Tài liệu Một số yếu tố thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI — C 53 ★ B O — NGUYỄN THANH HUYỀN MỘT • SỐ YẾU TỐ THƯỜNG GẶP • TRONG KIỂM NGHIỆM • DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC s ĩ KHÓA 2002-2007) Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Viết Thân Nơi thực hiện : Bộ môn Dược Liệu Thời gian thực hiện : 09/2006 đến 05/2007 HÀ NỘI, THÁNG 05 NĂM 2007 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình hoàn thành khóa luận này tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ thầy cô và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Viết Thân Người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình làm thực nghiệm và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược liệu, các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng đào tạo cùng toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời tôi xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Thanh Huyền MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề.......................................................................................... 1 Phần l:Tổng quan............................................................................ 3 1.1. Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu......................... 3 1.2. Phân loại tạp.............................................................................. 5 1.2.1. Côn trùng.................................................................................. 6 1.2.2. Nấm mốc.................................................................................. 7 1.2.3. Hạt phấn................................................................................... 10 1.2.4. Các yếu tố khác......................................................................... 11 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả..................................................... 13 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu....................... 13 2.1.1. Nguyên liệu......................................................................... 13 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................... 13 2.2. Kết quả thực nghiệm........................................... 14 2.2.1. Hình ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm nghiệm dược 14 liệu bằng kính hiển v i........................................................................ 2.2.2. Sơ bộ điều tra tạp trên dược liệu................................................ 41 2.2.3. Kiểm nghiệm mẫu tìiuốc có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường... 44 Kết luận và đề xuất.......................................................................... 45 Tài liêu tham khảo ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay trên thị trường đã và đang lưu hành ngày càng nhiều sản phẩm thuốc đông y được sản xuất theo phương thuốc cổ truyền. Tuy nhiên chất lượng của các loại thuốc này vẫn đang còn là câu hỏi lớn cho các nhà quản lý. Đảm bảo chất lượng của thuốc cần phải có sự kết hợp chặt chẽ trong các khâu từ kiểm tra nguyên liệu ban đầu, giám sát quy trình sản xuất, kiểm định thành phẩm, bán thành phẩm...Do vậy việc kiểm tra dược liệu ban đầu là rất quan trọng. Như ta đã biết, mục đích của kiểm nghiệm dược liệu là xác định tính đúng và chất lượng của chúng. Tứih đúng và chất lượng của dược liệu cần phải được đánh giá thông qua sự kết hợp của các phương pháp: cảm quan, phương pháp hiển vi và hóa học. Từ xưa ông cha ta đã có câu: Tam đại lương y Bất vi hoàn tán Tức là dù rất giỏi (làm lương y đến 3 đời) nhưng vói loại thuốc bao gồm hỗn hợp các thành phần đã tán nhỏ thì cũng không cách nào nhận biết được. Tuy nhiên, sự rấ đòi của kính hiển vi và phương pháp kiểm nghiệm dược liệu bằng hiển vi đã làm thay đổi quan niệm này. Kiểm nghiệm bằng kính hiển vi có ưu điểm là không chỉ nhận biết được dược liệu đơn thành phần mà còn phát hiện được sự có mặt của dược liệu trong hỗn hợp. về nguyên tắc, phương pháp này được tiến hành sau khi kiểm nghiệm sơ bộ bằng cảm quan và trước khi áp dụng các phương pháp hóa học hay thử tác dụng sinh lý đối vói một dược liệu. Trong quá trình kiểm nghiệm bằng kính hiển vi, ta không chỉ thấy được đặc điểm đặc trưng để nhận biết dược liệu mà còn gặp những đặc điểm lạ có nguồn gốc khác nhau hay các yếu tố hữu hình như nấm mốc, côn trùng. Sự có mặt của những đặc điểm này có thể là dấu hiệu của lẫn tạp dược liệu hay dược liệu kém chất lượng. Các đặc điểm tìm thấy này nếu được nghiên cứu kỹ lưỡng có thể là những yếu tố rất quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu. Do đó để tạo cơ sở cho việc kiểm định dược liệu có hiệu quả hơn chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Một sô'yếu tố thường gặp trong kiểm nghiêm dược liệu bằng kính hiển Vỉ”. Mục đích của đề tài nhằm góp phần nâng cao hiệu quả kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi. Nội dung đề tài bao gồm: - Phát hiện các yếu tố thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi - Mô tả và nghiên cứu đặc điểm các yếu tố - Lập danh sách các yếu tố tạp trong 1 số dược liệu nhất định - Kdểm định một số mẫu thuốc trên thị trường PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu Từ thời xa xưa con người đã tìm cho mình thức ăn, vị thuốc trong cây cỏ và tập phân biệt cây độc. Đầu tiên các hiểu biết này được truyền miệng, sau được ghi lại, và trong các nền văn minh cổ xưa nhất còn tồn tại dấu tích dùng cây làm thuốc. Khối tri thức về dược liệu trên thế giới cứ thế dần phát triển, đáng chú ý là Teophorat viết cuốn lịch sử cây cỏ mô tả chính xác về thực vật, Dioscorid (người Hy Lạp) thống kê 500 vị dược liệu nguồn gốc thực vật, động vật và khoáng vật trong cuốn “Dược liệu học” (De Materia medica) [2], [17]. Khoảng đầu thế kỷ xvn, ngành dược liệu với nhiệm vụ là xác định, kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm được tách khỏi ngành y. Người ta bước vào giai đoạn khoa học dựa trên quan sát và thực nghiệm Cùng với tập lịch sử đại cương về dược liệu (1675) của Pome và quyển khảo luận phổ cập về dược liệu đơn (1697), người ta thu được kiến thức chính xác hơn về giới thực vật. Việc mô tả và phân loại dược vật được phát triển mạnh mẽ đặc biệt bởi các nhà khoa học Pháp. Các công trình này có ảnh hưcmg sâu sắc đến bộ môn dược liệu là xác định thực vật 1 cách chính xác, đây cũng chính là điểm xuất phát cơ bản của môn học này [17]. Đặc biệt, khi nhà khoa học Dragendorff tìm ra thuốc thử định túih alcaloid trong cây, kiểm nghiệm Dược liệu thực sự bước sang môt trang mới. Hóa học đã bắt đầu được đưa vào kiểm nghiệm dược liệu. Sau này, một hình thái mới của việc nghiên cứu được nảy nở vói sự phát triển của môn sinh lý. Tương quan giữa cấu trúc hóa học của các thành phần và tác dụng đã trở nên hiển nhiên vào cuối thế kỷ XIX. Như vậy, dần xuất hiện 3 mặt hoạt động của môn Dược Liệu: Kiểm nghiệm dược liệu bằng thực vật, nhiều khi đã đủ để xác định dược liệu, khảo sát thành phần hóa học và nhất là các hoạt chất, khảo sát tác dụng sinh lý là việc kiểm tra việc sử dụng trong điều trị. Môn dược liệu bắt đầu phát triển ở Việt Nam từ khi các nhà khoa học Pháp đưa môn này vào trong chương trình học ở trường Đại học Đông Dương. Nhờ đó ngành dược liệu của Việt Nam được kế thừa khối lượng tri thức của các nhà khoa học, thực vật học Pháp mà lúc này kiểm nghiệm bằng hiển vi đã đạt trình độ cao. Hơn nữa, Việt Nam có quan hệ thân thiết với các nước xã hội chủ nghĩa khác như Nga, Bungary, Hungary nên ngành Dược liệu nước ta cũng được kế thừa thành tựu khoa học của các nước này với kiểm nghiệm hóa học đã bắt đầu phát triển. Từ sau cách mạng tháng 8-1945 đến nay, nhà nước rất quan tâm đến việc phát triển Y học cổ truyền. Đặc biệt GS. TS. Đỗ Tất Lợi, tác giả cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, được coi như là cầu nối của Y Dược học hiện đại và Y Dược học dân tộc. * Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi: Đầu thế kỷ XX, môn Dược liệu được phát triển gần như chỉ theo hướng thực vật. Đầu tiên việc mô tả dược liệu đơn thuần chỉ là hình thái. Việc mô tả không đơn thuần đề cập đến các dược liệu mà còn nói đến giả mạo. Sau đó người ta đưa các đặc điểm vi học vào việc nhận thức và giám định [17]. Bao giờ phần này của môn Dược liệu cũng là cơ bản vì nếu không xác định thực vật một cách chính xác thì không có khảo sát hóa học và sinh lý cố giá trị [17]. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là muốn kiểm định được dược liệu thì cần phải biết trước các dược liệu đó có đặc điểm gì. Nếu trong quá trình kiểm nghiểm có các đặc điểm lạ thì chúng bị coi là tạp. Được phát minh bởi nhà khoa học Leeuwenhoek vào thế kỷ đầu được đưa vào sử dụng từ đầu thế kỷ xvn và bắt xvni, kính hiển vi sau đó được áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu. Khi đó, các đặc điểm quan sát thấy được các nhà khoa học, thực vật học vẽ lại. Dù các hình ảnh này được vẽ tương đối tỉ mỉ và đã phần nào mô tả chính xác các đặc điểm nhưng chúng vẫn mang tính chất chủ quan và phụ thuộc nhiều vào người vẽ [11]. Ngày nay, do yêu cầu về độ chính xác ngày càng cao cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, máy ảnh đã được đưa vào sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu với mục đích chụp lại những hình ảnh quan sát được. Do vậy, hình ảnh thu được là hoàn toàn khách quan và chính xác. Hiện nay, máy ảnh được sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau như: máy kỹ thuật số gắn vào kính hiển vi, camera với một đầu được gắn với máy tính nhằm lưu lại ảnh chụp các đặc điểm dưới dạng file ảnh [14]. Khoa học kỹ thuật phát triển đã đưa vào sử dụng nhiều loại kính hiển vi khác nhau. Nếu trước đây các nhà khoa học chỉ sử dụng kính hiển vi sinh học trong kiểm nghiệm vi học, thì ngày nay nhiều loại kính khác đã được ứng dụng như kứứi hiển vi phân cực dùng để soi tinh thể dựa trên sự bất đẳng hướng về mặt quang học của chất, kứứi hiển vi so sánh nhằm so sánh các mẫu khác nhau về mô học hay hóa học, kính hiển vi điện tử giúp thu được hình ảnh không gian 3 chiều của đặc điểm hay yếu tố cần nghiên cứu. Ngoài ra, người ta còn sử dụng 1 hệ thống các kính hiển vi nối với nhau để chia sẻ hình ảnh hay chuyển hình ảnh từ kính hiển vi ra projector để phục vụ công tác giảng dạy [14]. 1.2. Phân ỉoại tạp Do có nguồn gốc từ thực vật và động vật nên dược liệu rất dễ bị nhiễm các loài nấm mốc, sâu bọ. Hơn nữa, trước khi đưa dược liệu vào kho bảo quản, dược liệu ttong quá trình thu hái, vận chuyển cũng không tránh khỏi khả năng bị lẫn tạp như bụi bẩn hay thành phần của các dược liệu khác. ĩQứ kiểm nghiệm một dược liệu bất kỳ bằng phương pháp hiển vi ta cần biết đặc điểm các yếu tố của dược liệu đó theo các tài liệu chính thống. Trong quá trình kiểm nghiệm nếu phát hiện có đặc điểm không thuộc về dược liệu thì đó là tạp. Các tài liệu phân chia tạp theo nhiều cách khác nhau, trong khóa luận này chúng tôi phân chia các yếu tố tạp trong dược liệu theo nguồn gốc: - Côn trùng (trứng, sâu non, nhộng, thành trùng). - Nấm mốc (cây nấm, bào tử, sợi nám). - Hạt phấn. - Các yếu tố khác: giọt dầu Parafin, vân kính. Như vậy, với khái niệm về tạp như trên, có những thành phần không phải lúc nào cũng là tạp. Ví dụ ở một số tài liệu phấn hoa trong mật ong (Mel) được coi là tạp, trong khi ở những tài liệu khác phỗứi hoa lại chúứi là đặc điểm của mật ong. 1.2.1. Côn trùng Dược liệu thường có tinh bột và các chất dinh dưỡng khác như Aavonoid, saponin... Trong điều kiện bảo quản với nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, dược liệu là môi trường sống của rất nhiều loại côn trùng. Do vậy, dược liệu bị nhiễm côn trùng là điều khó tránh khỏi. Khi soi bột dưới kính hiển vi, côn trùng có thể được phát hiện ở nhiều dạng khác nhau: nguyên dạng hay riêng lẻ từng bộ phận (chân, râu, đầu...), v ề cấu tạo, côn trùng có thân chia làm ba phần rõ ràng: đầu, ngực, bụng. Ngực chia làm 3 đốt, mỗi đốt có 1 đôi chân. Như vậy, từ “côn trùng” chỉ dùng để chỉ các loài động vật có 3 đôi chân (6 chân); còn một số loài bọ, mạt thường thấy trong thực phẩm hay dược liệu không được gọi là côn trùng vì chúng có 4 đôi chân, và thưòfng thuộc Ngành chân đốt (hay Ngành chân khớp), lớp nhện (hay lớp 8 chân). Song hầu hết các loài chân khớp nhiễm trong dược liệu thuộc lớp côn trùng]. Trong phạm vi khóa luận này, khái niệm “côn trùng” được dùng để chỉ những loài chân khớp thuộc lớp côn trùng (6 chân) và lớp nhện (8 chân) [1], [10], [13], [20]. Côn trùng là sâu hại của hầu hết các loại cây trồng. Theo thống kê chưa đầy đủ của Hội lương thực thực phẩm Quốc tế (FAO), hàng năm thiệt hại do sâu bệnh gây ra khoảng 83 triệu tấn lương thực. Điều này cho thấy sức tàn phá và số lượng đáng kể của côn trùng, đặc biệt trong môi trường thích hợp như kho lưcmg thực, thực phẩm. Dược liệu với các điều kiện bảo quản tương tự điều kiện bảo quản lương thực, thực phẩm cũng rất dễ bị côn trùng phá hoại [8], [13]. Trước hết cần tìm hiểu các yếu tố thuận lợi cho sự phát triển của côn trùng. Các yếu tố đó là: - Nhiệt độ Thân nhiệt côn trùng và trạng thái cơ thể của nó thay đổi theo sự thay đổi nhiệt độ bên ngoài. Khoảng nhiệt độ thuận lợi cho đa số côn trùng là 15°c đến 38°c, tối ưu là 26°c [9],[10], [13]. - Độ ẩm Côn trùng có kích thước nhỏ, diện tích bề mặt lớn, nên sự bốc hơi nước của cơ thể cũng lớn. Vì vậy, sự phát triển của côn trùng phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm của môi trường. Tùy từng loài mà độ ẩm không khí thích hợp có thể từ 40% đến 100% [9],[10], [13]. 1,2.2. Nấm mốc Tương tự côn trùng, nấm mốc rất dễ phát triển trên các loại dược liệu (cơ chất) khác nhau do điều kiện sinh sống (không khí, nước,...) gần với điều kiện bảo quản dược liệu. Việc nghiên cứu tìm ra các yếu tố bất lợi trong bảo quản dược liệu dẫn tới sự phát triển của nấm mốc rất quan trọng giúp hạn chế tối đa sự sinh trưởng của khuẩn ti nấm mốc. Các yếu tố bất lợi đó là: - Nhiệt độ Nhiệt độ có vai trò chủ yếu đối với sinh trưởng của khuẩn ti cũng như đối với sự hình thành và nảy mầm của bào tử. Đa số nấm mốc phát triển trong khoảng 15°c đến 30°c với nhiệt độ tối thích là 25°c đến 30°c [5], [12], [16]. - Độ ẩm Sau nhiệt độ, độ ẩm cũng có ảnh hưỏng rõ rệt lên sinh trưởng của khuẩn ti thể cũng như sự tạo thành và nảy mầm của bào tử. Tùy từng loài mà độ ẩm thích hợp từ 80% đến 100% [5], [12], [16]. - Các yếu tố khác Ngoài nhiệt độ và độ ẩm, yếu tố dinh dưỡng và một số các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển (sinh trưởng và sinh lý trao đổi chất) ở mốc. Do đó, một số loài mốc chỉ phát triển tối thích trên một số loại cơ chất nhất định. Hầu hết nấm mốc sống trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên mức độ không như nhau: các loài thuộc giống Mucor và Trichoderma đòi hỏi nồng độ O2 cao hơn, do đó thường sinh trưởng ở bề mặt cơ chất, hay trên bề mặt các dược liệu [12]. Ngoài ra, thời gian cũng là một yếu tố quan trọng. Dưới điều kiện bất lọi, thời gian cần cho sự nảy mầm của bào tử hoặc conidi tới 10 ngày, trong khi gặp điều kiện thuận lợi, thời gian này là 1 ngày [12]. Nguồn mốc trên dược liệu có thể là địa điểm bảo quản (tường, trần, nền nhà, bao bì...) trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Từ đó bào tử của chúng phát tán vào không khí hay được các giọt nước nhỏ, các hạt bụi mang theo và nhiễm vào dược liệu trong kho một cách dễ dàng. Vì vậy, nếu nhà kho và môi trường xung quanh được đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt thì chắc chắn việc nhiễm mốc dược liệu sẽ giảm đi đáng kể. * Một số loại nấm thường gặp trên dược liệu Chi nấm cúc Aspergillus là chi nấm rất phổ biến bởi sự có mặt của chúng trên mọi loại cơ chất khác nhau, sự phát triển của chúng cũng rất nhanh nên vẫn thường được ví như 1 loại cỏ dại trong phòng thí nghiệm. Hệ sợi và giá bào tử trần có thể không màu hay màu nâu, xám đen. Giá bào tử trần không phân nhánh, mọc trực tiếp trên sợi nấm khí sinh hay sợi nấm nằm chìm trong cơ chất, phần cuối phình to lên được gọi là bọng đỉnh giá. Bọc đỉnh giá có dạng hình cầu, gần cầu, thuôn dài..., trên bề mặt có các tế bào sinh bào tử có thể có cuống hay không và có thể xếp kín mặt bọng hay 1 phần. Tế bào sinh bào tử có dạng gần giống cái bình nên thường được gọi là thể bình. Các bào tử trần được sinh ra từ miệng thể bình này gọi là chuỗi gốc non, tỏa đều ra mọi phía. Các bào tử trần có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, elip,...Các loài của chi nấm cúc có nhiều ứng dụng trong đời sống và cũng có nhiều loài có độc tố và tác hại gây chết người [3], [5],[6]. - Aspergillus niger Đặc điểm: kích thước của các phân tử có thể thay đổi tùy theo nhiệt độ, sợi không màu, rộng 30 )jm, cuống đmh bào tử thẳng, cứng, trong, dài 1- 2 mm, rộng 7, đầu màu nâu, phồng lên thành hình cầu, đường kính 30- 80 |im, dài hay hình thoi, đôi khi không màu [12], [16]. - Aspergillus fumigatus Đặc điểm: sợi nấm rộng 2- 3, cuống dửứi vào bào tử ngắn, nhẵn, 300500 |am X 2- 8 |am, kéo dài ra bởi 1 đầu hình chùy [12], [16]. - Aspergillus flavas Đặc điểm: Sợi nấm không màu, cuống đính bào tử không màu, phình ra đoạn cuối dài 4- 7mm, rộng 10, đầu to màu lục nhạt, hình cầu ngược, đường kính 30- 40 I^m [6], [9]. - Mucor sp Đặc điểm: Đặc sắc ở chỗ không có giả căn và thân ngầm. Tử nang binh (cuống đính bào tử) thường đơn độc và đơn hoặc phân nhánh rất ít đứng thẳng trên sợi nấm. Bào tử nang hình cầu thành mỏng. Bào tử rất nhiều, hình tròn. Nang trụ lồi ra nhiều trong bào tử nang. Tiếp hợp bào tử hình cầu nhẵn, sẫm màu, có dây treo thẳng [6], [9]. - Rhizopus sp Đặc điểm: Đặc sắc bởi những thân ngầm có những bó giả căn. Cuống tử nang thường thành bó không phân nhánh, phát sinh ở noi có giả căn. Nang trụ to, hình bán cầu. Nang trụ ở trong bào tử hình cầu [6], [9]. *Sợi nấm Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành 1 đám chằng chịt các sợi. Từng sợi thì được gọi là khuẩn ti hay sợi nấm (hypha) [5]. Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục, đo đó không có khả năng quang hçfp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các loại thức ăn hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ti. Mỗi đoạn khuẩn ti khi rơi vào môi trường thích hợp sẽ phát triển nhanh chóng thành 1 đám mốc mới. Ngược lại, trong điều kiện bất lợi (đặc biệt là thiếu nước) thì các đám sợi này không có khả năng sinh trưởng, bị teo lại tạo ra các hình thù khác nhau. 1.2.3. Hạt phấn Hạt phấn chỉ có trên dược liệu có nguồn gốc từ hoa, ví dụ Hoa hòe (Flos Sophorae japonicae), Hồng hoa (Flos Carthami), Sài đất (Herba Wedeliae) [15]. Hạt phấn rất nhẹ, có thể dễ dàng phát tán ra các ncd khác nhờ gió hay côn trùng, và do vậy rất dễ nhiễm vào các dược liệu khác. Trong kiểm nghiệm các bộ phận dược liệu như rễ, thân, lá...có thể bắt gặp hạt phấn của chính dược liệu đó hay dược liệu có nguồn gốc từ hoa khác nhiễm vào. Điều này rõ ràng sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm, đặc biệt với phương pháp kiểm nghiệm bằng kính hiển vi. Đặc điểm chính để phân loại phấn hoa: a. Hình khối hạt phấn: chia làm 3 nhóm - Nhóm hạt phấn hình cầu có mặt phẳng xích đạo là hình tam giác như hạt phấn Dừa cạn. 10 - Nhóm hạt phấn hình cầu có mặt phẳng xích đạo là hình tròn như hạt phấn Sài đất. - Nhóm hạt phấn hình cầu dài có mặt phẳng cực có hình bầu dục, mặt phẳng xích đạo hình tròn như ích mẫu, Cà độc dược [7]. b. Kích thước hạt phấn: Kích thước hạt phấn rất khác nhau giữa các loài, từ 1 vài Ịim đến 240|am. ở những họ thực vật ở vị trí tiến hóa càng cao thì kích thước hạt phấn càng nhỏ, tuy nhiên có 1 số họ có vị trí tiến hóa cao nhưng lại có hiện tượng tăng kích thước hạt phấn như ở 1 vài chi trong họ Malvaceae, Cucurbiaceae,... thì hạt phấn rất to có thể phân biệt được bằng mắt thường [7]. - Hạt phấn có kích thước bé (10-25|xm) như Nhân trần 17|im. - Hạt phâh có kích thước ùung bình (26-49|im) như Hương nhu trắng 39^m. - Hạt phấn có kích thước lớn (50-100)|im như Mò đỏ 78|im [7]. c. Màu sắc hạt phấn: Hạt phấn có màu trắng, xám, xanh, da cam, tím và vàng ở các mức độ khác nhau, Màu sắc hạt phấn phụ thuộc vào chất cấu tạo màng, thông thường là chất sporopollenin có màu vàng nhạt hoặc không màu. Khi xử lý tiêu bản, chất cấu tạo màng chịu tác động trực tiếp .của các hóa chất nên trở thành màu vàng hoặc màu vàng sẫm. ở 1 số loài thực vật, màng hạt phấh còn có các sắc tố như anthocyane, carotenoid... [7] 1.2.4. Các yếu tố khác - Giọt dầu parafin Parafin là chất lỏng trong, không màu, sánh như dầu. Các chế phẩm thuốc đông dược, đặc biệt là viên hoàn trong quá trình sản xuất thường bao bằng một lớp parafin ở ngoài, vừa để tạo độ bóng, tăng tính 11 thẩm mỹ của chế phẩm lại vừa có tác dụng bảo vệ. Do vậy, trong quá trình kiểm nghiệm chế phẩm bằng kính hiển vi, các giọt dầu parafm thường xuyên được tìm thấy. Điều này gây bất lợi trong quá trình kiểm nghiệm vì chúng có kích thước và hình dạng rất dễ nhầm lẫn với các yếu tố cẩn tìm trong bột dược liệu. - Vân kính Với phương pháp hiển vi, kích thước của một vật có thể được phóng to lên hàng chục, hàng trăm lần, do vậy đối với các dụng cụ thí nghiệm như phiến kính, lam kính, chỉ với sự nhiễm bẩn dù mắt thường không nhìn thấy nhưng cũng có thể gây ảnh hưởng lớn đến kết quả kiểm nghiệm dược liệu. Những loại tạp tìm thấy này có thể là nấm, côn trùng ở những dụng cụ không được bảo quản và vệ sinh đúng cách, song chủ yếu là do chất liệu và cách thức sản xuất tạo nên đường vân kính gây ra khó khăn trong kiểm nghiệm. 12 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu là dược liệu và các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu mua ở ngoài thị trường. +Dược liệu mua tại các hiệu thuốc trên phố Hải Thượng Lãn ông. +Các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu mua tại các hiệu thuốc tư nhân: 21 mẫu. 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu. -Quan sát các yếu tố tạp trong bột dược liệu + Quan sát và xác định màu sắc, mùi vị, bước đầu đánh giá về khả năng nhiễm tạp trong bột dược liệu bằng phương pháp cảm quan . + Sử dụng nhiều loại dung dịch lên kính để làm tiêu bản bột dược liệu. Nước là nguyên liệu được sử dụng chủ yếu để soi bột dược liệu. Ngoài ra còn dùng ethanol và dung dịch NaOH 0,1N để soi rõ hơn các yếu tố tạp là nấm mốc. Lấy bột dược liệu đưa vào 1 giọt EtOH 95% đặt sẵn trên lam kính, sau đó lấy bột ra đưa vào 1 giọt NaOH 10% cũng đặt trên lam. Lấy 2 que nhọn gạt cho khuẩn ty dàn mỏng rồi đậy lamen lên trên. Mỗi dược liệu có chứa tạp là nấm đều được tiến hành kiểm nghiệm với 2 loại môi trường là nước và NaOH (sau khi đã được đưa vào EtOH để loại bọt khí). + Quan sát, mô tả đặc điểm các yếu tố tạp dưới kính hiển vi. + Các đặc điểm được chụp lại nhờ hệ thống kính hiển vi Leica gắn với máy ảnh chuyên dụng Canon Powershot 40. 13 - Cố định tiêu bản bằng nến trong: Dùng mũi mác lấy 1 lượng nến thích hợp cho lên lam kúứi, hơ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nến tan chảy hết và cho 1 ít bột dược liệu vào. Dàn mỏng bột thật nhanh sau đó đậy lam lên và ép để tạo độ mỏng nhất định. Tiêu bản để ở nhiệt độ thường cho nguội bớt trước khi đưa lên kính hiển vi để kiểm nghiệm. 2.2 Kết quả thực nghiệm 2.2.1. Hỉnh ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm nghiêm dược lỉệu Sau khi kiểm nghiệm các mẫu dược liệu, chúng tôi xin đưa ra hình ảnh và mô tả các đặc điểm tìm thấy theo cách phân loại ban đầu. A. Côn trùns Trong kiểm nghiệm dược liệu ta thường xuyên bắt gặp các loài côn trùng, bọ cánh cứng nhỏ. Các đặc điểm tìm thấy có thể là hình ảnh toàn bộ cơ thể côn trùng hay chỉ là 1 phần cấu tạo như chân, râu, cánh, mảnh vỡ đầu, bụng... do các phần khác đã bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản. ^Cánh côn trùng Cánh côn trùng là phần lồi ra của mảnh bên và mảnh lưng đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Cánh xuất hiện ở côn trùng đã mở rộng phạm vi hoạt động của chúng. Chức năng của cánh là phát tán, mở rộng phạm vi sinh sống và điều kiện sinh sống đồng thời còn điều chỉnh thân nhiệt, nhiệt độ trong tổ, tạo phương tiện tìm kiếm bắt cặp và bảo vệ nhau [18]. Trừ lớp phụ không có cánh và 1 số loài cánh thoái hóa, hầu hết côn trùng trưởng thành đều có cánh. Cánh 1 số loại côn trùng như muỗi, bướm vàng, bướm đêm có vảy được xếp thành lớp và rất dễ roi rụng, do vậy nếu dược liệu bị nhiễm côn trùng thì trong kiểm nghiệm hiển vi rất dễ tìm thấy các đặc điểm này [18] [19]. 14 Hình 1: vảy cánh côn trùng - Hình l.la : vảy cánh bướm dài 0,lmm, hình quạt, có nhiều răng cưa, cuống dài 0,01mm. Có các đường sọc (song song) trên vảy. - Hình 1.1 b: Vảy cánh bướm dài khoảng 0,15mm, có cuống ở gốc, phần trên mở rộng nhưng không xẻ răng cưa. Trên vảy cũng có các vân sọc từ gốc đến ngọn. - Hình 1.2: Vảy cánh muỗi có kích thước tương tự như vảy cánh bướm, dài khoảng 0,1 mm, cũng có cuống và vân sọc trên vảy. Phần trên mở rộng hơn và không xẻ răng cưa. ^Anten (Râu) Tất cả các loài côn trùng Có cánh (Pterygota) và côn trùng Không có cánh (Apterygota) đều có 1 đôi anten ở sát mé trong hoặc phía trước mắt kép. Anten là đôi phần phụ của 1 trong 3 đốt trước miệng. Anten rất đa dạng nhưng cấu tạo cơ bản giống nhau, gồm 3 phần, thường gọi là 3 đốt: Phần thứ nhất gọi là đốt gốc (scape), phần thứ 2 gọi là đốt cuống (pedicel), phần thứ 3 gọi là roi (Aagellum). Đốt gốc thường dài và mập hơn các đốt khác, khớp với vỏ hộp sọ. Phần roi thường chia thành nhiều đốt nhỏ, cấu tạo biến đổi rất đa dạng tùy từng loài. Kiểu anten thường khác nhau chủ yếu về cấu tạo và hình thái của phần roi. Cấu tạo và hình dáng của anten rất đa dạng, nhưng ổn định đối với từng loài, nên thường được dùng làm đặc điểm phân loại quan trọng. - Hình 2.1 Anten của bọ cánh cứng dạng khúc gãy. - Hình 2.2: Roi anten, dạng sợi, đốt cuống, đốt gốc bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản. *Cỡrt trùng - Hình 2.3: Côn trùng kích thước trung bình, chiều dài 0,17mm, ngang 0,1 Imm, có 3 đôi chân, mình bao phủ bởi 1 lớp lông 15 - Hình 2.4: Động vật thuộc lớp nhện có 4 đôi chân kích thước trung bình, chiều dài 0,2mm, mình lớn (con cái mang trứng sau khi thụ tinh). - Hình 2.5: Côn trùng kích thước lớn, dài Imm, bề ngang 0,3mm. Thân chia làm 3 phần rõ ràng: đầu, ngực, bụng, ở đầu có 1 đôi râu đầu dạng sợi, một đôi mắt kép. Ngực chia làm 3 đốt, mỗi đốt có một đôi chân, ở phía bên của đốt ngực giữa và ngực sau có 1- 2 đôi cánh. Có 8- 11 đốt bụng, mỗi đốt có 1 đôi lỗ thở (trừ 2 đốt cuối cùng). Lỗ sinh dục và hậu môn phát triển ở phía cuối bụng. - Hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4: Động vật thuộc lớp nhện có 8 chân, kích thước lớn. - Hình 4.1: Động vật phía trên có gai màu đỏ hình vương miện, màu đỏ này mất dần đi trong quá trình bảo quản tiêu bản, chiều dài cơ thể 0,5mm. - Hình 4.2: Động vật thuộc lớp nhện có 8 đôi chân. - Hình 4.3: Côn trùng có 3 đôi chân và được bao phủ bcd lớp lông, kích thước trung bình, chiều dài cơ thể 0,12mm. *Chán côn trùng - Hình 5.1; 5.2; 5.5: Các phần khác nhau của chân côn trùng. - Hình 5.3: Các đốt bàn chân với gai và vuốt. - Hình 5.4: Chân côn trùng có giác bám, khoảng cách giác bám khoảng 0,02mm. - Hình 6.1; 6.2; 6.3; 6.4; 6.5; 6.6: Chân nhảy có đốt đùi dài bằng đốt ống. Chân nhảy là kiểu chân mà phần nhiều chân ngực sau biến hóa thành, nhất là đốt đùi trở nên to và mập, đốt chày dài, mảnh. - Hình 6.7: Chân côn trùng, kích thước trung bình 0,15mm. - Hình 72: Chân côn trùng với đốt bàn lớn, kích thước 0,0 Imm. - Hình 7.3: Chân côn trùng, kích thước trung bình, đốt đùi bằng đốt ống dài khoảng 0,2mm. Đốt chậu bị gãy, đốt bàn bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản. 16 - Hình 8.5: Chân côn trùng có các đốt bàn kích thước lớn 0,03mm, có gai 1 vuốt dài. - Hình 8.6: Chân côn trùng kích thước trung bình, có đốt ống được nối tiếp với đốt đùi và đốt bàn đã bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản. - Hình 9.1; 92; 9.3; 9.4: ICiểu chân đi và chạy có cấu tạo gồm 5 phần hay 5 đốt: đốt gốc (coxa), đốt chuyển (trochanter), đốt đùi (femur), đốt ống (tibia) và đốt bàn (tarsus). Đốt chuyển và đốt bàn thường gồm nhiều đốt nhỏ. - Hình 9.5: ơiân côn trùng gồm nhiều đốt bàn. Đốt đùi và đốt ống bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản. *Đầu côn trùng - Hình 10.1: Đầu côn trùng, kích thước lớn. Đầu là phần trước của cơ thể côn trùng. Đầu côn trùng điển hình mang một cặp râu, một cặp mắt kép, một hay nhiều mắt đơn, miệng và chi phụ miệng. *Trứng và nhộng Mỗi loại côn trùng có biến thái hoàn toàn, tức là biến thái trong thời kì hậu phôi trải qua 3 giai đoạn chính: ấu trùng, nhộng và thành trùng. Do vậy khi kiểm nghiệm dược liệu bị nhiễm côn trùng thì việc bắt gặp côn trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau là hoàn toàn có thể. Tuy nhiên, trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, trứng, ấu trùng (sâu non) và nhộng thường bị bỏ qua do hình dạng không đặc trưng, mà chỉ chú ý đến côn trùng ở giai đoạn phát triển cuối cùng là dạng thành trùng. - Hình 10.2: Sâu non thoát trứng. Trứng kích thước nhỏ, chiều dài 0,05mm, bề ngang 0,025mm. Hình ảnh đối xứng 2 bên. Sau khi hoàn thành giai đoạn phát triển phôi, sâu non phá vỡ vỏ trứng chui ra ngoài. Quá trình này được gọi là trứng nở. Trứng nở rất đa dạng, có loài chỉ đơn giản là do hoạt động của sâu /ế ' 17