Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế phẩm có chứa chất kích ứng miễn dịch lên khả năng kháng bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú e. coioides

h a n g e Vi e N y to k lic .c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong bản luận văn này là kết quả nghiên cứu thực sự của cá nhân dưới sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo hướng dẫn tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố dưới hình thức nào trước khi trình bảo vệ. Tác giả Võ Thị Dung .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to i w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c LỜI CÁM ƠN Trước tiên Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản 3, Hợp phần Bệnh cá - Dự án “ Nuôi Thuỷ sản và Quản lý ven bờ – NUFU” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và vật chất cho tôi hoàn thành khoá học này. Nhân đây tôi xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ tạo điều kiện của Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện NCNTTS 3 đã giúp đỡ tôi về trang thiết bị, cơ sở thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ. Nguyễn Hữu Dũng người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu của Tiến sĩ Lưu Thị Dung, Tiến sĩ Đỗ Thị Hòa và bạn bè đồng nghiệp trong quá trình thực hiện luận đề tài tốt nghiệp. Và xin cám ơn sự truyền đạt những kiến thức quý báu của các thầy cô giáo đã tham gia giảng dạy khoá học. Cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu sắc nhất đến những người thân yêu của tôi đã luôn động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Võ Thị Dung .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to ii w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................................i LỜI CÁM ƠN................................................................................................................. ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. VÀI NÉT VỀ LOÀI CÁ NGHIÊN CỨU (SERRANIDAE) .....................................3 1.1.1 Hệ thống phân loại ................................................................................................3 1.1.2. Vài nét về tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam.......................................................3 1.2. Tình hình nghiên cứu về bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú.............................3 1.2.1. Trên thế giới..........................................................................................................3 1.2.2. Ở Việt Nam............................................................................................................4 1.3. Hiện trạng về các biện pháp phòng trị bệnh lở loét cho cá mú..........................5 1.4. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá xương ..............................................................7 1.5. Tình hình sử dụng chất kích ứng miễn dịch trong nuôi trồng thủy sản ...........9 1.5.1. Trên thế giới..........................................................................................................9 1.5.2. Ở Việt Nam..........................................................................................................13 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................14 2.1. Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu.........................................................14 2.1.1. Địa điểm thực hiện .............................................................................................14 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .........................................................................................14 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................14 2.1.3.1. Cá mú nghiên cứu.............................................................................................14 2.1.3.2. Chế phẩm sử dụng nghiên cứu .........................................................................14 2.1.3.3. Vi khuẩn dùng thử thách...................................................................................15 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..........................................................................15 2.2.1. Điều kiện thí nghiệm ..........................................................................................15 2.2.2. Chế độ cho ăn .....................................................................................................17 2.2.3. Thí nghiệm công độc ..........................................................................................17 2.3. Phương pháp xác định khả năng kháng bệnh ...................................................20 .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to iii w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic 2.3.1. Phương pháp xác định tỷ lệ cá bị bệnh, tỷ lệ chết tích lũy ...............................20 2.3.2. Phương pháp xác định chỉ số RPS và LD50 ......................................................20 2.4. Phương pháp xác định công thức bạch cầu máu cá ..........................................21 2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................................21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................22 3.1. Kết quả theo dõi tỷ lệ và mức độ biểu hiện bệnh sau khi thách thức..............22 3.1.1. Kết quả theo dõi tỷ lệ và mức độ biểu hiện bệnh sau khi thử thách ( đợt 1) ...22 3.1.2. Kết quả theo dõi tỷ lệ và mức độ biểu hiện bệnh sau khi thử thách (đợt 2) ....27 3.1.3. Kết quả phân lập trở lại trên các mẫu cá bị bệnh sau khi công cường độc ....30 3.2. Tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS và LD50.................................................................32 3.2.1. Tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS và LD50 ...............................................................32 3.3. Biến đổi công thức bạch cầu ................................................................................34 3.3.1. Sự biến đổi công thức bạch cầu đợt 1 ..............................................................34 3.3.1. Sự biến đổi công thức bạch cầu đợt 2 ...............................................................36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .....................................................41 4.1. Kết luận..................................................................................................................41 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................42 .d o m C w o o c u -tr a c k w w .d o m C lic k to iv w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, sinh hoá của vi khuẩn nuôi cấy phân lập trên mẫu cá mú bị bệnh bằng Test kit API 20E ......................................................................................31 Bảng 3.2: Tỷ lệ sinh tồn tương đối và giá trị LD50 của cá mú E.coioides sau 14 ngày thử thách vi khuẩn V.alginolyticus. ...............................................................................33 Bảng 3.3: Công hức bạch cầu máu cá mú E. coioides ở các nghiệm thức thí nghiệm và nghiệm thức đối chứng ở các ngày 1, 14, 21 và 28 của đợt thí nghiệm 1.....................35 Bảng 3.4: Công hức bạch cầu máu cá mú E.coioides ở các nghiệm thức thí nghiệm và nghiệm thức đối chứng ở các ngày 1, 14, 21 và 28 của đợt thí nghiệm 2.....................37 .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to v w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Chế phẩm Vime glucan for fish ...................................................................14 Hình 2.2: Chế phẩm Glumin ..........................................................................................1 Hình 2.3: Chế phẩm Betami ...........................................................................................1 Hình 3.1: Bể nuôi thuần và bể thí nghiệm......................................................................1 Hình 3.2: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 104 cfu/ml (đợt 1)...........................1 Hình 3.3: Cá mú bị bệnh ở thể nhẹ (A) và cá bị bệnh ở thể nặng (B) sau khi cảm nhiễm vi khuẩn V. alginolyticus ...............................................................................................24 Hình 3.4: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 105 cfu/ml (đợt 1).........................24 Hình 3.5: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 106 cfu/ml (đợt 1).........................25 Hình 3.6: Cá bị bệnh với dấu hiệu lở loét trên thân và gan tím bầm ..............................1 Hình 3.7: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 104 cfu/ml (đợt 2).........................27 Hình 3.8: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đên ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 105 cfu/ml (đợt 2).........................28 Hình 3.9: Tỷ lệ cá bị bệnh (A) và tỷ lệ chết tích lũy (B) từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 14 sau khi tiêm vi khuẩn V. alginolyticus ở mật độ 106 cfu/ml (đợt 2)................. Error! Bookmark not defined. Hình 3..10 : Một số hình ảnh đặc điểm vi khuẩn V. alginolyticus phân lập trên các mẫu cá mú bị bệnh xuất huyết lở loét sau khi thử thách. ......................................................32 Hình 3.11: Một số hình ảnh tế bào bạch cầu máu cá mú E. coioides............................34 .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to vi w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic ĐẶT VẤN ĐỀ Khánh Hoà là tỉnh có nghề nuôi cá biển khá phát triển ở Việt Nam; cá mú là đối tượng có giá trị kinh tế cao đang được nuôi ở nhiều nơi trong địa bàn tỉnh như Cam Ranh, Cửa Bé, Vũng Ngán, Vạn Ninh,… với các hình thức nuôi lồng trên biển và nuôi trong ao đất. Gần đây, nghề nuôi cá mú gặp nhiều khó khăn do dịch bệnh gây ra. Cá mú nuôi bị bệnh có thể chết rải rác đến hàng loạt, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi [3, 15]. Trong đó, bệnh xuất huyết lở loét là bệnh rất thường gặp trên cá mú nuôi tại Khánh Hòa [3,15]. Tác nhân gây bệnh được xác định là do vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus [15, 70], V. anguillarum [3]. Bệnh xẩy ra ở hầu hết các giai đoạn của cá; vì thế, tìm ra phương pháp phòng bệnh hợp lý có thể hạn chế được những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết. Thực tế hiện nay, trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng hóa chất hoặc kháng sinh để phòng - trị bệnh; và đã có rất nhiều loại thuốc và kháng sinh được người nuôi sử dụng, song việc sử dụng kháng sinh tràn lan có thể gây hiện tượng lờn thuốc mà không mang lại hiệu quả. Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm có thể gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người và làm giảm giá trị sản phẩm. Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả kinh tế cao trong quá trình sản xuất, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để phòng bệnh như sử dụng vaccine, chế phẩm sinh học hoặc chất kích ứng miễn dịch (Immunostimulants) nhằm làm tăng khả năng miễn dịch cho cá. Trên thế giới, người ta đã nghiên cứu sử dụng thành công một số sản phẩm như Beta glucan, Glucan, Vitamin C [106], Chitin, Chitosan, Levamisole [114], … để tăng khả năng miễn dịch cho cá kháng lại nhiều loại bệnh do vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng gây ra. Tuy nhiên, ở nước ta vẫn chưa có một nghiên cứu nào về mức độ ảnh hưởng của những chế phẩm này đối với việc kích ứng miễn dịch trên cá mú, nhằm chống lại bệnh xuất huyết, lở loét. Được sự đồng ý của Bộ Giáo dục và Đào tạo, trường Đại học Thuỷ Sản, hội đồng xét duyệt đề cương luận văn cao học ngành Nuôi trồng thuỷ sản và Thầy giáo hướng dẫn, tôi được phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 1 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic phẩm có chứa chất kích ứng miễn dịch lên khả năng kháng bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú E. coioides” Mục tiêu của đề tài: Xác định được hiệu quả của 3 chế phẩm Vime glucan, Glumin và Betami đối với khả năng kháng bệnh xuất huyết lở loét của cá mú Epinephelus coioides. Nội dung của đề tài: 1. Ảnh hưởng của các chất kích ứng miễn dịch đến tỷ lệ và mức độ nhiễm bệnh trên cá mú E. coioides sau khi cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết lở loét. 2. Xác định liều gây chết LD50, tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS của cá mú thí nghiệm sau khi cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh lở loét. 3. Ảnh hưởng của các chất kích ứng miễn dịch đến sự biến đổi công thức bạch cầu máu cá mú E. coioides. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Ý nghĩa khoa học: Bổ sung những tư liệu về miễn dịch và khả năng phòng bệnh của một số sản phẩm kích ứng miễn dịch trên cá từ dó có cơ sở phòng bệnh trên cá mú nuôi. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc phòng bệnh trên cá mú, nhằm mang lại lợi ích kinh tế, bảo vệ môi trường, góp phần tạo ra một nghề nuôi bền vững. Do kiến thức, kinh nghiệm của bản thân về vấn đề nghiên cứu còn nhiều hạn chế, bản luận văn sẽ không thể trách khỏi sai sót. Mong quý thầy cô và bạn đọc góp ý để Luận văn được hoàn chỉnh hơn, tôi xin chân thành cám ơn! .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 2 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về loài cá nghiên cứu (Serranidae) 1.1.1 Hệ thống phân loại Ngành: Chordata Lớp cá xương: Osteichthyes Lớp phụ vây tia: Actinoterggii Bộ cá Vược: Perciformes Họ cá mú: Serranidae Giống: Epinephelus Bloch, 1793 Loài: E. coioides Forskal, 1775 Cá mú E. coioides thuộc loài cá dữ, trong tự nhiên chúng ăn giáp xác, cá và động vật thân mềm. Khả năng bắt mồi của cá mú giảm khi nhiệt độ nước thấp hơn 180C và tốt nhất ở 22-300C [14, 52]. 1.1.2. Vài nét về tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam Ở Việt Nam nghề nuôi cá mú mới tiến hành từ năm 1989. Cá mú được nuôi tập trung ở các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hoà, Bình Thuận, Vũng Tàu với các hình thức nuôi lồng trên biển và nuôi trong ao đất [2]. Nguồn giống chủ yếu thu từ tự nhiên, giống nhập nội (phần lớn từ Đài Loan), và một lượng nhỏ từ sản xuất nhân tạo trong nước. Năm 2003, cả nước có khoảng 6.800 lồng nuôi cá biển, 80% trong số đó là những lồng nuôi cá mú; ngoài ra còn khoảng 500 ha vùng ven bờ được sử dụng để nuôi cá mú trong ao đìa. Nghề nuôi cá mú đã tạo ra khoảng 3.000 tấn cá mú thương phẩm, mang lại 300 tỷ đồng/năm; Tuy nhiên, nghề nuôi cá mú thường gặp nhiều khó khăn do dịch bệnh và thiệt hại do dịch bệnh gây ra là rất lớn [9]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú 1.2.1. Trên thế giới Trong những năm qua, nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã phát triển rất mạnh mẽ, sản lượng của nghề này đã tăng gấp đôi chỉ trong vòng một thập kỷ qua [45]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của nuôi trồng thủy sản là sự bùng phát của dịch bệnh, và thiệt hại do dịch bệnh gây ra có thể ước tính đến hàng triệu USD [28]. Năm 1993, ở Singapore chỉ với 2 trại cá mú nuôi thâm canh bị bệnh đã gây thiệt hại tổng cộng 360.500 đô la Singapore [37]; Theo Somga và cs (2001), ở Philippines có .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 3 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic tới 88,3% hộ nuôi cá mú bị tổn thất do dịch bệnh gây ra [97]. Ở Thái Lan cũng có khoảng 82,0% hộ nuôi cá hồng, cá mú bị thua lỗ do dịch bệnh [85]. Kết quả nghiên cứu của Chong (2001), con số này ở Hồng Kông là 95,0%, trong đó tác hại do bệnh lở loét chiếm 68,0% và gây tỷ lệ tử vong đến 72,0% số cá nhiễm [36]. Theo BodadReantaso và cs (2001), dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở Malaysia làm thiệt hại khoảng 20 triệu Ringít [28]. Xuất huyết lở loét là bệnh thường bắt gặp trên cá mú và tác nhân được xác định là vi khuẩn Vibrio. Vi khuẩn Vibrio nhiễm vào máu và làm cho cá bị xuất huyết. Bệnh thường kết hợp với các bệnh khác như bệnh mụn đỏ do vi khuẩn Streptococcus sp. gây ra. Bệnh lở loét do Vibrio gây ra đã được công bố ở cá mú Chấm Nâu (Epinephelus malabaricus), cá mú Đen (E. coioides), cá mú Mỡ (E. tauvina ) và cá mú Mè (E. bleekeri) làm thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá mú ở Brunei, Darussalam, Malaysia, Đài Loan, Hồng Kông, Indonesia, Kuwait, Singapore, Philippines, Thái Lan [102]. Bệnh thường xảy ra vào mùa hè, khi nhiệt độ nước lên cao [18], [20], [54], [102], [103]. Tác nhân gây bệnh vibriosis là Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus và V. carchariae. Trường hợp bị nhiễm bởi V. carchariae, cá bị viêm dạ dày, ruột biểu hiện là sự căng phồng ruột và có thể quan sát thấy chất dịch màu vàng [102]. Theo Leong và Wong (1990), hai loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus thường bắt gặp trên các mẫu cá mú nuôi ở Malaysia bị bệnh [60]. Trong một nghiên cứu khác trên cá mú ở Singapore, Leong (1994) cũng thấy rằng bệnh nhiễm trùng máu gây ra trên cá mú cũng là hai loài vi khuẩn nói trên [62]. Cá bị bệnh nhiễm trùng xuất huyết (Vibriosis) thường có các dấu hiệu: bỏ ăn, màu sắc thân sậm lại, bơi gần mặt nước, có thể ở trạng thái mất cân bằng, chỗ hoại tử có thể bị xuất huyết, vây bị hoại tử, mắt lồi đục, chảy máu trong khoang bụng do sự xuất huyết ở các cơ quan nội tạng [103]. 1.2.2. Ở Việt Nam Trong thời gian gần đây có một số công trình công bố về bệnh ở cá mú (Vo The Dung và cs. 2008a; Vo The Dung và cs. 2008b; Vo The Dung và cs. 2011), nhưng các công trình này đều tập trung về ký sinh trùng. Công trình nghiên cứu đầu tiên về bệnh lở loét ở cá mú do Nguyễn Thị Thanh Thùy (2005) thực hiện, kết quả của nghiên cứu này cho thấy, xuất huyết lở loét là bệnh thường gặp nhất trên cá mú, ở Nha Trang có tới 83,3% và ở Cam Ranh có 77,8% số hộ nuôi gặp bệnh này, bệnh lây lan rất nhanh .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 4 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic và có khả năng gây chết trên 50,0% cá nuôi, Ở hình thức nuôi lồng tỷ lệ mắc bệnh này thường cao hơn nuôi ao do mật độ cao, cá dễ bị trầy xước do cọ sát vào thành lồng hoặc do thao tác san lồng, chất lượng môi trường nước xấu [15]; Theo Đỗ thị Hòa và cs (2008), tần số bắt gặp bệnh xuất huyết lở loét Vibriosis ở Khánh Hòa là 40/65 hộ [3]. Bệnh lở loét trên cá mú ở Khánh Hòa thường có những triệu chứng cá bị tróc vẩy, xuất huyết vây ngực, vây bụng, vây hậu môn, vây lưng thường bị tưa rách, vây đuôi mòn cụt, hậu môn sưng đỏ, mắt, miệng bị xuất huyết, lở loét. Những con bệnh nặng có nhiều chỗ bị xuất huyết hoặc lở loét, thậm chí lòi phần cơ ra ngoài. Triệu chứng ban đầu là chuyển sang màu đậm hơn, bơi lờ đờ, bỏ ăn và chết rải rác [3, 15]. Theo Nguyễn Thị Thanh Thùy (2005), tác nhân gây bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú nuôi tại Khánh Hòa là hai loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus [15]. Tuy nhiên, Đỗ Thị Hòa và cs (2008) lại cho biết V. angguillarum là tác nhân gây bệnh xuất huyết lở loét trong điều kiện cảm nhiễm nhân tạo (60,0 80,0%) với liều tiêm 0,3ml huyền dịch có mật độ vi khuẩn 4.106 – 4.107 tb/ml sau 3 ngày cảm nhiễm [3]. 1.3. Hiện trạng về các biện pháp phòng trị bệnh lở loét cho cá mú Đã có một số nghiên cứu về biện pháp phòng trị bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú. Theo Nagasawa và cs (2004), có thể trị bệnh lở loét do vi khuẩn Vibrio gây ra ở cá mú bằng axít Oxalinic trộn với thức ăn theo liều lượng 20mg/kg thức ăn hoặc Tetramycin trộn vào thức ăn cho cá ăn với liều lượng 7,5g/kg cho ăn trong 5 ngày và giảm ½ liều ban đầu trong 5 ngày kế tiếphay tắm Prifuran 2ppm trong vòng một giờ [55]. Theo Tendencia và cs (2004), để hạn chế tác hại của bệnh Vibriosis người ta tắm cá trong nước ngọt 10 – 15 phút, hoặc tắm bằng Prefuran 2ppm. trong 1 giờ, hoặc trộn axít Oxalinic vào trong thức ăn với tỷ lệ 20mg/kg cá hoặc Tetramycin 7.5g/kg cá cho ăn trong 5 ngày liên tục có thể cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh [102]. Hiện nay, ở Việt Nam vắc xin phòng bệnh cho cá rất ít, nên người nuôi thủy sản thường phải sử dụng kháng sinh và hoá chất trị bệnh vi khuẩn cho cá nuôi. Theo Phan Thị Vân (2006), cá mú bị lở loét do vi khuẩn được điều trị bằng phương pháp tắm, cho ăn hoặc tiêm kháng sinh. Các loại kháng sinh được sử dụng tắm cho cá bị bệnh gồm: Oxytetracyclin, Rifamicin, và Erythromycin với nồng độ 30-50g/m3 nước trong 30-60 phút hoặc cho ăn 50 mg/kg cá/ ngày, cho ăn liên tục 5 – 7 ngày. Các loại hoá chất sử dụng tắm cá bị bệnh lở loét là thuốc tím 10g/m3 nước trong 15-20 phút, cồn iốt có .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 5 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic 3 nồng độ 15-20g/m nước từ 10-20 phút. Các loại thuốc sát trùng bôi vào vết thương như cồn iốt, thuốc tím, thuốc mỡ có chứa Tetracyclin cũng thường được sử dụng [18] . Đối với cá có kích thước lớn, cá bỏ ăn thì việc sử dụng phương pháp cho cá ăn kháng sinh không có hiệu quả, đặc biệt là cá bố mẹ, do vậy cần áp dụng phương pháp tiêm một số loại thuốc kháng sinh. Các loại thuốc có thể sử dụng điều trị bệnh lở loét do vi khuẩn bằng phương pháp tiêm vào cơ gồm: Sulffamethoxazole 250 mg/kg cá, Sulfadiazin 250 mg/kg cá, Sulfazin, Sulfaquinoxalin 150mg/kg cá, Colistin sulfate, Sulfomanide 150 mg/kg cá. Sử dụng phương pháp tiêm tốn công lao động và chi phí cao, chỉ áp dụng cho việc trị bệnh vi khuẩn trên đàn cá mú bố mẹ [18]. Theo kết quả điều tra của Đỗ Thị Hòa và cs (2008), khi cá biển (cá mú, cá chẽm…) bị bệnh Vibriosis thì có tới 53,8% (trên tổng số 65 hộ) cơ sở nuôi dùng kháng sinh để tắm cho cá bị bệnh; 23,1% dùng Xanh Malachite để tắm (mặc dù Xanh Malachite đã bị cấm sử dụng ở nước ta (Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS của Bộ Trưởng Bộ Thủy sản) và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới), và 23,1% người dân không sử dụng biện pháp trị bệnh nào. Và trong số các biện pháp trị bệnh đó có 42,9% số hộ cho là có hiệu quả và 57,1% là không có hiệu quả [3]. Nguyễn Thị Thanh Thùy (2005) thấy rằng người dân thường sử dụng một số biện pháp trị bệnh bằng cách tắm nước ngọt hoặc sử dụng một số hóa chất như CuSO4, Xanh Malachite (10 – 15ppm trong 15 phút). Tuy nhiên, đa số hộ dân (90,0% số hộ) đều cho rằng đều không có hiệu quả [15]. Việc trị bệnh lở loét do vi khuẩn trên cá mú có thể có hiệu quả khi các vết loét còn nhỏ và cá còn khoẻ mạnh, nhưng khi các vết loét đã phát triển rộng, cá bỏ ăn thì tỷ lệ khỏi bệnh bằng các biện pháp trị bệnh kể trên cũng hạn chế. Hơn nữa, sử dụng thuốc và hóa chất trong phòng và trị bệnh trên cá thường để lại dư lượng trong sản phẩm làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người. Mặt khác, việc lạm dụng thuốc có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường. Sử dụng thuốc không hợp lý có thể tạo ra sự lờn thuốc hoặc có thể làm cho cá nuôi bị yếu đi từ đó các tác nhân cơ hội dễ xâm nhập và làm cho bệnh trở nên nghiêm trọng hơn 1989 [95]. Vì vậy, phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản là giải pháp hữu. Một trong những biện pháp phòng bệnh có hiệu quả và đang được người nuôi thủy sản hướng tới đó là sử dụng chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu (immunostimulant) nhằm tăng miễn dịch tự nhiên cho đối tượng nuôi. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 6 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Tuy nhiên, không phải bệnh nào cũng có thể được khống chế thành công bằng chất kích ứng miễn dịch; và trong hầu hết các trường hợp, để nâng cao hiệu quả phòng bệnh cần phải hiểu về đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá. 1.4. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá xương Cũng như các sinh vật khác, trong môi trường sống của cá luôn tồn tại các tác nhân gây bệnh. Do đó, cá phải có những phản ứng tự nhiên bảo vệ cơ thể trước các mối đe dọa đó. Đó chính là việc sử dụng các hàng rào của cơ thể nhằm ngăn cản các tác nhân gây bệnh như lớp nhớt bao bọc cơ thể, các yếu tố miễn dịch dịch thể không đặc hiệu có sẵn trong cơ thể (máu và hệ bạch huyết) và đặc biệt là vai trò của các tế bào có khả năng làm nhiệm vụ thực bào. Tất cả hợp thành hệ miễn dịch gọi là hệ miễn dịch không đặc hiệu. Lớp nhớt bao bọc cơ thể của cá có chứa bổ thể, lysozym, proteaza (chất có thể làm tan vi khuẩn gram âm [58, 80]. Tuy nhiên, kháng nguyên có thể xâm nhập vào cơ thể qua vùng bề mặt biểu bì bị tổn thương, qua mang, cơ quan đường bên và ống tiêu hóa [72]. Kháng nguyên lọt vào cơ thể có khả năng bị chặn lại bởi nhiều yếu tố plasma bảo vệ, trong đó có lysozym, bổ thể, transferin, lectin, trypsin [30]. Khi bị kháng nguyên xâm nhập, cơ thể sẽ sản sinh ra các rào cản khác của hệ thống miễn dịch tự nhiên để tự bảo vệ. Ban đầu một số tế bào miễn dịch được huy động đến nơi có tác nhân xâm nhập, chức năng này do thành phần bạch cầu của máu đảm nhận. Khi có vi trùng hoặc vật lạ xâm nhập, lập tức bạch cầu xuất hiện và tiêu diệt mầm bệnh bằng cách thực bào [111]. Các tế bào tham gia thực bào chủ yếu là các đại thực bào (marcrophase), tế bào đơn nhân (monocyte) [111] và bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) [63]. Bạch cầu đơn nhân là những bạch cầu tế bào có hình tròn hoặc gần tròn, đường kính khoảng 10 – 20 µm, tế bào có màu nâu tím; nhân tế bào có dạng dẹt hình hạt đậu hoặc hình móng ngựa và có màu tím hồng [93]. Bạch cầu đa nhân trung tính là những bạch cầu có hình tròn, đường kính khoảng 10 – 14 µm, có màu xanh nhạt hoặc màu hồng; nhân tế bào có dạng phân thùy (nhân thường phân thành ≥ 2 thùy) và thường có màu hồng tím [93] Khi cơ thể bị nhiễm tác nhân gây bệnh gây hiện tượng viêm. Phản ứng đầu tiên là sự gia tăng số lượng bạch cầu trung tính từ máu chuyển đến. Bạch cầu trung tính bắt đầu tập trung khoảng 1 giờ sau khi tác nhân gây viêm xâm nhập và đạt số lượng cực .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 7 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic đại sau 48 giờ. Tiếp đến là sự xuất hiện của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào tại ổ viêm (Afonso và cs, 1998), trích theo [5, 11]) Bạch cầu đa nhân trung tính ở cá cũng giống như ở các động vật có vú, nó là thành phần quan trọng bảo vệ cơ thể chống lại nhiều loại tác nhân gây bệnh. Để đánh giá tình trạng sức khỏe của một cá thể hay một quần thể thì việc đánh giá chức năng của bạch cầu trung tính là vô cùng quan trọng [38]. Bạch cầu trung tính có khả năng thực bào, hóa ứng động và tiêu diệt vi khuẩn. Phản ứng oxi hóa khử và bùng nổ hô hấp diễn ra rất mạnh trong bạch cầu trung tính khi chúng tiếp xúc với vi khuẩn [58, 87]. Khi vi sinh vật vừa xâm nhập vào một vị trí nào của cơ thể thì ngay tại nơi tiếp xúc sẽ có hiện tượng viêm. Các bạch cầu đa nhân trung tính tăng sinh nhanh chóng, kéo đến nơi vi sinh vật xâm nhập, giam chân mầm bệnh tại chỗ, các tế bào thực bào lưu động sẽ xâm nhập vào các tổ chức gây viêm, thò chân giả qua thành mạch để vây bắt và nuốt vật lạ vào trong tế bào [7]. Bạch cầu trung tính thường liên quan với một phản ứng ngắn hạn (cấp tính). Bạch cầu trung tính giảm sẽ làm gia tăng sự xuất hiện bệnh [82]. Đại thực bào ở cá được coi là thành phần miễn dịch có tầm quan trọng hơn so với các loài động vật có xương sống khác [111]. Chúng chủ yếu được tìm thấy dưới dạng các tế bào thuộc mạng lưới nội bì của thận, lách và ở một số loài cá được tìm thấy ở tâm nhĩ [89]. Các đại thực bào có khả năng thực bào lớn hơn nhiều so với các bạch cầu hạt, mặc dù số lượng bạch cầu hạt nhiều hơn đại thực bào [99]. Bạch cầu đơn nhân có mặt ở thận và phân bố một số lượng nhỏ trong máu. Các tế bào này được xem là tiền thân của đại thực bào ở các mô, chúng có thể di chuyển từ máu vào các ổ viêm, biệt hóa thành đại thực bào tại những nơi và những lúc cần thiết. Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào có thể bắt và tiêu hóa nhiều dạng mảnh nhỏ, kể cả các hạt carbon, vi khuẩn và nấm [5, 11] Thành tựu của việc phân lập và nuôi cấy trong ống nghiệm các đại thực bào của cá đã cho phép nghiên cứu kỹ các chức năng của chúng trong đáp ứng miễn dịch của cá. Các chức năng này bao gồm khả năng thực bào, hóa ứng động, tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhờ vào phản ứng oxy hóa-khử và tổng hợp nitric oxide (NO), khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1), chức năng xử lý và trình diện kháng nguyên (Secombes, 1996). Sự bùng nỗ các phản ứng oxy hóa – khử hình thành trong quá trình thực bào đã tạo nên các sản phẩm có hoạt tính oxy hóa cao và do đó có tính diệt khuẩn mạnh như H2O2, ion O2- v nguyên tử oxy tự do. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 8 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Khả năng đề kháng bệnh của cá thường được xác định thông qua chỉ số LD50 liều gây chết 50%) và phản ứng của hệ miễn dịch khi cá tiếp xúc với tác nhân gây bệnh (Wolters và cs., 1996; Bosworth và cs., 1998; Cai và cs., 2004 – trích theo 5 ). Trong khi hệ miễn dịch đặc hiệu cần thời gian dài để tạo nên kháng thể thì hệ miễn dịch không đặc hiệu đóng một vai trò quan trọng trong việc đề kháng lại tác nhân gây bệnh [22]. Theo Ellis (1981), số lượng bạch cầu, tỉ lệ của từng loại bạch cầu là những chỉ số quan trọng thể hiện chức năng đề kháng của hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá [43]. 1.5. Tình hình sử dụng chất kích ứng miễn dịch trong nuôi trồng thủy sản Chất kích ứng miễn dịch (Immunostimulants) là những hợp chất chiết suất từ sinh vật hoặc tổng hợp nhân tạo có khả năng làm gia tăng sức đề kháng bệnh truyền nhiễm, không phải bằng việc gia tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, mà là bằng việc tăng cường cơ chế miễn dịch tự nhiên, đặc biệt là hệ thực bào [91]. Khả năng đề kháng miễn dịch không đặc hiệu, không có ký ức miễn dịch và thời gian bảo vệ thường tương đối ngắn. Tuy nhiên, chất kích thích miễn dịch thường được được dùng như chất bổ trợ, có thể trộn chất kích thích vào thức ăn cho động vật thủy sản ăn trong thời gian dài và có thể có tác dụng đối với nhiều loại tác nhân, đó chính là ưu điểm nổi trội hơn so với vacxin. 1.5.1. Trên thế giới Trong những năm gần đây, chất kích thích miễn dịch được sử dụng khá rộng rãi trong nghề nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới nhằm gia tăng khả năng đề kháng bệnh cho các đối tượng nuôi, khi chưa có vaccine thích hợp. Chất kích thích hệ miễn dịch có tác dụng tăng cường hoạt động hệ miễn dịch tự nhiên khi được sử dụng một mình hoặc có thế kích thích đồng thời hệ miễn dịch tự nhiên và hệ miễn dịch đặc hiệu khi sử dụng chất kích thích miễn dịch kết hợp với vắc xin hoặc khi cá bị viêm nhiễm [88]. Trong số các hợp chất có khả năng tăng miễn dịch, có nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các chất như Glucan, MacroGard, Polypeptide, Levamisole, Chitin, Vitamin C, Lentinan, Schizophyllan, Scleroglucan và Zymosan [114]; và một số chất bổ dưỡng đặc biệt khác như Acid béo w - 3, Phospholipids, sắc tố Carotenoid và Nucleotids. Tuy nhiên chỉ một số chất có thể ứng dụng tăng miễn dịch cho đối tượng thủy sản [76, 95]. Trong đó Beta 1,3-glucans là chất được tập trung nghiên cứu nhiều nhất trong phòng bệnh trên cá [22]. Các chất này đã được chứng minh có thể tăng cường khả năng kháng bệnh của một số loài cá như cá chép Cyprinus carpio [114], cá hồi Đại Tây Dương .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 9 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y to k lic .c Salmo salar [83], cá Cam Seriola quinqueradia [64], cá hồi vân Oncorhynchus mykiss [48], cá hồi suối Salvelinus fontinalis [23] và cá da trơn Châu Phi Clarias gariepinus [115], chống lại nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh khác nhau bao gồm vi khuẩn V.anguillarum, V. salmonicida và Yersinia ruckeri [83] và Areomonas hydrophyla [115]. Ở Thái Lan, để phòng bệnh cho động vật thủy sản nuôi, người ta cũng đã sử dụng thức ăn có chế phẩm sinh học hoạt động như chất kích thích miễn dịch nhằm cải thiện trực tiếp sức khoẻ vật nuôi. Tuy nhiên, đến nay nhiều chất kích thích miễn dịch chỉ cho kết quả trong thời gian ngắn [19]. Lavens và Sorgeloos (2000) ghi nhận rằng khi cho tôm giống post-larvae ăn nauplii của Artemia đã được làm giàu với acid béo chưa bão hòa sẽ làm tăng khả năng chống lại sốc độ mặn. Phospholipids đóng vai trò quan trọng trong bảo toàn màng tế bào, một yếu tố quan trọng hàng đầu để phản ứng lại các kháng nguyên trong tất cả các sinh vật. Vitamin E, Selenium và Nucleotides có thể có các tác động hữu ích tới hệ miễn dịch của tôm. Vitamin E và Selenium có tác dụng rất hiệu quả trong việc chống lại sự ô xy hóa mà được biết sẽ tác động lên hệ miễn dịch của động vật có xương sống như cá. Vitamin E sẽ lọc hết các gốc tự do hình thành trong giai đọan đầu của quá trình tiền ô xy hóa chất béo trong màng tế bào, trong khi Selenium là một thành phần của sự tiền ô xy hóa Glutathione làm giảm quá trình tiền ô xy hóa chất béo trong tế bào [59]. Đối với tôm, giúp kích thích hệ miễn dịch là những dạng protein liên kết với các phân tử đặc trưng trên các sinh vật xâm nhập. Carbohydrates của các màng tế bào đặc biệt của vi khuẩn và nấm đã được xác định như là những phân tử đã được nhận diện qua các mẫu protein. Các phân tử này được sử dụng rộng rãi như các chất kích thích hệ miễn dịch. Có ba sản phẩm đã được thử nghiệm trên tôm như là những chất kích thích hệ miễn dịch là Lipopolysaccharide (LPS), Glucans và Peptidoglycan (PG). LPS và PG là những carbohydrates màng tế bào vi khuẩn, trong khi Glucans là một tập hợp các phần tử Glucose polymeric được tìm thấy trong màng tế bào nấm [59]. Beta – 1,3/1,6 Glucan được coi là chất kích thích hệ miễn dịch có hiệu quả nhất đối với tôm, cá nuôi và nó được sử dụng như một thành phần quan trọng trong thức ăn nuôi tôm công nghiệp [57]. Glucans là hợp chất glucose được tìm thấy trong thành tế bào của thực vật, nấm men, nấm và vi khuẩn. Glucan có thể kích thích hoạt động thực bào và các thành phần khác của hệ thống miễn dịch bẩm sinh ở cả cá và ở động vật có vú [84] .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 10 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Ở cá, Glucans có chức năng như chất kích thích miễn dịch mạnh [83]. Glucan có thể kích hoạt các đại thực bào, tăng khả năng bảo vệ để diệt mầm bệnh [53]; Glucans có thể làm tăng khả năng miễn dịch ở một số loài cá, chống lại một loạt các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn bao gồm cả Aeromonas salmonicida [71], Vibrio salmonicida [76], hoặc Pasteurella piscicida [73]. Trong một nghiên cứu về sự ảnh hưởng của Beta – glucan trên loài cá cá bơn Turbot Scophthalmus maximus, Ogier de Aulnyl (1996) thấy rằng tỷ lệ chết ở thí nghiệm cá bơn sau khi được cho ăn Beta glucan sau năm tuần và thách thức vi khuẩn V. anguillarum không cao hơn so với thí nghiệm cho ăn Beta – glucan kết hợp với vaccine chống vibriosis (VIB - Riffa Bain ND), tuy nhiên số lượng tế bào bạch cầu lại tăng cao ở thí nghiệm chỉ sử dụng Beta – glucan [67]. Một số nghiên cứu cho thấy tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ sống và sức kháng bệnh đều được cải thiện thông qua hoạt lực được tăng cường của các tế bào bạch cầu của cá hồi, cá trê phi và tôm he Nhật Bản, tôm sú sau khi sử dụng các chất kích thích miễn dịch gồm cả Glucan và Peptidoglycan [104]. Trong số các hợp chất tham gia vào tăng miễn dịch cho cá người ta quan tâm đến các Polysaccharide ví dụ như Letinan, Schizophyllan, Scleroglucan và Zymosan [114]. Theo Sakai (1999), khi cho cá hồi và cá bơn ăn thức ăn có bổ sung Beta – glucan thì các hoạt động của tế bào miễn dịch được tăng cường [91]. Verlhac và cs (1998) nghiên cứu cải thiện khả năng miễn dịch tự nhiên của cá hồi vân bằng các chất kích ứng miễn dịch, các tác giả cho biết, bổ sung Glucan và Vitamin C vào thức ăn có thể nâng cao khả năng miễn dịch cho cá kháng lại bệnh lở miệng [106]. Người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng của Chitin, Chitosan, Levamisole lên khả năng đáp ứng miễn dịch và tăng trưởng của cá chép bằng cách bổ sung các chất này vào thức ăn cho cá ăn trong vòng 90 ngày và được gây cảm nhiễm với vi khuẩn A. hydrophila. Hàm lượng các chất được bổ sung như sau: Chitin (10g/kg thức ăn), Chitosan (10g/kg thức ăn) và Levamisole (0.25g/kg thức ăn). Thức ăn có bổ sung các chất đều tăng hoạt tính của Lysozyme và giảm NTB (Nitroblue Tetrazolium Assay). Khi cá đã sử dụng thức ăn có bổ sung Chitin, Chitosan và Levamisole đến ngày thứ 45 của thí nghiệm thì tiến hành cảm nhiễm với vi khuẩn A. hydrophila với tỉ lệ sinh tồn tương đối (RPS) được ghi nhận như sau: Chitosan-80%, Levamisole-66,7% và Chitin40%. Đến ngày thứ 90 của thí nghiệm, thì RPS lại giảm xuống theo thứ tự tương ứng là .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 11 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic 68,9%, 57,8%, 37,5%. Qua đó nhóm tác giả kết luận rằng, sự bổ sung Chitosan vào thức đã làm tăng những đáp ứng miễn dịch và tỉ lệ sống của cá chép nuôi trong ao [20]. Khi nghiên cứu về sự ảnh hưởng của Glucan lên sức đề kháng của cá tráp (Sparus aurata) đối với vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh xuất huyết, Norma Couso và cs. (2003), thấy rằng cho cá ăn thức ăn có trộn thêm 5g, 10g Glucan/kg thức ăn làm giảm tỷ lệ chết một cách đáng kể so với nghiệm thức đối chứng. Những kết quả này cho thấy Glucans có thể được sử dụng trong chế độ ăn uống để ngăn ngừa hoặc giảm tỷ lệ chết ở cá tráp do vi khuẩn P. damselae gây ra [72]. Men bánh mì (Saccharomyces cerevisiae) là một sản phẩm tự nhiên có chứa các hợp chất kích ứng miễn dịch khác nhau như β – glucan, Axit Nucleic, Oligosaccharides, Chitin và đã được chứng minh có thể tăng cường đáp ứng miễn dịch tăng khả năng kháng bệnh do vi khuẩn gây ra trên một số loài cá như cá hồi, cá tráp, cá da trơn [101, 75, 34] Kitao và Yoshida (1986) thông báo rằng khi tiêm FK-156 (Tetrapeptid tổng hợp từ Lactoyl-tetrapeptide được chiết xuất từ nấm Streptomyces olivaceogrieus) cho cá hồi vân 1 ngày trước khi gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas salmonicida lên cá thì sức đề kháng đối với vi khuẩn của cá thí nghiệm tăng lên đáng kể. Hiệu quả bảo vệ này vẫn được duy trì đến ngày thứ 7 sau khi tiêm, tuy có thấp hơn so với lần gây nhiễm trước đó. Cơ chế đáp ứng miễn dịch thể hiện ở sự gia tăng hoạt tính thực bào và cũng có hiệu quả cả ở nhóm cá thí nghiệm bị gây ức chế miễn dịch [56]. Theo Welker (2008) [106], bổ sung chất kích ứng miễn dịch vào khẩu phần ăn của cá rô phi có thể tăng khả năng kháng bệnh. Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu sử dụng chất kích thích miễn dịch trên cá mú. Theo Cheng và cs (2007), khi tiêm 20 mg/kg Sodium alginate và 30mg/kg iotacarrageenan có tác dụng tăng khả năng kháng bệnh nhiễm trùng máu do vi khuẩn V.alginolyticus trên cá mú E. coioides và kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu thông qua hoạt động của lysozym, bùng nổ hô hấp, phản ứng oxi hóa khử và khả năng thực bào [25]. Trong một nghiên cứu khác trên cá mú E. fuscoguttatus Cheng và cs (2008) cũng cho biết thức ăn có bổ sung Sodium alginate và қ – carrageenan cho cá mú E. fuscoguttatus ăn đã làm tăng tỷ lệ sống và tăng khả năng miễn dịch chống lại bệnh do vi khuẩn V.alginolyticus gây ra [26]. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 12 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic Miễn dịch liệu pháp là một cách tiếp cận đã được tích cực điều tra trong những năm gần đây như là một phương pháp để phòng bệnh. Nó không liên quan đến sự nhận ra của một kháng nguyên cụ thể nào và không đặc hiệu đối với một tác nhân gây bệnh cụ thể nào, nhưng gây ra một phản ứng miễn dịch tổng thể thúc đẩy quá trình nhận ra protein ngoại lai [33, 98]. Vì vậy, việc sử dụng các chất kích ứng miễn dịch để phòng bệnh trong các loài cá được xem là một biện pháp phòng bệnh có hiệu quả trong tương lai [91]. 1.5.2. Ở Việt Nam Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng các chất kích thích hệ miễn dịch như một liệu pháp phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam . Mới chỉ có một vài nghiên cứu sử dụng Beta Glucan, Vitamin C trong nghiên cứu tăng miễn dịch cho đối tượng thủy sản. Theo Nguyễn Thị Thanh Thủy và cs (2007), có thể cải thiện sức đề kháng với vi khuẩn Vibrio alginolyticus của cá Khoang cổ đen đuôi vàng Amphibrion clarkii (Bennett, 1830) bằng cách tắm Beta glucan và cho ăn ấu trùng Artemia được làm giàu bằng dung dịch này [16]. Trong một kết quả nghiên cứu khác, Nguyễn Thị Thanh Thủy và cộng sự (2009) cho biết, tỷ lệ sống và sức đề kháng của của cá khoang cổ đỏ (Amphiprion frenatus Brevoort, 1856) với vi khuẩn Vibrio alginolyticus trong các nghiệm thức được tắm dung dịch Beta – 1,3/1,6 glucan cao hơn so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, nếu tắm ở nồng độ cao (184 và 920 mg/l), hiệu quả của Beta – 1,3/1,6 Glucan không rõ ràng [17]. Từ những kết quả ban đầu như thế có thể thấy, nghiên cứu sử dụng các chất kích ứng miễn dịch để phát huy tối đa khả năng miễn dịch tự nhiên của cá, nhằm chống lại các bệnh thường gặp trong quá trình nuôi còn là một vấn đề hết sức mới mẻ ở Việt Nam; nhưng lại là vấn đề có ý nghĩa lớn. .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 13 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y .c to k lic 2.2.2. Chế độ cho ăn Cho cá ăn hàng ngày một lần vào buổi sáng. Thức ăn là cá tạp được trộn thêm chế phẩm với tỷ lệ trộn tương ứng ở cá nghiệm thức như sau: + Nghiệm thức Vime glucan for fish (V): Cho ăn cá tạp + 5 g V/kg cá tạp + Nghiệm thức Glumin (G): Cho ăn cá tạp + 10 g G/kg cá tạp + Nghiệm thức Betami (B): Cho ăn cá tạp + 3 g B/kg cá tạp. + Nghiệm thức đối chứng (ĐC): Cho ăn cá tạp Thức ăn sau khi trộn để yên 30 phút và bao ngoài bằng dầu mực của công ty ANOVA trước khi cho cá ăn. - Khẩu phần cho ăn: Cho cá ăn 2% trọng lượng thân. 2.2.3. Thí nghiệm công độc Cá ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm và nghiệm thức đối chứng sau khi cho ăn theo công thức thí nghiệm 14 ngày thì tiến hành công cường độc vi khuẩn V. alginolyticus bằng cách tiêm cơ 0,1 ml dịch khuẩn 104, 105, 106 cfu/ml /con cá. - Chuẩn bị vi khuẩn để công cường độc lên cá Vi khuẩn V. alginolyticus được nuôi cấy trên môi trường TSA 18 giờ, sau đó hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lý. Xác định nồng độ vi khuẩn bằng cách sử dụng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm và độ hấp thụ OD = 0,2 đạt mật độ vi khuẩn ở khoảng 108 tb/ml (so với dung dịch chuẩn Mc Farland). Kết hợp nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường TSA. • Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trên môi trường TSA + Hệ thống pha loãng: hệ số pha loãng bằng 10. + Lấy 0.1 ml nước mẫu ở 2 độ pha loãng cuối cùng, nuôi cấy trên môi trường TSA 2% NaCl. Mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 3 hộp lồng. + Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-32oC, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sau khi nuôi cấy khoảng 24 giờ, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa hộp lồng có cùng độ pha loãng. + Số lượng vi khuẩn tính theo công thức: N X= x k V Trong đó: X là số lượng vi khuẩn/ml (cfu/ml) .d o m o o c u -tr a c k C w w w .d o m C lic k to 17 w w w w bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c