Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme pectinase lên tính chất cảm quan của nước quả thanh long

MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... i DANH MỤC BẢNG BIỂU .......................................................................................ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3 1.1. CÂY THANH LONG .....................................................................................3 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học ...............................................................3 1.1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................................3 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................3 1.1.2.3. Thành phần dinh dưỡng .......................................................................6 1.2. PECTIN ..........................................................................................................6 1.2.1. Giới thiệu ....................................................................................................6 1.2.2. Cấu tạo và phân loại ...................................................................................7 1.2.3. Tính chất chung ..........................................................................................8 1.3. ENZYME PECTINASE .................................................................................8 1.3.1. Giới thiệu ....................................................................................................8 1.3.2. Cấu tạo và phân loại ...................................................................................9 1.3.2.1. Cấu tạo .................................................................................................9 1.3.2.2. Phân loại enzyme pectinase .................................................................9 1.3.3. Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme pectinase ..........................10 1.3.4. Ứng dụng của hệ enzyme pectinase .........................................................12 1.3.5. Nguồn thu nhận enzyme pectinase ...........................................................14 1.3.5.1. Thực vật .............................................................................................14 1.3.5.2. Vi sinh vật ..........................................................................................14 1.4. TỔNG QUAN VỀ TÍNH CHẤT CẢM QUAN CỦA NƯỚC QUẢ ...........15 1.5. TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ..............17 1.5.1. Trong nước ...............................................................................................17 1.5.2. Ngoài nước ...............................................................................................17 1.6 MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ THANH LONG .................................................19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 20 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM........................................................................20 2.1.1 Thời gian ...................................................................................................20 2.1.2. Địa điểm ...................................................................................................20 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................20 2.2.1. Nguyên liệu chính ....................................................................................20 2.2.2. Các nguyên liệu phụ .................................................................................20 2.2.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu ..........................................................21 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................23 2.3.1. Quy trình sản xuất nước thanh long .........................................................23 2.3.2. Thuyết minh quy trình ..............................................................................24 2.3.3. Sơ đồ nghiên cứu và bố trí thí nghiệm sản xuất nước thanh long ............26 2.3.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ...............................................................................26 2.3.3.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................27 2.3.7.1. Phương pháp phân tích hóa lý............................................................34 2.3.7.2. Phương pháp đánh giá cảm quan .......................................................39 2.3.7.3. Phương pháp xử lý số liệu phân tích Anova ......................................39 2.3.7.4. Chỉ tiêu vi sinh ...................................................................................40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………41 3.1. Khảo sát thành phần hóa lý của nguyên liệu ................................................41 3.2. Kết quả thí nghiệm xác định lượng enzyme pectinase bổ sung thích hợp .........................................................................................................41 3.3. Kết quả thí nghiệm thời gian xử lý enzyme pectinase .................................43 3.4. Kết quả thí nghiệm nhiệt độ xử lý enzyme pectinase ...................................44 3.5. Kết quả xác định lượng nước bổ sung vào thịt quả ......................................45 3.6. Kết quả phối trộn syrup thích hợp ................................................................47 3.7. Kết quả khảo sát tỷ lệ bổ sung texim thích hợp............................................50 3.8. Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản ảnh hưởng lên chất lượng sản phẩm.........................................................................................................51 3.9. Đánh giá chất lượng sản phẩm .....................................................................51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58 i DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hoa thanh long ........................................................................................... 5 Hình 1.2 Các loại quả thanh long ................................................................................ 5 Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của phân tử pectin ........................................................... 7 Hình 1.4 Nước thanh long nha đam ......................................................................... 19 Hình 1.5 Rượu thanh long ........................................................................................ 19 Hình 1.6 Thuốc giảm cân thanh long ....................................................................... 19 Hình 1.7 Thanh long sấy .......................................................................................... 19 Hình 2.1. Máy đo pH ................................................................................................ 22 Hình 2.2. Phễu lọc chân không ................................................................................. 22 Hình 2.3. Thiết bị ghép nắp chai ............................................................................... 22 Hình 2.4. Cân phân tích............................................................................................. 22 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình sản xuất nước quả thanh long ........................................... 23 Hình 2.6. Sơ đồ nghiên cứu sản xuất nước giải khát thanh long .............................. 26 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định lượng enzyme pectinase thích hợp ....... 28 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian ủ enzyme pectinase ................ 29 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ xử lý enzyme pectinase ........... 30 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch quả :nước ........... 31 Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát phối trộn tỷ lệ syrup ............................ 32 Hình 2.12.Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ texim bổ sung............................... 33 Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của enzyme pectinase đến lượng dịch ép .... 42 Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian xử lý enzyme đến lượng dịch quả ............... 44 Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ lên lượng dịch quả ................................. 45 Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện mức độ ưa thích của người tiêu dùng với 3 tỷ lệ pha loãng .................................................................................................................. 46 Hình 3.5 Đồ thị trắc nghiệm LSD ở các tỷ lệ nước khác nhau ................................. 47 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện mức độ ưa thích của người tiêu dùng với từng độ ngọt .. 48 Hình 3.7 Biểu đồ đánh giá cảm quan độ ngọt sản phẩm........................................... 49 Hình 3.8. Quy trình sản xuất nước giải khát thanh long ........................................... 55 ii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Thành phần hóa học chung của quả thanh long ......................................... 6 Bảng 2.1 Chỉ tiêu vi sinh theo Quy Chuẩn Kỹ Thuật Quốc Gia đối với đồ uống không cồn .................................................................................................................. 40 Bảng 3.1 Thành phần hóa lý của thanh long nguyên liệu ......................................... 41 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của enzyme pectinase đến lượng dịch quả thu được ............. 42 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến lượng dịch quả..................... 43 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên lượng dịch quả .................................................... 44 Bảng 3.6 Bảng đánh giá cảm quan cho điểm ở 3 mẫu nước pha loãng .................... 46 Bảng 3.7 Kết quả tham khảo ý kiến người tiêu dùng qua các độ ngọt ..................... 47 Bảng 3.8 Ảnh hưởng độ ngọt sản phẩm đến tỷ lệ phối trộn dịch quả và syrup ........ 48 Bảng 3.9 Kết quả xử lý thống kê cảm quan độ ngọt sản phẩm................................. 49 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát hàm lượng texim bổ sung sau 10 ngày bảo ôn ............ 50 Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra vi sinh sau 10 ngày bảo ôn ........................................... 51 Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra vi sinh sản phẩm sau 20 ngày bảo quản ....................... 51 Bảng 3.13 Phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm theo Tiêu Chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 ......................................................................................... 52 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TCVN : TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TSVSVHK : TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TB : TRUNG BÌNH HSQT : HỆ SỐ QUAN TRỌNG 1 MỞ ĐẦU Trong những gần đây, ngành chế biến thực phẩm Việt Nam đã phấn đấu đưa sản phẩm Việt Nam vào thị trường quốc tế. Tuy nhiên, chỉ xuất khẩu hàng thô, sơ chế đóng gói là chủ yếu nên giá trị kinh tế chưa cao. Việt Nam có diện tích 331.690 km2, là một nước nhỏ so với nhiều quốc gia khác [6]. Tuy nhiên, có đặc điểm địa hình khá đặc biệt, dài hẹp, vì vậy có nhiều vùng khí hậu khác nhau dẫn đến việc hình thành các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau. Trên mỗi vùng khí hậu của nước ta sẽ có những chủng loại rau trái thích hợp cho mỗi vùng và thanh long là một trong những loại quả có sản lượng cao và dễ dàng hư hỏng trong quá trình bảo quản. [6] Nhưng gần đây lượng thanh long không thể xuất khẩu ra thị trường nước ngoài còn tồn đọng trong nước khá nhiều, nguyên nhân là do không đạt tiêu chuẩn về các giá trị cảm quan như về màu sắc, hình dạng và do thói quen sử dụng thanh long từ trước tới nay của thị trường trong nước chủ yếu là ăn tươi. Nên dẫn đến lượng thanh long tiêu thụ trong thị trường nội địa là khá lớn, nhất là vào những thời điểm chín vụ, dẫn đến giảm giá thành sản phẩm, gây khó khăn cho người nông dân. Do đó việc giải quyết một số lượng lớn thanh long như vậy là nhiệm vụ vô cùng cần thiết.. Với đặc điểm quả to, nhiều nước, vị chua ngọt, thanh long có thể được dùng cho việc sản xuất nước uống. Mặt khác, trong thành phần của quả thanh long có nhiều pectin là nguyên nhân chính gây khó khăn cho quá trình chế biến (cụ thể là quá trình ép, lọc), làm cho hiệu quả trích ly của dịch quả thấp, chất lượng dịch quả không cao gây nên hiện tượng nhớt và đục rất nhiều [9]. Trong các biện pháp kỹ thuật đang được sử dụng nhằm tăng chất lượng sản phẩm đồ uống từ rau quả tươi thì phương pháp sử dụng enzyme có thể được coi là một trong những phương hướng có triển vọng của ứng dụng vào ngành sản xuất nước quả, rượu vang và nước uống không cồn [9]. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn và thực hiện đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme pectinase lên tính chất cảm quan của nước quả thanh long ”. 2  MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI “ Nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme pectinase lên tính chất cảm quan của nước quả thanh long” là:  Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên enzyme pectinase.  Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên enzyme pectinase.  Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ lên enzyme pectinase.  Xây dựng quy trình sản xuất nước giải khát từ quả thanh long.  ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Quả thanh long  PHẠM VI NGHIÊN CỨU: Quả thanh long được mua ở vựa Tầm Vu, Tỉnh Long An.  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp phân tích hóa lý  Xác định hàm ẩm trong nguyên liệu (TCVN 7040:2002).  Xác định hàm lượng tro tổng trong nguyên liệu (TCVN 7038:2002)  Xác định hàm lượng đường tổng (TCVN 4295:2009)  Xác định hàm lượng đạm (TCVN 7598: 2007) Phương pháp đánh giá cảm quan  Đánh giá cảm quan bằng phép thử cho điểm.  Đánh giá chất lượng thực phẩm bằng phép thử cho điểm tổng hợp của sản phẩm theo TCVN 3215 – 79. Phương pháp xử lý số liệu: bằng chương trình Statgraphics Plus, microsoft office excel.  BỐ CỤC ĐỀ TÀI: Gồm 3 chương: - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và bàn luận 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. CÂY THANH LONG 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học 1.1.1.1. Nguồn gốc Tên khoa học: Hylocereus andulatus (Haw) Britt et Rose thuộc: [6] + Lớp hai lá mầm Dicotyledonae + Phân lớp cẩm chướng Caryophyllidae + Bộ hoa cẩm chướng Caryophyllales + Họ thanh long (tức họ xương rồng) Cactaceae Cây thanh long có tên tiếng anh là Pitahaya, còn gọi là Dragon fruit, họ cây xương rồng, có nguồn gốc từ các vùng sa mạc thuộc Mehicô và Colombia.[6] Thanh long là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn rất giỏi nên được trồng ở những vùng có khí hậu nóng. Một số loài chịu được nhiệt độ từ 50-550C, nhưng không chịu được thời tiết giá lạnh. Sự sinh trưởng và phát triển của cây cần có cường độ ánh sáng mạnh, vì vậy hễ bị che nắng, thân cây sẽ nhỏ ốm yếu kém phát triển và lâu cho trái.[6] Các giống thanh long chủ yếu ở Việt Nam hiện nay Trái thanh long được phân biệt qua sự khác nhau về màu sắc của ruột và vỏ trái. Như là: [6] Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus, ruột trắng với vỏ hồng hay đỏ. Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus, ruột đỏ hay hồng với vỏ đỏ. Selenicereus megalanthus thuộc chi Selenicereus, ruột trắng với vỏ vàng. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học  Rễ cây Có 2 loại rễ: địa sinh và khí sinh[6] - Rễ địa sinh: phát triển từ phần lõi của gốc hom. Có những rễ lớn đạt đường kính từ 1-2cm. Rễ địa sinh bám vào đất để hút các chất dinh dưỡng nuôi cây. Rễ này phân bố chủ yếu ở tầng đất mặt từ 0-15 cm. 4 - Rễ khí sinh: mọc dài theo thân cây phần ở trên không, nó bám vào cây trụ để giúp cây leo lên giá đỡ.  Thân cành Thân, cành trườn bò dài trên những trụ đỡ, có 3 cánh dẹp, xanh, hiếm và ít khi có 4 cánh, ở các nước khác thì nó có thể có 3, 4 có khi có 5 cánh. Tiết diện ngang có 2 phần: bên ngoài là nhu mô chứa diệp lục, còn bên trong là lõi cứng có hình trụ dài. Mỗi cành chia ra làm nhiều thùy và có chiều dài từ 3-4cm. Ở đáy của mỗi thùy thì có từ 3-5 gai ngắn. Mỗi năm, trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây cho từ 3-4 đợt cành, đợt cành thứ nhất là cành mẹ của đợt cành thứ hai và cứ thế cành xếp thành từng lớp từng lớp trên đầu trụ đỡ [6].  Hoa Hoa thanh long xuất hiện sớm nhất vào giữa tháng 3 và kéo dài tới khoảng tháng 10 trong năm, và rộ nhất từ tháng 5 tới tháng 8. Trung bình thì hoa thanh long có từ 4-6 đợt ra hoa cho mỗi năm[6]. Hoa thường nở vào khoảng 19-23 giờ đêm và đồng loạt trong vườn. Từ nở đến tàn thì kéo dài khoảng 2-3 ngày. Hoa thanh long lưỡng tính sẽ có nhiều nhị đực có vòi nhị dài và nhụy cái dài khoảng 20-25cm, đường kính khoảng 4-8mm và có mang rất nhiều núm. Nhiều lá dài và cánh hoa dính nhau thành ống nối dài với nhau[6]. Mặt ngoài của những cánh hoa phía ngoài có màu xanh vàng, mặt trong hoa có màu trắng. Hoa thanh long ra từng bông xung quanh trên các cành, hoa có mùi thơm[6]. Hoa thanh long được trình bày ở hình 1.1. 5 Hình 1.1: Hoa thanh long [16]  Quả Sau khi hoa thụ phấn sẽ phát triển thành quả, trong 10 ngày đầu thì chúng phát triển tương đối chậm nhưng sau đó nó sẽ tăng rất nhanh về kích thước và cả trọng lượng[6]. Quả thanh long có hình bầu dục. Khi còn non thì quả màu xanh, khi chín thì quả chuyển sang màu đỏ, trên lớp vỏ mỏng có những phiến hoa còn lại thường gọi là tai trái có màu xanh, thịt trái thanh long phổ biến có màu trắng trong, hoặc màu trắng ngà (đối với thanh long ruột vàng), hoặc màu đỏ (đối với thanh long ruột đỏ), thịt quả có nhiều hạt màu đen li ti rải rác khắp quả nhưng nhỏ hơn hạt mè. Kích thước quả thanh long thâm canh có chiều dài phổ biến khoảng 12,5-17cm, đường kính 8-13cm, trọng lượng trung bình 230-700g/quả [6]. Quả thanh long được minh họa trong hình 1.2. a b Hình 1.2 Các loại quả thanh long[16] (a) Thanh long ruột trắng (b) Thanh long ruột trắng vỏ vàng (c) Thanh long ruột đỏ c 6 1.1.2.3. Thành phần dinh dưỡng Trong quả thanh long chứa nhiều nước, và các chất khoáng như: Ca, Fe, Mg, P, Na, pectin. Bảng 1.1: Thành phần hóa học chung của quả thanh long[6] Thành phần Trong 100g ăn được Brix (tổng số chất hòa tan) 13 Đường khử (g) Đường tổng số (g) 6,1 11,5 Acid hữu cơ (g) 0,13 Protein (g) 0,53 K(mg) 212,2 Ca (mg) 134,5 Mg(mg) 60,4 Vitamin C 9,4 Xơ (mg) 0,71 1.2. PECTIN 1.2.1. Giới thiệu Từ pectin xuất phát nguồn gốc từ tiếng hy lạp là “pektos” có ý nghĩa là “cứng, chắc”. Pectin là polysaccharide dị thể, đây còn là chất keo liên kết đóng vai trò quan trọng ở thực vật. Chúng được phân bố rộng rãi trong mô thực vật hay có thể ở dạng hòa tan trong các dịch của các loài thực vật [4]. Pectin có cấu trúc mạch thẳng được cấu tạo từ các phân tử là galacturonic, nó được liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucozit. Pectin khác với hydrocacbon thông thường là chúng không phải được xây dựng từ những phân tử đường [4]. Pectin gồm một mạch chính có thay đổi nhưng nó có một tỉ lệ lớn từ các đơn vị axit D-galacturonic đã được methyl este hóa đi một phần, chúng nối với nhau bằng nối α-1,4 glucozit. Và hợp chất này bị khử metyl hóa còn được gọi là pectic [4]. 7 1.2.2. Cấu tạo và phân loại  Cấu tạo Pectin là polysaccharide có cấu tạo từ liên kết của các mạch phân tử axit α- Dgalacturonic đã được este hóa một phần hay với toàn bộ với rượu metylic (CH3OH). Các phân tử pectin được biểu diễn dưới một phân tử lớn và nó có cấu trúc mạch thẳng bền vững nhờ các liên kết 1,4-glucozit. Các pectin đã hòa tan trong tự nhiên là este metylic của axit pectic. Tuy nhiên trong thực tế không phải bao giờ tất cả các nhóm –COOH ở vị trí C6 của axit galacturonic cũng bị methyl hóa, mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decarboxyl hóa (khử CO2), còn số nhóm –COOH thì ở vị trí H lại gắn tên một kim loại, có khi ở dạng nguyên thủy –COOH [4]. Tùy thuộc vào nguồn gốc của pectin mà mạch axit galacturonic dài hay ngắn và do đó khối lượng phân tử của chúng cũng khác nhau, và nó dao động trong khoảng 20.000-200.000 đơn vị [4]. Cấu trúc hóa học phân ử pectin được minh họa ở hình 1.3. . Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của phân tử pectin[17]  Phân loại Pectin tồn tại hai dạng là protopectin không tan và pectin tan. Protopectin là chất phức giữa pectin với các polysaccharide khác như cellulose, hemicelluloses, araban, tinh bột…làm nên cấu trúc của vách tế bào. Pectin tan có trong thành phần của dịch bào thực vật. Đối với thực vật, pectin có rất nhiều ở quả, củ và thân cây với hàm lượng khác nhau tùy thuộc vào loài của chúng [4]. 8 1.2.3. Tính chất chung Đối với thực vật, có sự biến đổi giữa thành phần protopectin và pectin trong quá trình chín của quả. Khi quả còn xanh thì hàm lượng protopectin trong quả rất cao, phân tán chủ yếu ở thành tế bào có tác dụng làm quả cứng. Nhưng khi quả chín, dưới tác dụng của axit hữu cơ và vai trò xúc tác của enzyme protopectinase có trong quả, protopectin không tan sẽ chuyển dần sang dạng pectin tan làm cho quả mềm ra, hàm lượng pectin tăng dần lên và hàm lượng protopectin sẽ giảm dần[5]. Axit pectic khi kết hợp với ion hóa trị 2 (Ca2+) sẽ tạo thành kết tủa. Và đây là một tính chất quan trọng, nó có ý nghĩa về mặt phân tích sinh hóa cũng như ứng dụng thu nhận pectin. Bên cạnh đó, pectin cũng bị kết tủa hay đông đặc khi nó tác dụng với một số hóa chất như: Ca(OH)2, Ba(OH)2, CuSO4, MgSO4, (NH4)2SO4...[5] Dung dịch pectin bị làm đông đặc bởi một số loại men đặc biệt như: pectase có trong dịch của củ cà rốt. Dưới tác dụng của pectase, pectin sẽ biến thành những axit pectic. Axit pectic có tính chất là tan trong kiềm, các muối tan, riêng pectat canxi thì không tan. Enzyme pectinase có trong lúa đại mạch thì sẽ có tác dụng ngược lại với pectinase, nếu có pectinase thì pectase sẽ không làm cho pectin đông đặc nữa, hơn nữa nó có thể hòa tan kết tủa khi vốn đã bị pectase làm đông đặc. [7] Pectin thương phẩm là chất bột màu vàng nhạt hay màu xám, tan trong nước và dung dịch đường, không tan trong dung môi hữu cơ khác. Ở trạng thái dung dịch pectin có những đặc tính công nghệ như: chất ổn định cấu trúc, chất tạo gel, chất đông đặc trong đó khả năng tạo gel là tính chất quan trọng nhất.[7] 1.3. ENZYME PECTINASE 1.3.1. Giới thiệu Enzyme pectinase là enzyme thủy phân pectin, sản phẩm của quá trình thủy phân này là axit galacturonic, galactose, arabinose, methanol...Đây là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ sau amylase và protease [4]. Enzyme này được phát hiện trong các dịch trái cây như cà rốt, cà chua và ở đại mạch. Đầu tiên là phát hiện của E. Fremi (1840) trên cà rốt, khi đó enzyme này được gọi là pectase [3]. Sau này G.Bertrand và A.Mallevre cũng tìm thấy enzyme này nhưng 9 trên là dịch ép cà chua. Cho đến cuối thế kỷ 19 thì enzyme pectinase mới được nghiên cứu kỹ bởi E. Prouquelot và H.Herrisseu trên đại mạch[4]. Enzyme pectinase không những được tìm thấy ở thực vật bậc cao mà sau này các nhà khoa học còn tìm thấy ở một số loài vi sinh vật. Enzyme pectinase đã được tìm thấy ở rất nhiều vi sinh vật có trong tự nhiên. Enzyme pectinase không chỉ tồn tại một loại mà còn có nhiều loại enzyme khác nhau, chúng xúc tác cho các kiểu phản ứng khác nhau và còn có tính đặc hiệu cao ở vi sinh vật. Tuy nhiên, người ta tìm thấy enzyme này ở thực vật bậc cao thường chúng chỉ là pectinstease [4]. 1.3.2. Cấu tạo và phân loại 1.3.2.1. Cấu tạo Enzyme pectinase cũng như các loại enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, còn có khả năng xúc tác với đặc hiệu cơ chất cao. Các chất xúc tác này thường có cấu trúc phức tạp và thường để đảm bảo chúng có tính xúc tác thì enzyme phải có cấu trúc bậc IV. Đối với cấu trúc bậc IV, nhờ vào các tương tác hóa học giữa các thành phần mà chúng hình thành trung tâm hoạt động. Enzyme polygalacturonase (pectinase) chứa một vùng từ 8-10 vòng xoắn β kép về phía phải và 2 vòng tạo thành một khe liên tiếp nối với cơ chất [4]. 1.3.2.2. Phân loại enzyme pectinase Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng [4] Pectinesterase (PE): nhóm này thủy phân các nhóm methyl ester. Enzyme tấn công mạnh vào các nhóm ester methyl của galaturonate phân cắt các nhóm methoxy (-OCH3) đứng cạnh các nhóm -COOH tự do, và tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Enzyme pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau thì chúng có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu như thu nhận từ nguồn của vi sinh vật thì pH tối ưu từ 4,5 ÷ 5,5; còn nếu thu nhận từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0 ÷ 8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 ÷ 400C và chúng bị vô hoạt ở nhiệt độ 55 ÷ 620C. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+.. 10 Polymethylgalacturonase: (PG) có tên gọi là poly 1,4- galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α-1,4-glycoside. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng chúng thường gặp chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme bao gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Pectate lyase (PEL): enzyme này xúc tác sự phân cắt các đơn vị của galacturonate không bị ester hoá. Pectate và pectin có lượng methoxy thấp là các cơ chất thích hợp cho các enzyme này. Cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối ưu từ 8,0 ÷ 11; cần ion Ca2+ để chúng hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có nhiều ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme vi sinh vật ngoại bào này có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, nó gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô ở thực vật. Ngoài ra còn có một số loại enzyme sau: Pectin-transeliminase (poly α-1,4-galaturonid-methylesteglucanoliase), là enyme tác dụng lên pectin và acid pectinic. Polygalactorunate-transeliminase (poly α-1,4-D-galaturonid-glucanoliase), là enzyme tác dụng lên trên acid pectic và acid pectinic. Pectin lyase (PNL): chúng xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các loại PNL đều là thuộc endo-enzyme. 1.3.3. Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme pectinase - Pectinesterase (PE) Các PE ở thực vật sẽ tác dụng vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, để tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl hoá, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amide hay bị khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid. Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của polymanuronic acid thì không hề bị tấn công. 11 Tốc độ khử ester hoá trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch, trimethyl trigalacturonate không bị tấn công. Các PE của nấm khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm mehtoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên [4]. - Polygalacturonase Việc xác định hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung dịch pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ và mức độ thuỷ phân, đồng thời tăng mức độ ester hoá. Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độ thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm liên kết. Sự thủy phân bị hạn chế do sự có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minh bằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm cơ chất. PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến 70% pectin bị acetyl hoá. Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các nguồn khác nhau thì khác nhau [4]. Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH > 7 là pectin hoàn toàn bị ester hóa. Tuy nhiên, ở các giá trị pH nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối với pectin bị ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca2+ để kích hoạt. Điều này có ý nghĩa thực sự đối với các quá trình chế biến trái cây. Những enzyme này cần các nhóm methylester để hoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bị amide hóa [4]. - Endo-pectate lyates Trái lại, endo-pectate lyates không phân biệt methylester và glycolester của pectic acid. Điều thú vị là pectate không phải là cơ chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vi khuẩn. Chúng có hoạt độ cực đại (tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) nên pectin có hàm lượng methoxyl thấp [4]. - Rhamno-galacturonase Gần đây, rhamno-galacturonase là enzyme được phát hiện có khả năng phân cắt liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử galacturonic rhamnose acid có trong pectin của quả táo với hoạt tính rất cao khi những phân tử này bị ester hoá và arabinose bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều bị sửa chữa). Enzyme này có mặt trong các chế phẩm thương mại của 12 pectinase và chắc chắn phải được phân loại là pectinase. Sản phẩm cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose và galacturonic acid, trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử [4]. - Pectinase thương mại Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều chế chủ yếu từ các loại Aspergillus. Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG và PEL, hemicellulase và endo--glucanase (C-x-cellulase). Các enzyme đều được thu nhận từ nấm mốc được sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ enzyme C-1cellulase (cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt được mục đích kỹ thuật [4]. 1.3.4. Ứng dụng của hệ enzyme pectinase Pectinase thường được sử dụng trong các ngành chế biến thực phẩm sau:[4]  Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn  Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,…  Sản xuất rượu vang  Sản xuất nước giải khát  Sản xuất cà phê Trong công nghệ sản xuất rượu vang, hoặc trong sản xuất nước quả và các nước uống không cồn, chúng ta đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép hay làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, dẫn đến làm tăng hiệu suất sản phẩm. Nếu đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 ÷ 25%. Vì khi có pectin thì khối thịt quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra ngoài hết được. Nhờ có pectinase phân giải các cơ chất pectin mà dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc được rất dễ dàng. Bên cạnh đó, enzyme pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm[4]. Trong sản xuất các sản phẩm từ quả như (mứt nhừ, mứt đông,…) pectinase cũng có vai trò rất quan trọng. Nhờ có pectinase mà có thể thu được dịch quả có 13 nồng độ đậm đặc hơn khi không sử dụng pectinase. Ví dụ như dịch táo cô đặc đến 720Bx, nếu chúng ta không tách các pectin tự nhiên chứa trong đó thì sản phẩm sẽ bị keo tụ một cách nhanh chóng và không thể cô đặc hơn được nữa. Đa số, người ta khử pectin đi, sau đó lọc rồi cô đặc, nhưng cũng có trường hợp người ta cho pectinase tác dụng trong suốt thời gian cô đặc[4]. Trong công nghệ sản xuất cà phê, người ta sử dụng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt của hạt cà phê. Trước đây người ta dùng vi sinh vật để làm công việc này, nhưng các quá trình xảy ra không đồng đều nên khó kiểm tra. Hiện nay thì người ta thường dùng các chế phẩm pectinase để tăng chất lượng sản xuất[5]. Trong tế bào của các loại quả nước chiếm khoảng 90 ÷ 95%. Nếu ta chỉ nghiền không cho enzyme sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng từ 60 ÷ 70% là tối đa. Nhưng khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng lên đến 15 ÷ 30%. Có nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là khoảng từ 0,03 ÷ 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 ÷ 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân là 43 ÷ 450C. Thời gian thủy phân là khoảng từ 4 ÷ 8 giờ. Dịch quả khi đó thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh cao hơn[4]. Cơ chế tác động của enzyme pectinase Trong công nghệ chế biến nước quả, người ta thường sử dụng các chế phẩm enzyme có hai mục đích cơ bản sau: [4] Phá vỡ thành tế bào: Tế bào của thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào hay còn gọi là thành tế bào. Vỏ tế bào thực vật như một lớp thành bảo vệ rất vững chắc và tạo hình ổn định cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có rất nhiều pectin, các chất pectin được xem như chất kết dính gắn các tế bào với nhau thành một khối vững chắc. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện tốt cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào một cách dễ dàng và triệt để. Các chế phẩm enzyme không những chứa pectinase mà còn có chứa các enzyme trong nhóm của cellulase. Các loại enzyme này sẽ góp phần làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt và tăng năng suất hơn. 14 Làm trong nước quả: Nước quả sau khi được tách ra khỏi tế bào vẫn còn chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng nhiều nhất và pectin thường gây hiện tượng nhớt và làm đục nước quả. 1.3.5. Nguồn thu nhận enzyme pectinase 1.3.5.1. Thực vật Enzyme pectinase có nhiều trong lá, thân, củ và quả ở thực vật. Ví dụ như trong củ khoai tây, cà rốt, trong cà chua, táo, trong cỏ chẻ ba... Nhưng ở thực vật người ta có thể tìm thấy chỉ có enzyme pectinsterase [3]. 1.3.5.2. Vi sinh vật Nếu ở thực vật thường hiện diện chỉ một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một hệ enzyme rất phong phú. Vi sinh vật hiện diện rộng rãi trong thiên nhiên bao gồm cả trong đất, nước, không khí cả hiếu khí lẫn kị khí. Những loại vi sinh vât này đóng vai trò quan trọng đối với vòng tuần hoàn cacbon tự nhiên. Những vi sinh vật cũng được ứng dụng rất lớn trong các ngành công nghiệp ví dụ như công nghiệp đay, gai, giấy...[3] Vi sinh vật phân giải pectin hầu như có mặt ở tất cả các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Cụ thể liệt kê như sau:[11] Nấm mốc: Asp. Ficuum, Asp. Niger, Asp. oryzae, Asp. Awamori, Asp. terreus, Asp. saitoi, Asp. campestris, Asp. chrysogenum, pen. capanam, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia sclerotiorumr, Botritis cinerea, pen. glaucum, pen. chrlichii, con. diploiella, Mucor mucedo, Rhizopus tritici,... Nấm men: Sac. ellipsoideus, Sac. fragilis, Sac. ludwigii,... Vi khuẩn: Bac. Polymixa, Bac. Speccies, Bac. Felseneus, Erwinia, Clostridium roseum, Bacterium, Pseudomonas fluorescens,.... 1.3.5.3. Phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase không giống nhau ở tất cả vi sinh vật. Có loài chỉ chứa một enzyme duy nhất, có loài thì tạo ra một phức hệ enzyme. Có kiểu enzyme hiện diện ở một loài với số lượng lớn nhưng lại không tìm thấy ở một loài khác. Nhưng nhìn chung, người ta thấy rằng thường nấm mốc tạo ra một phức hệ