Tài liệu Một số cách lấy mẫu mới và ảnh hưởng của chúng lên sự tái sinh của một số loài cây có giá trị kinh tế

y o c u -tr a c k .c TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC MỘT SỐ CÁCH LẤY MẪU MỚI VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ TÁI SINH CỦA MỘT SỐ LOÀI CÂY CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ Giáo viê n hướng dẫn: TS. DƯƠNG TẤN NHỰT CN. NGUYỄN BÁ NAM Sinh viê n thực hiệ n: HOÀNG VĂN THƯỞNG Lớp 47 CNSH : NHA TRANG, 2009 .d o m o w w w .d o C lic k to bu y bu to k lic C w w w N O W ! h a n g e Vi e N PD ! XC er O W F- w m h a n g e Vi e w PD XC er F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Phần 1 Tổng quan tài liệu Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 1 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 1 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c 1.1. Tái sinh cơ quan 1.1.1. Sự tái sinh bất ñịnh Những cơ quan như chồi hay rễ có thể ñược hình thành từ bất cứ loại mô nào của cây, những cơ quan ñược khởi tạo như vậy ñược gọi là cơ quan bất ñịnh. Quá trình tái sinh các cơ quan bất ñịnh gọi là sự phát sinh cơ quan bất ñịnh. Ở ñây, chồi hay rễ có thể hình thành từ một tế bào ñơn, hay một nhóm tế bào. Các tế bào này ñược kích thích bởi ñiều kiện môi trường ñể trở thành trung tâm của sự phân chia tích cực các tế bào (mô phân sinh bất ñịnh). Sự tái sinh ñã ñược nghiên cứu in vitro trên số lượng lớn cây trồng của nhiều loài khác nhau, nhưng không phải khả năng tái sinh của cây nào cũng như nhau. Thậm chí trong cùng một giống cây trồng vẫn có sự khác nhau, ñó có thể là do tính ñáp ứng in vitro kém (recalcitrant) hay không có khả năng tái tạo cơ quan từ mẫu cấy ban ñầu. Hơn nữa, ở một số loài khả năng tái sinh có thể bị mất sau quá trình chuyển gene. Khả năng tái sinh của tế bào thông qua các biến ñổi phát sinh hình thái là kết quả của sự phản phân hóa ñể trở nên tiềm năng trước các hướng kích thích khác nhau. Theo sau quá trình này là sự hình thành các chương trình phát triển của tế bào và cuối cùng là sự phát triển thành cơ quan bất ñịnh (Nhựt và cộng sự, 2003). Người ta vẫn còn chưa biết rõ tại sao một số cây trải qua quá trình phát sinh cơ quan và một số khác lại không. Một số giả thuyết ñược ñề nghị bởi Christianson và Warnick (1984) giải thích một chuỗi các quá trình của sự phát sinh cơ quan theo thời gian. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 2 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 2 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Tế bào có tiềm năng thích ứng Giai ñoạn khởi ñầu Hormone Giai ñoạn cảm ứng Hormone Giai ñoạn xác ñịnh Giai ñoạn phản phân hóa Không cần hormone tác ñộng Hình 1. Giả thuyết về các giai ñoạn phát sinh cơ quan bất ñịnh. Theo ñó thì sự phát sinh cơ quan phải trải qua hai giai ñoạn cơ bản sau: • Giai ñoạn một: ñể cho các mô hình thành cơ quan, tế bào của mô ñó phải có tiềm năng bao gồm khả năng cảm ứng ñược với môi trường và có những phản ứng biến ñổi trong bản thân nó. • Giai ñoạn hai: là quá trình xác ñịnh hướng phát triển của tế bào tiềm năng ñể sau ñó tế bào bước vào giai ñoạn biệt hóa. Các giai ñoạn này ñều cần ñến sự tác ñộng của hormone. Chỉ có khi bước vào giai ñoạn biệt hóa thì tế bào không cần ñến tác ñộng của hormone nữa. 1.1.1.1. Tính khả biến Tế bào thực vật nào cũng mang tính toàn năng nghĩa là khả năng trẻ hóa và hình thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào thông qua quá trình nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, khả năng phản phân hóa (bao gồm sự trẻ hóa và tái xác ñịnh con ñường phát triển mới của mô) không phải lúc nào cũng như nhau trên mọi tế bào. Có những tế bào dường như không thể tái tạo cơ quan, chúng ñược cho rằng ñã mất khả năng tái sinh. Nếu tế bào thuộc mô cấy nào chưa sẵn sàng cho quá trình cảm ứng ngay tại thời ñiểm cắt mẫu thì chúng cũng có thể vẫn không cảm ứng suốt quá trình nuôi cấy in vitro. ðây gọi là tính khó ñáp ứng in vitro. Trái lại, có những tế bào tỏ ra thích ứng với sự phân chia và duy trì ñược khả năng phát sinh hình thái trước các kích thích tố thích hợp. Khả năng này ñược gọi là tiềm năng tế bào, chúng chỉ ra rằng mỗi tế bào có tất cả các thông tin cần thiết ñể tái sinh Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 3 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 3 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c thành một cây mới. Giai ñoạn các tế bào tiềm năng tiếp xúc với môi trường nuôi cấy ñược gọi là giai ñoạn cảm ứng của tế bào. Có rất nhiều giả thuyết ñã ñược các nhà khoa học ñề cập liên quan ñến chức năng của mô phân sinh trong quá trình cảm ứng của tế bào. Nhiều người cho rằng chỉ các mô trong vùng phân sinh mới chứa các tế bào tiềm năng. Trong khi một giả thuyết khác ñược ñặt ra bởi Street (1977) thì cho rằng mặc dù tế bào nào cũng có tính tiềm năng nhưng các tế bào mới ñược tạo ra ở mô phân sinh lại có ưu thế hơn các tế bào xung quanh khi bước vào các cơ chế phân chia. Thêm một nhận ñịnh khác của Cassells (1979) cho rằng các mô phân sinh mới thường bị ức chế phát triển bởi một loại chất tiết ra từ các mô phân sinh ñã tạo trước nó. Vậy rõ ràng các tế bào cấu thành nên các mô phân sinh có tiềm năng cảm ứng cao hơn các loại tế bào khác bởi vì chúng ñã ñược kích thích chuyển sang giai ñoạn biệt hoá mức ñộ thấp trước khi ñi vào con ñường biệt hoá. 1.1.1.2. Tính xác ñịnh Các tế bào tiềm năng dưới tác ñộng tích cực của hormone, bắt ñầu ñược lập trình theo các hướng xác ñịnh ñể trở thành các tế bào chuyên hóa. Tuy nhiên, có một số tế bào ñã ñược tiền xác ñịnh phát sinh kiểu hình thái cho nên chúng chỉ cần những kích thích nhỏ trong môi trường ñể hình thành các mô phân sinh thay vì trải qua quá trình phân hoá tế bào. Hướng phát triển ñịnh trước của tế bào tiềm năng cũng như tế bào mới ñược sinh ra ñều có thể biến ñổi và phát sinh theo mục ñích nuôi cấy, ví dụ các tế bào trong vùng mô phân sinh rễ có thể biến ñổi khi thêm cytokinin ñể thành mô phân sinh chồi. Tuy nhiên, khi tế bào ñã có tính xác ñịnh thì chúng bước vào con ñường ñã ñược lập trình của hệ gene và khi ñó chúng ta không thể ñảo ngược tiến trình này nữa. Có thể nói, tính tiềm năng cũng như tính xác ñịnh của tế bào trong các môi trường in vitro ñặc biệt chịu ảnh hưởng bởi chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh (loại và nồng ñộ), và cả lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh có trong mẫu. 1.1.2. Các hình thức tái sinh 1.1.2.1. Tái sinh trực tiếp Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 4 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 4 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Mô phân sinh chồi hình thành trực tiếp từ mẫu cấy thường ñược khởi tạo bằng sự phân bào sơ cấp sau 48 giờ nuôi cấy. Kế tiếp mỗi quá trình phân bào sơ cấp là một quá trình phân bào dài và phức tạp hơn, kết quả hình thành nên các mầm chồi bất ñịnh, mỗi mầm chồi bao gồm nhiều tế bào. Sự hình thành trực tiếp này thường bắt nguồn từ một hay một nhóm các tế bào sinh dưỡng chưa phân hoá. Broertjes và cộng sự (1976), cho rằng trong suốt quá trình phát sinh cơ quan trực tiếp, các mầm chồi bất ñịnh không phải lúc nào cũng ñược hình thành từ nhiều tế bào của mô. Một tế bào biểu bì ñôi khi lại khởi ñiểm cho quá trình phát triển của vùng phân sinh trung tâm là nguồn gốc của 1 cho tới 22 chồi giống nhau. Các nghiên cứu khác trên một số cây trồng khác cũng khẳng ñịnh giả thuyết vùng mô phân sinh có nguồn gốc từ một tế bào. Bảng 1. Các cây trồng phát sinh chồi bất ñịnh từ một tế bào biểu bì Loài Tham khảo Achimenes Broertjes (1972) Begonia Mikkelsen và Sink (1978) Chrysanthemum Roest (1977) Kalanchoe Broertjes và Leffring (1972) Lilium Broertjes và cộng sự (1976) Sự phát sinh chồi bất ñịnh trực tiếp thường bắt ñầu từ các tế bào nhu mô nằm ở trong biểu bì (Broertjes và Van Harte, 1978). Từ một nghiên cứu tái sinh chồi từ thể khảm của lá cây Saintpaulia. Norris và Smith (1981) kết luận rằng sự khởi tạo vùng mô phân sinh trên ñỉnh liên quan tới sự kết hợp của các tế bào dưới lớp biểu bì. Chồi trên môi trường nuôi cấy lá Nicotiana tabacum phát sinh trực tiếp từ các tế bào mô giậu thịt lá quanh rìa lá (Attfield và Evans, 1991). Thể khảm cũng thấy ở nhiều ñối tượng cây trồng tái sinh khác (Broertjes và Van Harte, 1978) càng chứng tỏ nguồn gốc ña bào của sự phát sinh chồi. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 5 .d o m o o c u -tr a c k w lic bu to k lic C m w w w .d o 5 ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Attfield và Evans (1991) trong các nghiên cứu từ lá cây Nicotiana tabacum thấy rằng rễ bất ñịnh hình thành trực tiếp từ ba bó mạch và các mạch của nhu mô. Sự hình thành rễ bất ñịnh này tương tự như sự khởi tạo rễ có nguồn gốc ña bào từ các mẫu cấy chồi cây Pisum sativum, rễ ñược phát sinh từ các tế bào nhu mô và các mô mạch ñã có trước ñó (Gahan và Doré, 1984). Có những biểu hiện tác ñộng trực tiếp từ trên những tế bào xuất phát từ mô mạch và có thể là IAA hay chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật khác ñã khuếch tán vào các tế bào và khởi ñộng cho quá trình phân bố mạch và tạo rễ. 1.1.2.2. Tái sinh gián tiếp Sự hình thành các khối mô sẹo từ mẫu cấy ban ñầu sau khoảng thời gian nuôi cấy nhất ñịnh ñể hình thành các chồi bất ñịnh. Các chồi này phát triển từ ngoại vi mô sẹo và không có quan hệ ban ñầu với các mô có mạch dẫn của mẫu cấy. Sự hình thành cơ quan như thế ñược gọi là quá trình tái sinh gián tiếp. Sự phát sinh gián tiếp các cơ quan bất ñịnh cũng tương tự như sự phát sinh trực tiếp, bắt ñầu bằng sự phân chia nhanh các tế bào ñể dẫn tới sự hình thành vùng phân sinh. Tiếp theo là sự xuất hiện các mầm chồi và cuối cùng là chồi (Torrey, 1966). Vì vậy, rất khó phân biệt hai hình thức phát sinh cơ quan này. Thường ñể sự phát sinh cơ quan gián tiếp xảy ra, các mô sẹo hình thành từ mẫu cấy phải ñược cấy chuyền sang môi trường chứa chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho quá trình biệt hóa mô sẹo. ðối với mục ñích nhân giống in vitro, nếu cây tái sinh trực tiếp từ mẫu cấy ban ñầu thì không những nhanh chóng thu ñược cây, mà các cây này cũng khá ñồng nhất về mặt di truyền. Tế bào mô sẹo sau khi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn ñịnh về mặt di truyền. ðể tránh tình trạng ñó nhất thiết phải sử dụng loại mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp ñể tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu ñược cây tái sinh ñồng nhất. 1.1.3. Vết thương Quá trình tạo vết thương bằng các tác ñộng cơ học vào mẫu cấy như cắt, tỉa thường kích thích sự tái sinh. Tất cả các mẫu cấy khi ñược nuôi cấy in vitro ñều phải qua quá trình xử lý với kéo, dao cấy hoặc các dụng cụ khác vì thế mẫu luôn bị tổn thương. Mẫu cấy càng nhỏ thì tỷ lệ bề mặt vết cắt càng lớn. Trong nhiều Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 6 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 6 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c trường hợp, vết thương có thể tiết ra các chất cản trở sự phát triển của mẫu cấy nhưng cũng có khi nó giải phóng ethylene, loại hormone này thường kích thích sự hình thành mô sẹo hay các cơ quan bất ñịnh (chồi hoặc rễ). 1.1.3.1. Vết thương tạo thành khi xử lý mẫu Sự tái sinh thường diễn ra ở bề mặt của vết cắt do ñó việc tạo vết thương cho mẫu cấy sẽ kích thích quá trình tái sinh diễn ra nhanh và ñạt hiệu quả hơn. Lá mầm của cây Pyrus malus ñược cắt ñôi, tạo ra nhiều chồi bất ñịnh từ các mô sẹo có kích thước nhỏ ở gần vết cắt (Browning và cộng sự, 1987). Mặc dù rìa vết cắt của lá cây Ipomoea batatas không hình thành những khối mô sẹo tiền phôi, nhưng quá trình tạo phôi lại diễn ra ngay trên vết cắt thân và những mẫu cấy lá cắt nhỏ (Liu và Cantcliffe, 1984). Cắt nhỏ lá non cây Malus thành 14 mảnh sẽ kích thích khả năng mô lá hình thành các chồi bất ñịnh và các cấu trúc tiền phôi (Welander, 1988). Nếu nuôi cấy nguyên vẹn thể phôi của giống táo ‘Delicious’ và giống ‘Winesap’ thì chỉ hình thành mô sẹo lần lượt là với các tỷ lệ là 100% và 55%, nhưng khi cắt thành 3 phần bằng nhau thì tỷ lệ tạo chồi bất ñịnh của các ñoạn cắt lá mầm và chồi mầm khá cao. Tỷ lệ tạo chồi từ các mẫu cấy rễ mầm của ‘Delicious’ và ‘Winesap’ lần lượt là 0% và 11%. Korban và Skirvin (1985) cho rằng các tác ñộng trong quá trình phân chia mẫu cấy phôi làm loại bỏ tác nhân tái sinh ñã từng tồn tại trước ñó ở vùng rễ mầm hoặc tăng hoạt tính của một số chất ức chế ở vùng này. Trong một số trường hợp, mẫu cấy không cảm ứng ñược kích thích của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật nếu chúng không ñược tạo vết thương, ñiển hình như mầm chồi của cây xương rồng Opuntia polycantha, nó không phản ứng với auxin hay cytokinin trong môi trường nếu như không bị tổn thương. Các mẫu cấy này sau ñó hình thành rễ bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l NAA và chồi bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l IBA (Mauseth và Halperin, 1975). 1.1.3.2. Vết thương phụ Ngoài những vết thương bắt buộc phải có khi tách mẫu ra khỏi cây ban ñầu ñem vào nuôi cấy, những vết thương tạo thêm nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc của mẫu cấy và khả năng tái sinh mẫu ñược gọi là vết thương phụ. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 7 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 7 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Sự tái sinh thường xảy ra ngay tại ñiểm tạo vết thương. Park và Son (1988) cho rằng sự tái sinh các cơ quan bất ñịnh chỉ xảy ra ở vùng ngoại vi hay rìa vết thương của các lá cây Populus nigra và P. maximowiczii. Tuy nhiên, khi các mẫu lá bị ñâm thủng trên bề mặt (khoảng 5 lỗ) thì sự tái sinh có thể quan sát ñược ngay trên cả mép các vết thương mới tạo. Các nhà khoa học cho rằng sự làm tổn thương mẫu cấy ñã kích thích sự di chuyển của hormone nội sinh tới vết thương, hoặc làm hàm lượng hormone ở chính các vị trí ñó dồi dào hơn hoặc tiết bớt một phần hormone ra môi trường nuôi cấy, tạo nên tỷ lệ cân bằng chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật trong mẫu cấy do ñó làm thúc ñẩy quá trình tái sinh. Giả thuyết này trùng hợp với kết quả mà Norizaku và cộng sự (1985) ñã nghiên cứu trên Torenia fournieri, sự hấp thụ của BA qua các vết thương của mẫu cấy không hề tăng nhưng lượng chồi bất ñịnh hình thành lại tăng ñáng kể. 1.1.4. Tác ñộng của kiểu di truyền tới sự tái sinh cơ quan Sự phát triển của các mô hay cơ quan trong nuôi cấy và sự tái sinh in vitro bị tác ñộng rất nhiều bởi kiểu di truyền. Có nhiều kết quả thu ñược trong quá trình nuôi cấy mô chứng tỏ sự tái sinh khác nhau giữa các giống cùng loài. Các gene trong nhân ñược coi là liên quan trực tiếp tới quá trình tái sinh thể hiện ở khả năng tương tác của chúng (Keyes và Bingham, 1974), trạng thái lặn (Frankenberger và cộng sự, 1981) miên trạng, miên trạng một phần (Reisch và Bingham, 1980) hay tính cộng hợp (Buiatti và cộng sự, 1974). Nhiều công bố cho rằng có sự tương tác giữa kiểu gene của cây trồng và môi trường nuôi cấy. Thứ A có thể trải qua sự tái sinh và cảm ứng với môi trường chứa loại chất ñiều hòa nào ñó trong khi thứ B thì không có biểu hiện nào trong môi trường nuôi cấy cho ñến khi cấy chuyền nó sang môi trường chứa chất ñiều hòa khác. Nhiều biến ñổi hình thái của cây trồng chỉ phát sinh trong những ñiều kiện môi trường ñặc hiệu. Chính vì tính ñặc trưng của hệ gene mà môi trường nuôi cấy thường khác nhau từ các chi hay loài thậm chí các thứ trong cùng một họ. Không có môi trường nào chuyên biệt cho cây trồng nào mà phải qua hàng loạt các nghiên cứu thử nghiệm ñể xác ñịnh môi trường tốt nhất cho cây trồng ñó. Nếu như sự tương tác giữa môi trường – kiểu gene là tính ñặc hiệu duy nhất của hệ gene, thì chúng ta có thể nuôi cấy tất cả các cây trong cùng khu sản xuất, có ñặc ñiểm y như nhau với kết quả thu ñược là như nhau. Tuy nhiên, sự biểu Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 8 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 8 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c hiện khác nhau của cây trồng thông qua quá trình nuôi cấy in vitro như sự hình thành và phát triển của mô sẹo, sự tái sinh cơ quan ñều chịu sự ñiều khiển của hệ gene, kèm theo những tác nhân thứ yếu khác ngoài môi trường nuôi cấy. Ví dụ như ở cây Medicago, các cây mới thu ñược từ nuôi cấy phôi soma nhiều hơn là từ quá trình tái sinh chồi, bất kể thành phần của môi trường nuôi cấy (Brown và Atanassov, 1985). Tương tự ở cây Lúa mì, chỉ có một số giống cho kết quả khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau trong khi thu ñược kết quả không ñáng kể khi nuôi cấy các giống khác trên môi trường tương tự (Lazar và cộng sự, 1983). 1.1.2. Các ảnh hưởng tới sự tái sinh cơ quan 1.1.2.1. Tuổi của mẫu cấy Nhìn chung, các mẫu cấy lấy từ các cơ quan mới ñược hình thành (mẫu cấy non) có khả năng phát triển và phát sinh cơ quan in vitro tốt hơn mẫu cấy già. Trong các thí nghiệm của Takayama và Misawa (1982), hầu hết các mẫu cấy có nguồn gốc từ các cây trưởng thành ñều chết. Pierick (1969) nhận ra rằng khuynh hướng tạo rễ của mẫu cấy thân cây Rhododendron giảm với tuổi của chồi, cảm ứng rễ qua cấy chuyền và quá trình tạo rễ là chắc chắn với các mẫu cấy thân non. Tuy nhiên, các mô non không phải lúc nào cũng tái sinh cao. Mô sẹo hình thành trên tất cả các dạng mẫu cấy từ cây trưởng thành Parthenium hysterophorus hơn là các hạt và các lá mầm (Wickham và cộng sự, 1980). Tương tự, sự hình thành và phát triển của mô sẹo diễn ra nhanh trên các mẫu cấy của Solanum laciniatum trưởng thành khi lá của nó ñã mở rộng hoàn toàn. 1.2.2. 2. Loại mẫu cấy Chọn ñúng mẫu cấy là công ñoạn rất quan trọng khi nhân giống dựa trên nền tảng tái sinh cơ quan (trực tiếp hay gián tiếp). Trong vài trường hợp, ñể sử dụng tái sinh ñạt ñược hiệu quả cao, phải tiến hành chọn loại mẫu cấy có khả năng tái sinh cao nhất, như ở Brassica carinata, 86% mẫu cấy lá mầm tạo chồi, 74% mẫu từ thân mầm tạo chồi, và chỉ có 26% tạo ở rễ (Jaiswal và cộng sự, 1987). Rõ ràng mẫu cấy lá thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi bất ñịnh. 1.2.2.3. Kích thước và vị trí mẫu cấy Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 9 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 9 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Kích thước của mẫu cấy có ảnh hưởng trực tiếp ñến phản ứng của mô với môi trường nuôi cấy. Các kích thước nhỏ khó tái sinh hơn mẫu có kích thước lớn do mẫu lớn có nguồn dinh dưỡng dự trữ dồi dào hơn và kích thích tố ñể duy trì sự nuôi cấy. Tuy nhiên, kích thước mẫu cấy cũng có tương tác với nhiều nhân tố khác như tuổi mẫu cấy. Trong quá trình nuôi cấy mô Cumcumis melo thì tỷ lệ chồi bất ñịnh thu ñược cao khi nuôi cấy những lá nhỏ (0,3 – 0,5 mm) và non (14 ngày) hơn các lá có cùng kích thước nhưng già (21, 28, 35 ngày), hay từ các lá có kích thước lớn (0,6 – 0,9 mm hay 1,0 – 1,2 mm) ở bất cứ ñộ tuổi nào (Kahal và cộng sự, 1988). Theo nguyên tắc, các mẫu cấy thu ñược trên cùng một cơ quan thực vật thì có khả năng tái sinh như nhau. Tuy nhiên, các cơ quan này lại ñược cấu tạo bởi nhiều mô khác nhau và có ñộ tuổi khác nhau nên sẽ dẫn tới mức ñộ tái sinh khác nhau của mẫu cấy. Mặt khác các mẫu có cùng tuổi, cùng vị trí nhưng nhận ñược ánh sáng ở các mức ñộ khác nhau cũng cảm ứng khác nhau với cùng một tác nhân cảm ứng tái sinh. 1.2.2.4. Thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn ñến quá trình tái sinh. ðối với nuôi cấy mô sẹo, khoảng thời gian ñược nuôi trong môi trường ảnh hưởng tới khuynh hướng phát sinh hình thái của chúng. Thường có một khoảng thời gian ngắn mà trong suốt thời gian ñó, sự tái sinh là mạnh nhất (Reinert và Backs, 1968). Vài mô sẹo vẫn còn giữ khả năng tái sinh chồi trong khoảng thời gian dài. Stimart và cộng sự (1980) thu nhận chồi tái sinh từ mô sẹo của Lilium nuôi cấy trên môi trường trong vòng 3 năm. Mô sẹo của Solanum nigrum (Mandal và Gadgil, 1979) và Lavendula angustifolia (Webb và cộng sự, 1984) vẫn còn khả năng phát sinh hình thái trong ít nhất là 2 năm, mô sẹo của Ngô và Yến mạch có thể lưu trữ ñược tính năng này trong vòng 18 tháng (Rice và cộng sự, 1979). Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy quá lâu hay là cấy chuyền quá thường xuyên thì khả năng tái sinh thường giảm. Lý do cho khả năng mất tính tái sinh này vẫn còn chưa ñược xác ñịnh rõ và khác nhau tùy trường hợp. 1.2.2.5. Mật ñộ nuôi cấy Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 10 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 10 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Mật ñộ nuôi cấy tối thiểu ñể tạo ra các tế bào hay mô phát triển in vitro ñã từng ñược ñề cập trước ñây. Bên cạnh sự ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, mật ñộ nuôi cấy cũng ñược cho rằng ảnh hưởng ñặc biệt tới sự phân hóa tế bào, sự tái sinh hay sự nhân chồi. Khi nuôi cấy huyền phù tế bào Cà rốt, cả số lượng phôi soma hình thành và cả trạng thái phát triển tế bào khi ở giai ñoạn phôi ñược coi là phụ thuộc vào số lượng tế bào khi bắt ñầu nuôi cấy. Khi tiến hành làm loãng dịch nuôi cấy thì kết quả là sự gia tăng các tế bào vô ñịnh hình. Không chỉ thể hiện ở số lượng phôi hình thành ít hơn mà những phôi hình thành có kích thước nhỏ hơn và sinh trưởng chậm hơn (Halperin, 1967). Hari (1980) chỉ ra rằng những tế bào không thể hình thành dạng phôi hoàn chỉnh ở tại mật ñộ nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp. ðiều này càng khẳng ñịnh bằng nhiều nghiên cứu khác ở Cà rốt, khi mật ñộ nuôi cấy các tế bào quá thấp (nhỏ hơn 104 tế bào/ml môi trường) dẫn tới sự chết của tế bào mặc dù ñiều kiện môi trường hoàn toàn tối ưu cho quá trình phát triển (McCabe và cộng sự, 1997). Ảnh hưởng của mật ñộ mẫu cấy ñược công bố bởi Pierik và Steegmans (1972). Khi gieo 10 hạt giống của cây Lan Cattleya vào trong bình tam giác chứa môi trường lỏng, hình thành protocorm và cây con, nhưng không có protocorm nào ñược sinh ra khi chỉ gieo hai mẫu vào trong một bình. Tương tự, các chồi bên của cây Măng tây trên môi trường MS tạo nhiều chồi và rễ hơn khi số lượng chồi ban ñầu ñưa vào binh nuôi nhiều. Ảnh hưởng này ñược cho là một loại chất nào ñó khuếch tán vào trong môi trường từ mẫu cấy, bởi quá trình sinh trưởng có thể ñược kích thích theo cùng một kiểu ở mật ñộ nuôi cấy thấp hơn bằng cách bổ sung auxin và cytokinin (Matsubara và Clore, 1974). 1.2.2.6. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
Auxin Auxin ñược tổng hợp chủ yếu ở ñỉnh sinh trưởng ngọn, từ ñó vận chuyển ñến các cơ quan khác nhau theo hướng gốc. Ngoài ñỉnh sinh trưởng ngọn, auxin còn ñược tổng hợp một phần ở các cơ quan còn non như lá non, chồi non, quả non. Trong cây auxin tồn tại ở hai dạng là: dạng tự do và dạng liên kết. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 11 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 11 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c • Auxin ở dạng tự do: là dạng có hoạt tính sinh học. Chúng tồn tại ở ñỉnh sinh trưởng ngọn, sau ñó rồi ñến chồi bên, ñầu rễ và cơ quan non. Càng xa ñỉnh sinh trưởng nồng ñộ auxin tự do càng giảm dần. Dạng auxin tự do chủ yếu trong cây là IAA. Auxin tự do trong cây chiếm một tỷ lệ rất thấp. Nhiều tài liệu ñã công bố hàm lượng auxin tự do trong cây chiếm khoảng 5% auxin tổng số. • Auxin dạng liên kết: là dạng auxin chủ yếu trong cây. Hàm lượng của dạng liên kết này có thể chiếm trên 90% lượng auxin có trong cây. IAA có thể liên kết với rất nhiều các hợp chất khác nhau nên chúng không có hoạt tính sinh học hoặc có hoạt tính sinh học rất thấp. Tuy nhiên, chức năng của auxin liên kết trong cây hết sức quan trọng. Chúng là nguồn dự trữ auxin trong cây và cũng là dạng auxin vận chuyển chủ yếu trong cây. Vì vậy, sự biến ñổi thuận nghịch của IAA tự do và IAA liên kết dưới tác nhân kích thích của môi trường góp phần ñiều chỉnh sự cân bằng auxin trong cây và do ñó ñiều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây. Auxin ñược tổng hợp trong ñỉnh ngọn và từ ñó vận chuyển xuống các cơ quan phía dưới. Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính phân cực rõ rệt, theo hướng gốc, tức là từ ngọn xuống rễ mà không vận chuyển ngược lại. Trong cây nguyên vẹn, auxin liên quan ñến sự phân chia tế bào, sự hình thành mô sẹo (trong suốt quá trình mẫu bị tổn thương và cảm ứng vết thương), và sự hình thành rễ bất ñịnh. Ngoài IAA là auxin tự nhiên phổ biến nhất, những auxin tổng hợp cũng ñược sử dụng phổ biến như IBA, NAA, 2,4-D. IAA là loại auxin không ổn ñịnh nhất trong các auxin, nó dễ dàng bị phân hủy bởi ánh sáng và bị oxy hóa. Tính không ổn ñịnh này làm IAA không ñược sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. 2,4-D là auxin có hoạt tính khá mạnh và nồng ñộ cao có thể gây ñộc. Bất cứ auxin nào cũng có thể ñược dùng nhưng cũng thường gặp các ñột biến phát sinh, ví dụ 2,4-D thường liên quan tới các ñột biến kiểu gene và mất khả năng tái tạo rễ.
Cytokinin Rễ là cơ quan tổng hợp cytokinin. Từ rễ cytokinin ñược vận chuyển lên các bộ phận trên mặt ñất. Cytokinin ñược tổng hợp mạnh nhất ở giai ñoạn cây con. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 12 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 12 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Cytokinin phân bố nhiều ở những nơi có hoạt ñộng trao ñổi chất và sinh trưởng mạnh, chồi non càng nhiều thì hàm lượng cytokinin càng cao. Cytokinin tồn tại ở trong cây dưới dạng tự do có hoạt tính sinh học và dạng liên kết không có hoạt tính sinh học hoặc hoạt tính yếu. Hiệu quả sinh lý của cytokinin: giãn nở của tế bào, sự phân hóa chồi, sự hóa trẻ. Trong cơ thể thực vật thì cytokinin liên quan ñến sự phát triển các búp chồi và sự phát triển, trưởng thành của lục lạp. Các cytokinin tự nhiên dùng trong nuôi cấy mô có thể kể ñến là Zeatin, 2-iP. TDZ là một cytokinin tổng hợp ñược dùng xuyên suốt trong quá trình nuôi cấy mô. Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin thường ảnh hưởng trực tiếp ñến quá trình phát sinh cơ quan:  Auxin : cytokinin > 1 kích thích tạo rễ  Auxin : cytokinin < 1 kích thích tạo chồi  Auxin : cytokinin = 1 kích thích tạo mô sẹo 1.2.2.7. Sự phân cực Tính phân cực phụ thuộc vào khả năng trao ñổi ion H+ và K+ của tế bào tại màng plasma. Auxin tạo ra dòng chảy của H+ từ trong tế bào ra bên ngoài tế bào và ñồng thời duy trì một ñiện thế trong các mô (dương ở phía ngọn, âm ở phía gốc lá), duy trì và củng cố dòng vận chuyển auxin (Raven, 1979). Khi tách các mô chồi và rễ thì tính có cực này bị khử, nhưng trong quá trình nuôi cấy thì tính có cực của tế bào ñược khôi phục lại, thường là khoảng 4 – 6 giờ ở rễ và 12 – 16 giờ ở trụ trên lá mầm cây ñậu (Hanson và Trewavas, 1982).
Gradient tái sinh Thường thấy khi cắt một cơ quan hoàn chỉnh thành nhiều phần thì các ñoạn cắt này thể hiện khả năng tái sinh theo chiều hướng khác nhau. Tùy theo sự hình thành nhiều ít các bộ phận bất ñịnh mới mà ta có thể xác ñịnh ñược gradient tái sinh của mẫu. Liu và Burger (1986) quan sát sự tái sinh chồi của hoa Lilium longiflorum thì thấy sự hình thành của một gradient tái sinh. Mẫu cấy thu từ phần Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 13 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 13 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c gần nhất của ñế hoa tạo chồi với số lượng lớn nhất (gấp 5 lần so với các ñoạn cắt gần nó), ñặc biệt nếu nó ñược ñặt úp trên môi trường nuôi cấy.
Tính có cực của mẫu cấy Cách ñặt mẫu ñóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình tái sinh. ðoạn cắt mẫu lá của Gastaria và Haworthia tạo nhiều phôi soma hơn khi ñặt thẳng ñứng (vuông góc) với môi trường nuôi cấy (Beyl và Sharma, 1983). Trong khi mẫu lá non từ giống Dâu tây ‘Redcoat’ lại có khả năng sinh ra nhiều chồi bất ñịnh hơn khi mặt bụng (so với mặt lưng) của mẫu cấy lá tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (Nerha và cộng sự, 1988), những kết quả tương tự thu ñược với mẫu cấy lá của Malus domestica và Malus pumila. Welander (1988) lý giải ñiều này, bên cạnh tính có cực, trong các nghiên cứu này thì dường như bề mặt trên của lá phản ứng tốt nhất với môi trường dinh dưỡng khi chứa những tế bào không ngừng lớn lên và phân chia.
Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và sự vận chuyển có cực Sự phân cực tái sinh một phần cũng do sự di chuyển của các chất ñiều hòa sinh trưởng có trong mẫu cấy, ñặc biệt là sự di chuyển hữu cực (ví dụ như từ ñỉnh chồi ñi xuống các phần dưới) của IAA. Kiểu di chuyển có cực này không rõ ràng ở những mẫu cấy nhỏ, ñiều này phần nào giải thích ñược tạo sao các mẫu cấy có kích thước nhỏ thì sự tái sinh phân cực không ñược quan sát (Thakur và Ganapathi, 1978). Sự bổ sung auxin và cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể tăng cường tính phân cực của mẫu cấy, kích thích tái sinh hoặc dẫn tới sự biến mất hay ñảo ngược xu hướng phân cực. Sự ñảo ngược và biến mất của quá trình phân cực khi có mặt các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược ñưa ra bởi nghiên cứu của Margara (1969) trên cây Súp lơ, Nho và Thu Hải ðường. Trên môi trường không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, cuống lá cây Súp lơ tạo ra chồi và rễ ở vùng gần ñiểm cắt, nhưng tính có cực này bị phân hủy khi bổ sung 1,9 mg/l NAA vào môi trường, khi ñó trên bề mặt mẫu cấy ñều hình thành các rễ bất ñịnh. Trái lại, khi thêm vào môi trường nuôi cấy 2,3 mg/l BA thì tất cả các mẫu cấy ñều phát sinh chồi. Sự hình thành chồi ở cuống hoa Nho cũng ñược quan sát khi nuôi cấy trên môi trường có nồng ñộ thấp auxin và cytokinin, nhưng hiện tượng này không ñược rõ ràng khi nồng ñộ các chất ñiều hòa sinh trưởng tăng (Margara và Leydecker, 1969). Nuôi Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 14 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 14 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c cấy không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, mẫu lá Begonia rex tái sinh rễ bất ñịnh ngay ở cuối ñường gân lá dài nhất, nhưng khi có mặt 5 mg/l Kinetin thì quá trình tái sinh cơ quan không diễn ra (Schraudolf và Reinert, 1959). Sự tương tác giữa chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và tính có cực tự nhiên của mẫu cấy rất phức tạp. Trong các nghiên cứu của Bigot và cộng sự (1977), các mẫu cấy từ trụ dưới lá mầm cây Cà chua có xu hướng tạo thành lượng lớn chồi hơn khi chúng ñược lấy càng gần phần rễ. Vùng trụ dưới lá mầm thể hiện khả năng tái sinh cao nhất, khác nhau tùy thuộc giống cây và loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật có trong môi trường nuôi cấy. Trong nhân giống in vitro thực vật phương pháp lớp mỏng tế bào là một trong những phương pháp quan trọng góp phần nâng cao năng suất, chất lượng mùa màng, khi ñược sử dụng kết hợp với các kỹ thuật khác. Bởi vì kĩ thuật này cho phép nhân giống một số lượng lớn một số loài hoa bằng cách tác ñộng lên một số mô hay tế bào chuyên biệt, hoặc tạo ra một cơ quan ñặc biệt trong nuôi cấy in vitro. 2.1. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (THIN CELL LAYER) 2.1.1. ðịnh nghĩa của hệ thống thin cell layer (TCL) Thực vật có những ñặc ñiểm nổi bật là có thể tái chương trình biệt hóa sự phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới (mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trường hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành mà không cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính sự phát triển bên trong thực vật ñược kiểm soát về không gian và thời gian trong một mạng lưới các ñơn vị khác nhau: cơ quan, mô, tế bào. Nếu như có sự thay ñổi trong mạng lưới này thì sự ức chế ở mức cá thể có thể xảy ra. Khái niệm về phương pháp TLC là cô lập tế bào từ mạng lưới ức chế và tái chương trình chúng bằng nuôi cấy in vitro (Nhựt và cộng sự, 2003). Hệ thống TLC bao gồm các mẫu mô có kích thước nhỏ ñược thu nhận từ các cơ quan khác nhau của thực vật (thân, rễ, lá, cụm hoa, chồi hoa, các cơ quan của hoa, lá, mầm, mô phân sinh, ñỉnh sinh trưởng hoặc phôi). Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 15 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 15 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c Khi thu nhận theo chiều dọc của mẫu là lTCL (longitudial TCL), khi thu nhận theo chiều ngang mẫu gọi là tTCL (transverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm x 0,5 mm hay 10 mm) bao gồm chỉ một dạng mô như một lớp ñơn các tế bào biểu bì (có thể ñược bóc khỏi cơ quan) hoặc là vài lớp (3 – 6) tế bào biểu bì, trong khi các mẫu tTCL (0,2 – 0,5 mm hay dày vài mm) bao gồm một số lượng nhỏ các tế bào thuộc các dạng mô khác nhau như: biểu bì, vùng thượng tầng, bó gỗ, bó mộc và các tế bào nhu mô (Tran Thanh Van và Gendy, 1996). Ngoài ra, còn có hệ thống TCL chỉ dày vài micromete phải dùng máy vi phẫu ñể cắt (LeeStedlemamn và cộng sự, 1989) nhưng với kích thước này mẫu dễ bị nhiễm khuẩn hoặc chết. 2.1.2. ðặc trưng của hệ thống ðặc trưng của lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩa là một mẫu cấy có càng ít tế bào càng tốt. ðặc ñiểm mỏng này là một trong những ñiều quan trọng các phân tử ñánh dấu (mazrkers) của quá trình biệt hóa có thể ñịnh vị in situ trong các tế bào mục tiêu hay trong tế bào cảm ứng. Quá trình ñịnh vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Tran Thanh Van, 2003). Trong quá trình cắt mẫu làm mô thực vật bị thương, nhiều enzyme hay polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaffschiew, 1990). Lý do cơ bản ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là vì chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra sinh tổng hợp cấu tạo vách tế bào và là nơi phóng thích oligosaccharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác của môi trường “kiểm soát” sự phát sinh hình thái. Một hệ thống ña bào như hệ thống TCL mang sự tổ chức không gian/thời gian của cơ thể ban ñầu. Khác với khi sử dụng một tế bào ñơn hay thậm chí tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào với tổ chức không gian/thời gian khác biệt với tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho (Tran Thanh Van, 1973). Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa rất quan trọng ñến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan. Các chương trình biệt hóa có thể thay ñổi từ việc biến ñổi mối tương quan giữa cơ quan/mô nuôi cấy với kích thước khác nhau khi nuôi cấy trên môi trường Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 16 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 16 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c có cùng tính chất. Lớp cắt dọc 0,5 x 1 x 10 mm ñược dùng phổ biến và các dạng phát sinh hình thái mong muốn có thể tạo ñược qua việc ñiều khiển mức ñộ tác ñộng của các nhân tố ngoại sinh. Bên cạnh ñó, khoảng thời gian của quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương ñối ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy), với tần số cao (gần 100% mẫu có phản ứng). Tỷ số giữa số lượng tế bào ñáp ứng với tổng số tế bào hiện diện trên mẫu TCL cao. Ví dụ như trêm một mẫu lTCL của Nicotiana tobacum (1 mm x 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì, thu nhận từ cánh hoa), các cơ quan sau ñược biệt hóa trực tiếp trên bề mặt của TCL (mà không trải qua quá trình mô sẹo trung gian): − 50 hoa trong chương trình tạo hoa. − 500 – 700 chồi trong chương trình tạo chồi. − 15 – 20 rễ trong chương trình tạo rễ. 2.1.3. Ưu ñiểm và những triển vọng của phương pháp TCL − Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường. − Dễ ñịnh vị vùng cho phản ứng do chỉ có một lớp mỏng tế bào. − Lượng phytohormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác ñộng lên mẫu. − Mẫu nuôi cấy ñồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng. − Tần số phát sinh các cơ quan, việc hình thành phôi thấp. − Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến ñổi. − Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan với toàn bộ cơ thể thực vật. − Nhanh chóng ñạt kết quả trong thời gian ngắn. Các tính chất khác mong muốn có ñược trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào: sự ñồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương pháp lớp mỏng tế bào cho mọi thực vật. Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 17 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 17 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c TCL cho phép tái sinh thành một cơ quan chuyên biệt dưới một số ñiều kiện như: − Môi trường ñược kiểm soát chặt. − Chất ñiều hòa tăng trưởng ngoại sinh ñược ñưa vào trong môi trường nuôi cấy. − Bổ sung các chất khác vào môi trường. Hệ thống TCL là một hệ thống ñơn giản, một mô hình tốt ñể nghiên cứu lãnh vực cơ bản hay nghiên cứu vào chuyển gene và tái sinh. TCL ñược sử dụng ñển nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo phôi, tạo cơ quan ở một số lượng lớn các loài thực vật. TCL còn là một phương pháp hiệu quả ñể nhân giống một số lượng lớn thực vật hoặc cơ quan với những tính trạng mong muốn, quy mô rộng, hiệu quả kinh tế cao. ðây còn là hệ thống có thể làm thay ñổi ñặc tính khó tái sinh in vitro ñối với cây rừng, cây thân gỗ, cây một lá mầm. Tuy nhiên, ñiều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL phụ thuộc vào loài và ñòi hỏi phải thử nghiệm lại tất cả các ñiều kiện, hệ thống nuôi cấy in vitro gồm các chất ñiều hòa sinh trưởng, chất dinh dưỡng, ánh sáng, sự thẩm thấu, nhiệt ñộ (Tran Thanh Van, 1980). 2.1.4. Các hệ thống TCL mẫu Phương pháp TCL ñã ñược ứng dụng ñầu tiên trong nghiên cứu về sự phát sinh hình thái sự biệt hóa cơ quan và sự phát triển một cách rất sâu sắc trên ba ñối tượng: Thuốc lá (Nicotiana tobacum), Lily (Lilium longiflorum), Cúc (Dendrathema grandiflora). ðây cũng là ba loài thực vật ñược xem như là thực vật mô hình cho hệ thống TCL.
Cây thuốc lá Từ khi xuất hiện các thuật ngữ và khái niệm hệ thống TCL thì tất cả các nghiên cứu chủ yếu ñược thực hiện trên ñối tượng mẫu này (Tran Thanh Van, 1973). Bốn chương trình phát sinh hình thái: thành lập hoa trực tiếp, thành lập chồi trực tiếp, thành lập rễ trực tiếp và mô sẹo không phát sinh cơ quan ñược cảm ứng từ mẫu lTCL thu ở nhánh hoa cây thuốc lá, sau ñó nuôi cấy trên môi trường rắn MS có bổ sung các nồng ñộ glucose, sucrose và chất ñiều hòa sinh trưởng Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 18 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 18 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c h a n g e Vi e N y bu to k .c khác nhau trong ñiều kiện chiếu sáng liên tục ở 3240 lux, 24 – 270C, ñộ ẩm 50% (Tran Thanh Van, 1980, 1981, Tran Thanh Van và Trinh, 1996). Trạng thái hoa có thể thay ñổi sang trạng thái sinh dưỡng bằng cách bổ sung vào môi trường oligosaccharide (thành phần của vách tế bào), oligosaccharide phóng thích các chất ñiều sinh trưởng trong nghiên cứu hệ thống TCL (Tran Thanh Van và cộng sự, 1985) hoặc từ sự thay ñổi pH có thể hoạt hóa như dấu hiệu phân tử. Như vậy, ngoài việc tất cả các cơ quan và mô sẹo phát sinh từ lớp biểu bì còn có yếu tố khác kiểm soát sự phát sinh hình thái từ hệ thống TCL có thể thực hiện là ñiều khiển ánh sáng, nồng ñộ ñường, oligosaccharide, thành phần ion trong môi trường nuôi cấy và ñộ pH (Cousson và Tran Thanh Van, 1992).
Cây hoa Lily Lily là một trong những loài hoa cắt cành ñẹp có giá trị và ñang nhanh chóng trở thành loài hoa xuất khẩu quan trọng. Tuy nhiên phương pháp nhân giống vô tính Lily bằng vảy củ, cũng như hệ thống vi nhân giống không mang lại hiệu quả cao. ðiều này ñã thúc ñẩy mạnh các nghiên cứu sau về hệ thống TCL trên cây hoa Lily như một công cụ và giải pháp nhằm khắc phục các nhược ñiểm. Chính tính sâu sắc của nghiên cứu này cùng với sự thành công trong tất cả các chương trình phát sinh hình thái trên cây hoa Lily, chúng ñã ñược sử dụng như một hệ thống mẫu.
Cây hoa Cúc Hệ thống TCL cũng ñược sử dụng trong các nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiều thành phần bổ sung vào môi trường như nguồn carbon, chất kháng sinh, chất ñiều hòa sinh trưởng, các ñiều kiện ảnh hưởng ñến khả năng tái sinh và phát sinh hình thái trên cây hoa Cúc. Sự tái sinh rễ, chồi và phôi soma ñã ñạt ñược khi nuôi cấy các tTCL của ñốt thân cây hoa Cúc trên các môi trường khác nhau (Teixeira da Silva và Fukai, 2003). 3.1. Tổng quan về ñối tượng nghiên cứu Hoàng Văn Thưởng Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang 19 .d o m o o c u -tr a c k w lic w w w .d o 19 m C lic k to bu ðồ án tốt nghiệp w w w C y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k .c