Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất Acarbose từ chủng Actinoplanes SP

  • Số trang: 84 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 37 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27700 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên đã hƣớng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tâp. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng nhƣ chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đi học và hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến MỤC LỤC MỤC LỤC ....................................................................................................................i DANH MỤC BẢNG BIỂU ..................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH VẼ .......................................................................................... viii BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT...................................................................xi MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Khái quát về acarbose ..........................................................................................3 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose ............................................................................3 1.3. Vai trò của acarbose .............................................................................................5 1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đƣờng ............................................5 1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose ................................................8 1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose .............................................9 1.4.1. Đại cƣơng về Actinoplanes ...............................................................................9 1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ..............................................................10 1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose ............................................11 1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới ......................................................12 1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose ....................................................................12 1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật ..........................................16 1.5.3. Các phƣơng pháp tinh sạch và thu nhận acarbose ..........................................17 1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nƣớc ......................................................20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................23 2.1. Vật liệu và hóa chất ............................................................................................23 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................23 2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................23 2.1.3. Môi trƣờng ......................................................................................................23 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ..........................................................................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................25 2.2.1. Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật .................................................................25 2.2.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ......................................................................................................... 25 2.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ..................................................................26 2.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy .................................26 2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy .................................26 2.3. Gây đột biến bằng NTG .....................................................................................26 2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC ........................................................................................27 2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose .....................................27 2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose ........................................................................28 2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ ..........................................................................28 2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột ................................................................29 2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ................................................................................31 2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ .................................................................................31 2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hƣởng từ hạt nhân ...................31 2.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................33 3.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy ...........................................................................33 3.2. Tối ƣu các thành phần môi trƣờng và các điều kiện nuôi cấy ...........................35 3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian .................................................................................35 3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn maltose........................................................................37 3.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn glucose ........................................................................38 3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn bột ngô ........................................................................40 3.2.5. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng .......................................................................41 3.2.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ...................................................................42 3.2.7. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc ...............................................................................43 3.2.8. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tối ƣu .........................................................44 3.2.9. Xác định hàm lƣợng acarbose bằng HPLC .....................................................45 3.3. Gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ............................................46 3.4. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase ......................................48 3.4.1. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ....................................................................................48 3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel ......................................................48 3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100.............................................49 3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1 .............................................................50 3.4.2. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua cột than 1 ...........51 3.4.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 .............................51 3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose ..............................51 3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose ......................................................................52 3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase .......................................................................55 3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose ...................................................................56 3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose .............................................................59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................60 Kết luận .....................................................................................................................60 Kiến nghị ...................................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61 PHỤ LỤC ..................................................................................................................68 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ............................................23 Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ......................................24 Bảng 2.3. Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu ........................................................25 Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose ...........................55 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose ...................................................................3 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non ..........................................4 Hình 1.3. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 .......................................11 Hình 3.1. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các môi trƣờng lên men .........................................................33 Hình 3.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trong các môi trƣờng lên men ................34 Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian ..................................................................................35 Hình 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian. .................................................36 Hình 3.5. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...............................................................................................................37 Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ glucose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ..........................................................................................................39 Hình 3.7. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ bột ngô đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ..........................................................................................................40 Hình 3.8. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...............................................................................................................41 Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ..........................................................................................................43 Hình 3.10. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...............................................................................................................43 Hình 3.11. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trƣờng trƣớc và sau tối ƣu .....................................................................................................44 Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 916 trong môi trƣờng tối ƣu .....................................................................45 Hình 3.13. Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng đột biến của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ..................................................................47 Hình 3.14. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...........................................47 Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ......................................................48 Hình 3.16. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột silica gel .................................................49 Hình 3.17. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột sephadex G100 .......................................49 Hình 3.18. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1 .......................................50 Hình 3.19. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400. .....................................................................................51 Hình 3.20. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose .......................................................................................52 Hình 3.21. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 ..........................................................................................................................52 Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của chuẩn acarbose .............................53 Hình 3.23. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. ........................................................................54 Hình 3.24. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...........................................................54 Hình 3.25. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch .....................................55 Hình 3.26. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...............................................56 Hình 3.27. Phổ proton 1H-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. ........................................................................57 Hình 3.28. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. .........................................................................................................58 Hình 3.29. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ....................................................................................59 BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon-13, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13) 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) cs Cộng sự ĐTĐ Đái tháo đƣờng NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) NTG N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside Rf Độ di động TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến MỞ ĐẦU Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) hiện nay là một vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn cầu, ảnh hƣởng đến nhiều ngƣời, nhất là trong độ tuổi lao động trên toàn thế giới. Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có 3,4 triệu ngƣời chết do đái tháo đƣờng, trong đó 80% các ca tử vong xảy ra ở những nƣớc đang phát triển. Hiện nay trên thế giới có 347 triệu ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng, có 90% số ca mắc đái tháo đƣờng type 2. Chi phí về y tế dành cho căn bệnh này đã tăng lên 465 tỷ USD (Dehghan, Gagari, 2013). Ở Việt Nam, theo tổng hội Y học Việt Nam, năm 2012 có 5,7% dân số mắc ĐTĐ và 12,8% số ngƣời mắc rối loạn dung nạp đƣờng. Với tỷ lệ bệnh nhân tăng 810% mỗi năm, Việt Nam trở thành nƣớc có tỷ lệ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh nhất thế giới. Chi phí điều trị ĐTĐ chiếm 6% ngân sách của ngành Y tế và hầu hết đều tập trung cho biến chứng của ĐTĐ nhƣ: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù lòa, hoại tử chi, suy thận gây ra (Công Sơn, Thế Ân, 2013). Các thuốc điều trị ĐTĐ type 2 chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase nhƣ: acarbose, miglitol, voglibose, 1-deoxynojimycine. Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đƣờng pseudo-oligosaccharide có tác dụng kìm hãm hoạt động của α-glucosidase, là enzyme chuyển hóa các oligosaccharide thành glucose và monosaccharide trong ruột non, với ƣu điểm làm giảm đƣờng huyết sau ăn, không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đƣờng. Do đó, acarbose đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2, tạo cho bệnh nhân khả năng kiểm soát hàm lƣợng đƣờng trong máu tốt hơn sau khi ăn thức ăn chứa tinh bột. Acarbose đƣợc sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật khác nhau nhƣ Streptomyces, đặc biệt là chủng Actinoplanes. Hiện nay, ở Việt Nam nhu cầu sử dụng dƣợc phẩm để sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc ngoài với giá thành cao, hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc nhƣ quả mƣớp đắng xanh có chứa hoạt chất charantin, Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 1 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến glycosid steroid có tác dụng hạ đƣờng máu, làm tăng khả năng dung nạp glucose của ngƣời bệnh; dây thìa canh chứa gymnemic acid làm tăng tiết insulin của tuyến tụy; bạch truật có hoạt chất achactan A, B và C có tác dụng hạ đƣờng máu; cam thảo đất có hoạt chất amellin có thể làm giảm đƣờng máu và các triệu chứng của bệnh ĐTĐ type 2... Tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu từ thảo dƣợc phụ thuộc nhiều vào thời vụ, với hàm lƣợng hoạt chất thấp, số nguyên liệu sử dụng phải rất nhiều, một số thảo dƣợc quý hiếm ngày càng khan hiếm. Do đó, việc sản xuất các hoạt chất bằng sử dụng nguồn vi sinh vật đang là một hƣớng nghiên cứu mới và cấp thiết. Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế, sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161” trong khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm với các mục tiêu: (1) Tối ƣu đƣợc môi trƣờng lên men thu nhận hoạt chất acarbose từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng xuất cao; (2) Nâng cao khả năng sản xuất hoạt chất acarbose bằng phƣơng pháp gây đột biến; (3) Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 2 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về acarbose Acarbose là một pseudo-oligosacharide có tên hóa học O{4,6-dideoxy-4[1S(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-glucopyranosyl}-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose. Acarbose có cấu trúc lõi acarviosyl gồm một nửa valienamine liên kết với 4-amino-4,6dideoxyglucose qua liên kết N-glycosidic (Hình 1.1). Acarviosyl liên kết với phân tử maltose qua liên kết α-1,4 tạo nên phân tử acarbose hoàn chỉnh (Truscheit, et al., 1981, Wehmeier, 2003). Acarbose thành phẩm có dạng bột màu trắng, trọng lƣợng phân tử 645,6, có thể hòa tan trong nƣớc, trong ethanol, methanol, có pKa 5,1 và công thức phân tử C25H43NO18. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose Acarbose là một chất ức chế cạnh tranh. Khả năng ức chế cạnh tranh của acarbose có đƣợc là nhờ vào cấu tạo phân tử của nó. Acarbose có cấu trúc và kích thƣớc gần giống với một tetrasachacride: gồm có bốn tiểu phần nhỏ cấu tạo nên. Bốn tiểu phần này nối với nhau bằng liên kết α-1,4 giống nhƣ trong phân tử đƣờng. Do đó, acarbose có thể liên kết dễ dàng với α-glucosidase, cạnh tranh vị trí liên kết với các oligosaccharide (Hình 1.2). Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 3 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non (Bischoff, 1994) Khi ăn, tinh bột bị α-amylase thủy phân thành các oligosaccharide; ở màng ruột non, α-glucosidase tiếp tục thủy phân oligosaccharide, trisaccharide và disaccharide thành glucose và các monosaccharide khác. Acarbose liên kết trực tiếp với αglucosidase ở bề mặt niêm mạc ruột non, những liên kết trên có thể kéo dài từ 4-6 giờ, khi đó α-glucosidase không thể liên kết để thủy phân oligosaccharide thành glucose. Do đó bệnh nhân tiểu đƣờng tránh đƣợc hiện tƣợng tăng đƣờng huyết sau khi ăn. Acarbose không có hoạt tính ức chế lactase và do đó không gây ra hiện tƣợng không dung nạp lactose trong cơ thể (Công báo số 119, Bộ Y tế, 2012). Hấp thu acarbose: sau khi uống phần lớn acarbose lƣu lại trong ống tiêu hóa để đƣợc các enzyme tiêu hóa và chủ yếu là vi khuẩn đƣờng ruột chuyển hóa để acarbose phát huy tác dụng dƣợc lý. Dƣới 2% liều uống đƣợc hấp thụ dƣới dạng thuốc có hoạt tính, trong khi đó khoảng 35% liều uống đƣợc hấp thu chậm dƣới dạng chất chuyển hóa đƣợc tạo thành trong đƣờng tiêu hóa. Nồng độ đỉnh acarbose trong huyết tƣơng khoảng 1 giờ sau khi uống. Nồng độ đỉnh các chất chuyển hóa trong huyết tƣơng từ 14-24 giờ sau khi uống. Chuyển hóa acarbose: acarbose đƣợc chuyển hóa hoàn toàn ở đƣờng tiêu hóa, chủ yếu do vi khuẩn chí đƣờng ruột và một lƣợng ít hơn do enzyme tiêu hóa. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 4 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Đào thải: acarbose hoạt tính đƣợc sử dụng trong huyết tƣơng khoảng 2 giờ, không có hiện tƣợng tích lũy khi uống 3 lần mỗi ngày. 51% liều uống đƣợc đào thải qua phân dƣới dạng acarbose không hấp thu trong vòng 96 giờ. Khoảng 34% liều uống đào thải qua thận dƣới dạng chất chuyển hóa hấp thu. Dƣới 2% liều uống đào thải qua nƣớc tiểu dƣới dạng acarbose và chất chuyển hóa hoạt động (Công báo số 119, Bộ Y tế, 2012). 1.3. Vai trò của acarbose 1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là một nhóm các bệnh chuyển hóa đƣợc đặc trƣng bởi tăng đƣờng máu mãn tính do hậu quả của sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc cả hai trong cơ thể ngƣời bệnh. Trên thế giới, hàng năm căn bệnh ĐTĐ tiêu tốn hơn 132 tỷ USD. Ƣớc tính năm 2010, có trên 221 triệu ngƣời mắc bệnh ĐTĐ, năm 2025 sẽ lên tới trên 400 triệu ngƣời bệnh. Trong đái tháo đƣờng, ĐTĐ type 2 là dạng ĐTĐ thƣờng gặp nhất. Thông thƣờng, với bệnh ĐTĐ type 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhƣng các tế bào không thể sử dụng nó. Điều này đƣợc gọi là đề kháng insulin. Theo thời gian, đƣờng huyết sẽ tăng cao trong máu. Béo phì và ít vận động sẽ làm tăng nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ type 2 (Công Sơn, Thế Ân, 2013). Các loại thuốc dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2: Các dẫn xuất của sulfonylurea (glibenclamid, glipizid, gliclazid), có tác dụng hạ đƣờng huyết do ngăn cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích tế bào beta ở tụy tiết ra insulin. Các loại thuốc hạ đƣờng máu đang đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ gồm: Nhóm thuốc cải thiện sự nhạy cảm của insulin (glitazon, benfluorex) làm hạ đƣờng huyết, nhờ làm giảm đề kháng insulin, có tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid. Thuốc chữa bệnh ĐTĐ có nguồn từ thực vật chuyển gene, insulin “thực vật”. Gene tổng hợp insulin đƣợc cấy vào cây hoa rum để tổng hợp insulin; thuốc chữa bệnh ĐTĐ có nguồn gốc từ thảo mộc, chế phẩm dikamo đƣợc phối chế từ cao quả mƣớp đắng và cao quả nhàu dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Quả mƣớp đắng (Monordica Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 5 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến charantia) chứa charantin có hoạt tính ức chế α-glucosidase, hợp chất monordicosid làm giảm đƣờng huyết, có hoạt tính nhƣ insulin (Phạm Hữu Điển, 2003). Quả nhàu (Morinda citrifolia) làm tăng cƣờng miễn dịch, hỗ trợ việc trị bệnh ĐTĐ type 2 (Vũ Ngọc Lộ, 2005). Cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre) có hoạt chất chính là gymnemic acid làm tăng tiết, tăng cƣờng hoạt lực của insulin tuyến tụy, ức chế hấp thu glucose ở ruột, giảm cholesterol và lipid máu, làm dƣợc liệu quý cho ngƣời bệnh ĐTĐ ở Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Nhật, Singapore từ lâu (Trần Văn Ơn, et al., 2008). Ngoài ra cây é tía (Ocimum tenuiflorum), dừa cạn (Catharanthus roseus), hoài sơn (Dioscorea persimilis) dùng để điều chế hoạt chất metformin chữa bệnh ĐTĐ (Vũ Ngọc Lộ, 2005); nhóm thuốc ức chế men α-glucosidase dùng điều trị ĐTĐ type 2: acarbose, miglitol, voglibose, có thể dùng một mình hoặc kết hợp với insulin hoặc các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ khác. Acarbose là một oligosaccharide phức tạp có tác dụng ức chế việc tiêu hóa carbohydrate, kìm hãm sự gia tăng nồng độ đƣờng trong máu sau bữa ăn. Acarbose làm giảm mức độ glycosyl hóa hemoglobin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2. Hệ thống phi enzyme protein-đƣờng nhƣ đƣợc phản ánh theo mức độ đƣờng huyết, làm chức năng duy trì nồng độ đƣờng huyết trung bình trong cơ thể. Vì vậy, acarbose có thể kiểm soát hàm lƣợng đƣờng trong máu của bệnh nhân sau khi ăn. Acarbose là chất ức chế enzyme α-glucosidase trong ruột, làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrate. Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban ngày ít dao động hơn . Do đó, acarbose đã đƣợc sử dụng là thuốc điều trị ĐTĐ type 2 với ƣu điểm không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đƣờng. Acarbose không có hoạt tính ức chế chống lại lactase và do đó sẽ không gây ra hiện tƣợng không dung nạp lactose trong cơ thể. Ngoài ra, acarbose có thời gian bán hủy tƣơng đối lâu, khoảng từ 6-8 giờ và đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong ruột ngƣời. Các sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là dẫn xuất của 4-methylpyrogallol không độc. Một phần nhỏ đƣợc hấp thụ vào máu sẽ đƣợc bài tiết qua đƣờng nƣớc tiểu (Lê Văn Chi, 2004). Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 6 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Hiện nay, acarbose đƣợc nhiều công ty dƣợc phẩm sản xuất và bán ở 110 nƣớc trên thế giới với nhiều tên thƣơng mại khác nhau nhƣ: glucobay® (Châu Âu và Trung Quốc), precose® (Mỹ), glucor® (Pháp) và prandase® (Canada). Ở nƣớc ta Công ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất viên nén có tên thƣơng mại glumeca, glucobay với hàm lƣợng 100 mg acarbose. Thuốc acarbose đƣợc dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu khác nhƣ sulfonylurea, metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Khi dùng liệu pháp một thuốc, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylate (0,6 đến 1%), giảm hemoglobin glycosylate tƣơng quan với giảm nguy cơ biến chứng vi mạch ở ngƣời đái tháo đƣờng. Trái với thuốc đái tháo đƣờng sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết insulin. Acarbose cũng không gây giảm glucose máu lúc đói khi dùng đơn trị liệu ở ngƣời. Khi dùng điều trị phối hợp với thuốc sulfonylurea chúng sẽ có tác dụng cộng hợp do cơ chế tác dụng của hai loại thuốc này khác nhau. Do đó, acarbose không gây tăng cân và cũng không làm giảm tác dụng hƣớng đến insulin của sulfonylurea. Hiệu quả điều trị ĐTĐ type 2 bằng acarbose đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu: Mori và cs (2011) đã đánh giá ảnh hƣởng của acarbose đến sự biến động glucose ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng cách giám sát glucose liên tục (continuous glucose monitoring, CGM). CGM đƣợc thực hiện trong 4 ngày, với hàm lƣợng 300 mg acarbose/ngày. Tổng cộng 10 bệnh nhân (5 nam và 5 nữ), với độ tuổi trung bình 63,1±12,1 tuổi, chỉ số khối cơ thể 22,6±5,4 kg/m và glycohemoglobin là 9,9±1,9%. Trong thời gian điều trị với acarbose, ba giá trị trung bình (hàm lƣợng glucose trong máu, SD của glucose máu, biên độ đƣờng huyết giao động bất thƣờng) đều giảm đáng kể sau 24 giờ ở nhóm bệnh nhân điều trị so với nhóm không điều trị. Nhƣ vậy acarbose đã làm giảm đƣờng huyết dao động quá mức ở ngƣời (Mori, et al., 2011). Tsujino và cs (2011) đã so sánh sự biến đổi glucose ở 10 bệnh nhân ĐTĐ type 2 đƣợc điều trị với miglitol và acarbose qua giám sát glucose liên tục (CGM) trong 4 ngày nhập viện. Bệnh nhân đƣợc uống 50 mg miglitol hoặc 100 mg acarbose trƣớc Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 7 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến mỗi bữa ăn trong ngày thứ 2 và ngƣợc lại vào ngày thứ 3, theo một thử nghiệm ngẫu nhiên. Các bệnh nhân đã có ba bữa ăn thử nghiệm giống hệt nhau vào ngày thứ 2 và thứ 3. Các số liệu CGM đã đƣợc so sánh cho từng thông số biến đổi đƣờng huyết sau mỗi bữa ăn. Điều trị miglitol hoặc acarbose không có sự khác biệt nào đáng kể liên quan đến việc tăng nồng độ đƣờng từ mức cơ bản đến mức cao, thời điểm lƣợng đƣờng tăng cao nhất là 3 giờ sau ăn (Tsujino, et al., 2011). 1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose Bên cạnh việc ứng dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2 acarbose còn đƣợc thử nghiệm để sản xuất nhiều loại thuốc phòng và chữa bệnh khác nhƣ: bệnh béo phì, tăng mỡ máu, viêm dạ dày, loét tá tràng, bệnh mục xƣơng ở ngƣời hoặc dùng trong chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt và mỡ trong động vật nuôi (Frommer, et al., 1975) Acarbose có tác dụng làm giảm nguy cơ tim mạch. Một số nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng tăng đƣờng huyết sau ăn có liên quan đến tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Các nghiên cứu này đã so sánh hiệu quả điều trị bằng acarbose và glimepiride đối với hàm lƣợng lipoprotein trong huyết thanh ở 37 bệnh nhân ĐTĐ type 2 mới đƣợc chẩn đoán. Các bệnh nhân đƣợc chỉ định ngẫu nhiên để điều trị trong 12 tuần chia thành 3 nhóm: với acarbose, glimepiride, đối chứng ăn uống bình thƣờng. Kết quả cho thấy việc điều trị bằng acarbose đã làm giảm nguy cơ tim mạch (Hayashim, 2008). Blanch và cs (2010) đã đánh giá khả năng ức chế của acarbose đến hoạt tính của -amylase và -glucosidase trong hỗn hợp lên men ở dạ cỏ đến sự trao đổi chất trong máu và đến hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò sữa Holstein (với chế độ ăn 0,75 g acarbose mỗi ngày). Kết quả cho thấy, việc bổ sung chế độ ăn uống chứa acarbose trong nuôi bò sữa cao sản xuất khẩu có hiệu quả hơn nhƣ: giảm thời gian mà pH dạ cỏ đạt tối ƣu, không có tác động tiêu cực đến quá trình lên men ở dạ cỏ và chuyển hóa máu (Blanch, et al., 2010). Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 8 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose 1.4.1. Đại cương về Actinoplanes Chi Actinoplanes đƣợc công bố đầu tiên bởi Couch năm 1950 với loài chuẩn là Actinoplanes philippinensis (Couch, 1950). Chúng sống chủ yếu trong đất và trong nƣớc, phát triển dƣới dạng sợi, phân nhánh, không đứt đoạn, gram dƣơng, rất ít sợi khí sinh hoặc không có, tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống bào tử hoặc không có, rất ít khi trong thạch. Bào tử hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử, bào tử có thể di động khi túi bào tử nứt ra (Nguyễn Lân Dũng, 2006). Thành tế bào có chứa meso-2,6-diaminopimelic acid, LL-2,6-diaminopimelic acid, hydroxydiaminopimelic acid và glycine (Lechevalier H, Lechevalier M, 1970). Thành phần đƣờng có chứa D-xylose và L-arabinose. Thành phần phospholipid chính là phosphatidylethanolamin. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73% (Schwientek, et al., 2012). Actinoplanes là những sinh vật hiếu khí, hóa dị dƣỡng, ƣa ẩm, ƣa nhiệt vừa phải, phát triển trong điều kiện 15 đến 37oC, thích hợp từ 2528oC. Chúng ăn các sinh vật hoại sinh, hạt phấn và các vật liệu sinh học chứa chitin, sử dụng tốt các thành phần trong tế bào thực vật nhƣ xylose và arabinose. Chúng sống thành các tập đoàn và có hình dạng xác định, ở giữa phồng lên phát triển bào tử nang. Tập đoàn có màu cam hoặc vàng tùy thuộc vào thành phần chất màu trong nguyên sinh chất của tế bào (Parenti, Coronelli, 1979). Actinoplanes có vai trò quan trọng trong công nghiệp và dƣợc phẩm nhƣ sản xuất kháng sinh, amino acid, bổ sung vào thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh... (Ventura, et al., 2007). Tính đến tháng 10 năm 2011 có tới 11% các dự án về genome liên quan đến Actinomycetes mà chủ yếu liên quan đến chi Actinoplanes. Đã phân lập đƣợc hơn 200 loài xạ khuẩn hiếm trong đó có hơn 45 loài có vai trò quan trọng, có hơn 120 loại kháng sinh đã đƣợc công bố sản xuất từ các loài này với thành phần là peptide và depsipeptide, đặc biệt là glycopeptide teicoplanin đƣợc sản xuất bởi A. teichomyceticus điều trị bệnh nhiễm trùng gây ra bởi các vi khuẩn gram Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 9
- Xem thêm -