Tài liệu Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm ah1n109 đại dịch tại việt nam, 2009 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG -------------------------- NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2015 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG -------------------------- NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai 2. PGS.TS. Trần Hải Anh HÀ NỘI – 2015 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc, trung thực. Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Kim Phương iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn: - Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng - Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng - Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108 Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai ngƣời Thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bƣớc đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề tài cấp nhà nƣớc về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Tsutomu Kageyama Trung tâm Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS. Hoàng Vũ Mai Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch, ThS. Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình nghiên cứu đạt đƣợc thành quả ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 01 năm 2015 NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng ix Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG I – TỔNG QUAN ......................................................................... 3 1.1. Vi rút cúm................................................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm vi rút học ............................................................................. 3 1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A ................................................. 10 1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 ........................................................................ 13 1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới ................................... 13 1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trƣớc diễn biến của đại dịch A/H1N1/09. . 19 1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam............................ 20 1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ............................................................. 21 1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN .............. 24 1.3.1. Phân lập vi rút. .................................................................................. 24 1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền ......................................... 26 1.3.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể ..................................................... 30 1.4. Vắc xin ..................................................................................................... 32 1.4.1. Các loại vắc xin cúm ......................................................................... 33 1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm ................................................. 37 1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch ....................... 38 v 1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin ........................................... 38 CHƢƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 41 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 41 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................... 41 2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09........................... 41 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: ........................................................................ 41 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:.......................................................................... 41 2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .................................................... 41 2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu .................................................................. 42 2.2.4. Các biến số nghiên cứu ..................................................................... 42 2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm ......................................................... 43 2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. ................................................... 60 2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu ............................................................... 60 CHƢƠNG III – KẾT QUẢ .......................................................................... 61 3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. ............. 61 3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen. ....................... 62 3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) .................................. 63 3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). .................................. 69 3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. ............................ 74 3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ........................ 84 3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. .. 84 3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay đổi axit amin trong protein HA liên quan. .................................................. 85 3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. ................................ 86 3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide. ..................... 87 vi 3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hƣởng của đột biến đến biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ................................. 89 3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ........................ 90 3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) ............ 93 CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN. ....................................................................... 95 4.1. Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013. ......... 95 4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. .......... 96 4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen ............. 97 4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 ................... 98 4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 .. 101 4.5.1 . Protein HA ..................................................................................... 101 4.5.2 . Protein NA. .................................................................................... 106 4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. ............................. 108 4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ...................... 109 4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). ................................ 112 4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ...................... 113 KẾT LUẬN .................................................................................................. 118 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch (The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009) ADN ARN CDC CPE ELISA FAO GISRS HA HI IC50 IFA ILI IQR ISIRV IVAC MDCK MN NA NAI NIBSC Axit Deoxyribonucleic Axit Ribonucleic Centers for Disease Control (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào) Enzyme-linked immunosorbent assays (Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) Global Influenza Surveillance and Response System (Hệ thống giám sát cúm toàn cầu) Haemaglutinin Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu) Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm) Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị) International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases (Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đƣờng hô hấp khác) Institute of Vaccines And Medical Biological (Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang) Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thƣờng trực) Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lƣợng) Neuramindase Neuraminidase Inhibition Assay ( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase) Nationnal Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vƣơng quốc Anh) viii Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân) Nucleoprotein Non-structural World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới) Polymerase acid Polymerase basic Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen) Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội Ribonucleoprotein Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc) RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc) SARS Severe Acute Respiratory Syndrome (Hội chứng hô hấp cấp tính nặng) Sequence Phƣơng pháp xác định trình tự gen VABIOTECH Company for vaccine and biologycal production No1 (Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1) WHO World Health Organization TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới PTN Phòng thí nghiệm NLS NP NS OIE PA PB PCR Polivac RNP RT- PCR ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm............................ 8 Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của trƣờng học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico ............................... 14 Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................... 42 Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC50 của vi rút cúm .................................... 56 Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. ……61 Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR......................................................................................... 63 Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA ........................... 67 Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA .................................. 68 Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA .......................... 72 Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA .................................. 73 Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu................................................ 82 Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein ................... 83 Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013. ............................................................................................. 84 Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian............ 85 Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K. ....... 89 Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y........... 90 Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tƣơng đồng về di truyền học trên gen HA và NA. .................................................... 91 Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nhóm 6C ..............................................................................92 Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn ................. 93 x DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm ...................................................................... 5 Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm. ............................................ 6 Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase .................................................. 9 Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm. ................................................... 13 Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và Tây nam Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009 ................................................................... 15 Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) ................... 16 Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hƣởng của đại dịch và sự phân bố các trƣờng hợp tử vong ..................................................................................................... 18 Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu.................. 19 Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09............................. 22 Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen ............................................................ 29 Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen................................................................ 47 Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen ......................... 52 Hình 2.3 Kết quả HI xác định hiệu giá vi rút A(H1N1)pdm09 với kháng huyết thanh chuẩn A/California/07/09. ..................................................................... 59 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen ........................................................ 62 Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013. ............................................................................................. 65 Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin A/California/07/09 (Mega 5 sofwave) . .......................................................................................... 66 Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 70 xi Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin . ............................. 71 Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 75 Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 77 Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 79 Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 .............................................................................................. 81 Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian ............ 86 Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ............................................................................................. 88 Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm0988 Hình 3.13 Kết quả khuếch đại của vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự tuyển. ............................................................................................................... 94 Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. .. 110 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển..................................... 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3 năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21[80], [109]. Theo số liệu thống kê của TCYTTG, ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và vùng lãnh thổ, gây tử vong cho 18.449 trƣờng hợp [120], [121]. Tƣơng tự các đại dịch cúm đã xảy ra ở giai đoạn trƣớc, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lƣu hành cùng với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm [109], [119]. Việt Nam là nƣớc thứ 54 trên thế giới thông báo các trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09, trƣờng hợp nhiễm đầu tiên đƣợc ghi nhận vào ngày 31/5/2009 [2]. Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trƣờng hợp nhiễm cúm đƣợc ghi nhận tại Việt Nam là căn nguyên do cúm A(H1N1)pdm09. Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trƣờng hợp nhiễm với 53 trƣờng hợp tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) [4]. Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chƣơng trình giám sát cúm quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc ghi nhận với tỷ lệ là 46,6 % trong tổng số các trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm năm 2009 và giảm với tỷ lệ 28 % trong năm 2010 khi có sự đồng lƣu hành của vi rút cúm A/H3N2. Tại năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ lệ 74,1% và đạt 30% trong năm 2013. Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm 2009 và tiếp tục trong gây dịch các năm tiếp theo, những phân tích về di truyền học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch [8], [22]. Những sự thay đổi đƣợc ghi nhận nhƣ tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA (D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm 2 tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đƣờng hô hấp [8], [11]. Các đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện tƣợng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng đƣợc ghi nhận [68], [71]. Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh hƣởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế bào chủ. Hơn thế nữa, khả năng tiềm tàng của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp (reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể sẽ tăng độc tính hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới [5], [14], [18]. Hiện tại, vắc xin cúm mùa thƣơng mại có khả năng phòng nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn đƣợc yêu cầu cập nhật thƣờng xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang đƣợc phát triển tại một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo của TCYTTG, trong khi đó một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Australia lựa chọn các vi rút cúm lƣu hành tại nƣớc mình để phát triển vắc xin để đảm bảo sự tƣơng đồng cao về di truyền, đặc tính kháng nguyên nâng cao hiệu quả cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117]. Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào chiến lƣợc phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu: 1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. 2. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 3. Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. 3 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm Vi rút cúm là một vi rút đặc biệt trong nhóm vi rút gây bệnh đƣờng hô hấp cho ngƣời liên quan đến sự đa dạng về kháng nguyên, gây bệnh có tính chất mùa và ảnh hƣởng trên một phạm vi toàn cầu với sự xuất hiện của đại dịch. 1.1.1. Đặc điểm vi rút học 1.1.1.1 Phân loại Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó vi rút cúm A, B, C gây bệnh cho ngƣời. Vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa... là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thƣờng gây bệnh nhẹ thƣờng chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ, đặc biệt trẻ em. Vi rút cúm C có gây bệnh, ghi nhận với số lƣợng nhỏ [6], [18], [61], [122], [123]. Vi rút cúm A đƣợc chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt HA (Haemagglutinin) và NA (Neuramindase). Sử dụng HA để xác định phân týp của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định đƣợc 17 loại hemagglutinin khác nhau từ H1 đến H17, trong đó H17 đƣợc xác định từ vi rút phân lập từ dơi [101]. Kháng nguyên NA đƣợc chia thành 9 phân týp khác nhau từ N1 đến N9. Nhƣ vậy nếu ghép cặp 17 phân týp HA với 9 cặp phân týp NA thì sẽ đƣợc 153 phân týp cúm A khác nhau [18], [122], [123]. Vi rút cúm A gây bệnh cho ngƣời chủ yếu là vi rút cúm có kháng nguyên bề mặt là H1, H2, H3 và N1 hoặc N2. Gần đây, một số phân týp cúm mới, có nguồn gốc từ gia cầm đã gây bệnh cho ngƣời đó là vi rút cúm A/H5N1ghi nhận tại Hồng Kông 1997 và một loạt các trƣờng hợp nhiễm cúm tại Trung 4 Quốc, Đài Loan và Hồng Kông đƣợc báo cáo là phân týp vi rút mới A/H7N9 đƣợc ghi nhận năm 2013-2014 [32], [33], [49]. 1.1.1.2 Cấu tạo chung Dƣới kính hiển vi điện tử vi rút cúm có dạng hình cầu, hình trứng hoặc một số ít có dạng hình sợi đƣờng kính 20nm và dài từ 200-300nm, đƣờng kính trung bình 80-120nm. Bên trong vi rút có cấu tạo phức tạp gồm protein capsid và các sợi ARN liên kết với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của vi rút đƣợc cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt 2 lớp vỏ lipid này là khoảng 500 chồi gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút, mỗi chồi gai có độ dài từ 10-14nm. Các chồi gai này đƣợc cấu tạo bởi các glycoprotein, là hai loại kháng nguyên quan trọng là Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Hai kháng nguyên HA và NA quyết định đến khả năng gây bệnh của vi rút cúm, có bản chất là glycoprotein (HA) hoặc enzyme (NA) [6], [116], [122], [123]. Protein HA còn gọi là tố ngƣng kết hồng cầu (NKHC): giúp vi rút bám vào thụ cảm thể niêm mạc đƣờng hô hấp, phân tách thành protein HA1 và HA2, trở thành vi rút hoạt động và xâm nhập vào trong tế bào [29]. Hemagglutinin có thể bám vào màng hồng cầu của một số loài động vật (gà tây, chuột lang…), gây ra hiện tƣợng kết dính hồng cầu, có thể nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu (Haemaglutinine Assay) dựa trên nguyên lý này để phát hiện vi rút cúm. Kháng thể kháng HA có tầm quan trọng trong cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể. Sự có mặt của kháng thể này làm bất hoạt protein HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút không còn khả năng bám vào niêm mạc đƣờng hô hấp, do đó mất khả năng gây bệnh. Protein NA có bản chất là enzyme, có tác dụng làm loãng chất nhầy ở đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho 5 việc giải phóng các virion trong quá trình nhân lên trong tế bào. Kháng thể tƣơng ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể nhƣng yếu hơn kháng thể tƣơng ứng kháng nguyên HA. Protein M bao gồm M1 nằm dƣới lớp lipit kép và liên kết với RNP của lõi vi rút, là protein có nhiều nhất trong virion. Protein M1 có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. Phần xuyên màng là protein M2 hoạt động nhƣ một kênh ion xuyên màng có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút làm phá vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm (Hình 1.1). Protein NS2 tạo thành phức hợp với protein M1 là mối liên hệ cần thiết trong chu trình sống của vi rút để giải phóng phức hợp RNP từ nhân. NA HA NS Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm http://www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/flu/images/flu_structure.gif Bên trong vi rút có cấu tạo gồm các sợi ARN đơn âm, liên kết với các protein NP và 3 enzyme polymerase PA, PB1, PB2 tạo thành phức hệ ribonucleoprotein có chức năng sao chép và phiên mã. Nucleoprotein (NP) và 3 enzyme polymerase (PB1, PB2, PA) là thành phần chủ yếu của phức hợp Ribonucleoprotein (RNP) xoắn ở bên trong của vi rút (Hình 1.2). 6 Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm. Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Camb 1.1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng Genome của vi rút A, B là ARN sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn, riêng vi rút cúm C gồm 7 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb. Hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 10 protein đã biết. Mỗi phân đoạn mã hóa cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc (Nonstructureral) NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B[63], [76]. Protein HA là glycoprotein gồm 562-566 axit amin đƣợc mã hóa bởi 1742-1778 nucleotide, có trọng lƣợng phân tử khoảng 76.000 Dalton. Haemagglutinin đóng vai trò nhƣ thụ thể bằng cách gắn vào sialic acid (Nacetyl-neuraminic acid) trên bề mặt tế bào cảm nhiễm và vào bên trong tế bào bằng quá trình thực bào. Protein HA đƣợc tổng hợp ở dạng tiền thân là chuỗi polypeptide HA0. Điều kiện pH thấp các enzyme phân tách protein dạng trysin và fusin, cấu trúc của HA0 thành HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối disulphua. Protein HA2 (gồm 221-222 axit amin) vẫn gắn với màng vi rút và protein HA1 (gồm 319-326 axit amin) có các khu vực thụ cảm thể (receptor binding) tạo điều kiện cho màng tế bào cảm nhiễm và màng vi rút hòa vào nhau, vi rút có thể bám gắn trên bề mặt tế bào cảm nhiễm bắt đầu cho 7 quá trình thâm nhập vào tế bào [29]. Protein HA là một trong thành phần kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, những thay đổi trên protein HA gây ra hiện tƣợng chuyển dịch - trôi kháng nguyên (antigenic drift) là nguyên nhân gây những vụ dịch cúm theo mùa. Những biến đổi lớn (antigennic shift) ở protein HA làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A, hệ quả là giảm hoặc ức chế sự gắn kết với các kháng thể trung hòa đƣợc tạo ra từ các kháng nguyên trƣớc đó (miễn dịch tự nhiên hoặc vắc xin). Sự trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen xảy ra khi một tế bào bị nhiễm 2 vi rút cúm A khác nhau, dẫn đến sự hình thành của một loại vi rút mới mà quần thể không có miễn dịch có thể gây đại dịch trong tƣơng lai. Protein NA đƣợc mã hóa bởi 1413 nucleotide (453 axit amin) có cấu trúc tứ đồng phân (tetramer), trọng lƣợng phân tử trung bình 220.000 Dalton. Phần chính của phân tử NA đều nằm ở mặt ngoài vi rút, neuraminidase hoạt động giống nhƣ một enzyme, nó cắt axit sialic ra khỏi các phân tử glycoprotein, glycolipid ở bề mặt tế bào chủ, giúp cho vi rút cúm bám vào tế bảo chủ để thực hiện quá trình thâm nhiễm. Khi vi rút đƣợc nhân lên trong tế bào chủ, hoạt động ezyme của Neuraminidase sẽ tác động và axit sialic của glycoprotein tế bào chủ, giúp giải phóng vi rút. Những thay đổi nhỏ cũng có thể xảy ra với NA, một số đột biến có liên quan đến hiện tƣợng giảm độ nhạy hoặc kháng các thuốc kháng vi rút theo cơ chế ức chế Neuramidase. Các đột biến đã đƣợc xác định gồm: I117V, H274Y, H275Y, I222K, E119V, N294S (R - arginine; K - lysine; H - histidine; Y- tyrosine; E - glutamic acid; V valine) có thể dẫn đến sự kháng không chỉ đối với oseltamivir mà còn đối với zanamivir và thuốc khác mới [15], [50], [51], [59]. Để xác định ảnh hƣởng của đột biến này, các thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm nhƣ thử nghiệm ức chế Neuraminidase (Neuraminidase Inhibition assay - NAI) hoặc thử nghiệm trên động vật (in vivo) đƣợc áp dụng. 8 Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm [94]. Phân đoạn 1 Kích thƣớc Polypeptide (bp) 2341 PB2 2 2341 PB1 3 2233 PA 4 5 6 1778 1565 1413 Đóng vai trò enzyme phiên mã, sao chép, kéo dài, tham gia quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới trong tế bào chủ Là thành phần chủ yếu của phức hợp ribonucleoprotein (RNP), tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vARN) HA NP Nucleoprotein: là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa 1 trong các kháng nguyên đặc hiệu týp NA 1027 M2 NS1 8 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN thông tin (mARN) Haemagglutinin: mang tính đặc hiệu týp, kháng nguyên HA gây ngƣng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi rút vào tế bào chủ, dung hợp giải phóng phức hợp ribonucleoprotein, mở đầu quá trình nhân lên của vi rút M1 7 Chức năng 890 NS2 Neuraminidase: phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi tế bào nhiễm. Matrix protein: là protein nhiều nhất trong virion tạo thành bộ khung, là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn định cấu trúc vi rút Tích màng protein M2 hoạt động nhƣ 1 kênh bơm ion để làm giảm hoặc để duy trì pH của thể nội bào (endosome) Là protein không cấu trúc, điều hòa để thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của vi rút trong tế bào bị nhiễm