000nm) [1], [5]. 1.1.3.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo Phương pháp này đưa ra bởi Szoka và Papahadjopoulos. Quy trình tiến hành qua các bước: Hòa tan phospholipid trong dung môi hữu cơ (hay dùng ether). Cho thêm dung dịch nước rồi tác động bằng siêu âm ở tần số phù hợp để tạo nhũ tương mịn N/D. Bốc hơi dung môi ether dưới áp suất giảm để thu được các liposome. So với phương pháp pha loãng ethanol, liposome được tạo thành bằng phương pháp này thường có cấu trúc đa lớp, kích thước tiểu phân lớn, ít đồng nhất [1], [5], [22]. 1.1.3.4. Một số phương pháp bào chế liposome khác: - Phương pháp pha loãng ether. - Phương pháp pha loãng polyol. - Phương pháp đông khô. - Phương pháp hòa tan và thẩm tách chất diện hoạt. - Phương pháp sử dụng kênh vi lỏng. - Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn. - Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn [1], [20]. 1.2. Về amphotericin B 1.2.1. Công thức hoá học và tính chất lý hoá Kháng sinh chống nấm amphotericin B (AmB) được giới thiệu vào giữa những năm thập kỷ 50 và cho đến nay đã trở thành thuốc đầu tay trong kiểm soát nhiễm nấm toàn thân, có công thức cấu tạo như Hình 3. 9 Công thức phân tử: C47H73NO17. Khối lượng phân tử: 924,08 pKa: 5,5; 10 Hình 3: Công thức cấu tạo của amphotericin B AmB là kháng sinh tự nhiên thuộc nhóm polyen, có tính lưỡng tính bởi nhóm amin và nhóm carboxylic tự do trong phân tử, có tính chất lưỡng cực bởi vòng cồng kềnh chứa hệ nối đôi liên hợp và đường amin. Do vậy AmB rất khó tan trong hầu hết các dung môi ở pH trung tính: AmB không tan trong nước, hầu như không tan trong các alcol, tan trong dimethyl sunfoxide (DMSO) [2]. 1.2.2. Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng Cơ chế tác dụng của AmB, cũng như của các polyen khác, dựa trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AmB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm, tạo các kênh trên màng tế bào. Bởi vậy làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng, rò rỉ các tế bào chất ra ngoài và cuối cùng gây chết tế bào nấm. Bên cạnh khả năng liên kết với ergosterol, AmB cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người. Ái lực của AmB với ergosterol màng lớn hơn với cholesterol màng nên AmB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương trên thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu, đái nhạt…[3], [5], [15]. Amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số nấm như: Absidia spp, Aspergillus spp, Basidiobolus Coccidioides immitis, Conidiobolus spp, Blastomyces dermatitis spp, spp, Cryptococcus neoformans 10 Histoplasma capsulatum, Mucor spp, Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus spp, Rhodotorula spp và Sporothrix schenckii. Mức độ nhạy cảm của nấm với amphotericin B liên quan đến nồng độ ergosterol có trong màng bào tương của nấm. Trên in vivo, nồng độ trong khoảng từ 0,03 - 1 microgram/ml có thể ức chế hoàn toàn đa số các loại nấm này. Trên in vitro, với liều dùng trong lâm sàng thuốc chỉ kìm nấm, nếu muốn diệt nấm phải có nồng độ trong huyết thanh gây độc [3], [5]. Bởi hạn chế hấp thu qua đường tiêu hoá, AmB được dùng chủ yếu qua đường tiêm tĩnh mạch. Liều dùng cho AmB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày. Các tác dụng phụ có dấu hiệu gia tăng khi liều vượt quá 35mg/ngày [3], [5], [15]. 1.2.3. Một số chế phẩm chứa amphotericin B trên thị trường Một số chế phẩm AmB đã được lưu hành trên thị trường và ứng dụng rộng rãi, giúp kiểm soát tốt tình trạng nhiễm nấm toàn thân, đặc biệt điều trị bội nhiễm ở bệnh nhân HIV-AIDs. Các tính chất của chế phẩm được tổng hợp ở Bảng 1.1 [19]: