Tài liệu Màng peptit tái tổ hợp kháng khuẩn của tằm và Poly (L-lactic acid) (PLLA) cho các ứng dụng y sinh học

Màng peptit tái tổ hợp kháng khuẩn của tằm và Poly (L-lactic acid) (PLLA) cho các ứng dụng y sinh học. TÓM TẮT Peptide kháng khuẩn, được sản xuất bởi hệ thống miễn dịch bẩm sinh của vật chủ để đáp ứng với tác nhân gây bệnh xâm nhập, có khả năng chống lại vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng và các tế bào ung thư. Ở đây, tái tổ hợp AMP dị loại Bmattacin2 của cho thấy một loạt các hoạt tính kháng khuẩn và khả năng diệt chọn lọc đối với các tế bào da và ung thư ruột kết hơn các tế bào bình thường của nó. Đối với mục đích của ứng dụng y sinh học, kỹ thuật electrospinning - mạ điện được sử dụng để chuyển Bmattacin2 vào màng sợi nano PLLA. Ngoài khả năng tương thích tốt với các tế bào bình thường, Bmattacin2 được nạp vào màng sợi nano minh chứng hiệu quả kháng khuẩn ngay lập tức và duy trì tác dụng chống ung thư. Với những đặc điểm này, màng phức hợp PLLA / Bmattacin2 có tiềm năng lớn để phát triển các ứng dụng y sinh học mới như phương pháp điều trị ung thư và các phương pháp làm lành vết thương. GIỚI THIỆU Peptide kháng khuẩn (AMPs) là một nhóm các peptide có khả năng tiêu diệt những vi sinh vật xâm nhập - cách quan trọng của hệ thống miễn dịch bẩm sinh ở hầu hết các sinh vật. Các peptide này thường ít hơn 150-200 amino acid. Mặc dù có sự đa dạng về kích thước và cấu trúc bậc 1 và bậc 2, AMPs mang đặc điểm chung là có điện tích cation bề mặt, cho thấy tại sao có lực hút tĩnh điện giữa AMPs và các tế bào mục tiêu và tỷ lệ đáng kể dư lượng kỵ nước để tạo thành màng lưỡng cực( phân cực), đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hoạt động của AMPs sau khi các AMPs và màng tế bào gặp nhau. Ngoài ra, AMPs thường có một loạt các tính năng thông thường như sự ổn định nhiệt và kháng sinh phổ rộng( phổ rộng hoạt động kháng khuẩn). Một số AMPs đã được chứng minh có thể ức chế sự sao chép của một số loại virus bao gồm virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV) và virus cúm A. Các hoạt động của các tế bào chống ung thư và chống ký sinh trùng của AMPs cũng được báo cáo. Trong nghiên cứu này, xem xét các tính chất màng khác nhau, đặc biệt là các đặc tính tĩnh điện của vi sinh vật và tế bào người, hai loại vi khuẩn và hai cặp tế bào người (bình thường và ung thư) từ da và mô ruột kết được đánh giá là nhạy cảm với Bmattacin2. Các phép đo điện thế zeta của các tế bào đã được thông qua để theo dõi sự thay đổi điện tích bề mặt tế bào. Ở tằm, có bảy loại AMPs, bao gồm attacin, cecropin, defensin enbocin, lebocin, moricin và gloverin. AMPs attacin có hai loại protein, là attacin1 và attacin2 đã được xác định và trình tự cDNA của nó đã được tiết lộ. Phương pháp truyền thống để thu thập các AMPs của tằm là cô lập trực tiếp chúng từ thể mỡ hoặc hemolymph - huyết dịch của sinh vật, nhưng khó khăn và tốn thời gian. Gene tạo bản sao và sự biểu hiện trong hệ thống dị loại là một quá trình của công nghệ kỹ thuật protein, được xác nhận như là một cách hiệu quả để lấy được lượng lớn các protein hữu ích và protein chức năng. Vật liệu chức năng chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn và chống ung thư đã được sử dụng để chuẩn bị cho khung(scaffolds) mô được thiết kế cùng với các vật liệu tự nhiên và tổng hợp; Tuy nhiên, tác dụng độc hại đến các tế bào bình thường ở nồng độ hiệu quả của nó đã được quan sát. Mohiti-Asli, M. et al đã sử dụng hạt micro bạc (AgMPs) thay thế cho hạt nano bạc (AgNPs) và nạp chúng vào các sợi nano PLA để kiểm soát sự giải phóng. Mặc dù tác dụng hạn chế trên Staphylococcus aureus (S. aureus), khả năng gây độc cho tế bào sừng ở thượng bì của con người không thể tránh được và nó vẫn rõ ràng. Nghiên cứu tương tự của Jin, G. et al. chỉ ra rằng sợi nano poly (axit L- lactic) -CO-poly (ε-caprolacton) được nạp 0,25% hạt nano bạc có thể chống lại S. aureus và Salmonella enterica. Hơn nữa, tăng nồng độ của các hạt nano bạc dẫn đến hoạt tính kháng khuẩn của khung được tăng cường; Tuy nhiên, khả năng gây độc cho nguyên bào sợi da người tăng lên cùng một lúc. Một số loại thuốc, chẳng hạn như 5-fluorouracil (5-FU), cũng được nạp vào các khung để giải phóng thuốc và điều trị ung thư; Tuy nhiên, không thể bỏ qua việc gây hại đến các tế bào bình thường. Vì vậy, để giải quyết vấn đề này và phát triển một khung mới lạ với chức năng kháng khuẩn và chống ung thư cao hơn cũng như khả năng gây độc thấp hơn cho các ứng dụng y sinh học, tái tổ hợp Bmattacin2 ở tằm, như một loại vật liệu hoạt tính sinh học, đã được nạp vào khung sợi nano bằng kỹ thuật quay điện hóa(electrospinning). Cuộc điều tra cho thấy tạo màng sợi nano PLLA / Bmattacin2 có một tiềm năng lớn cho các ứng dụng y sinh học cũng như điều trị ung thư và chữa lành vết thương. CÁC KẾT QUẢ: Khả năng của Bmattacin2 nhắm mục tiêu tế bào ung thư Bằng cách sử dụng một hệ thống dị loại E. coli BL21, gen AMP từ tằm Bombyx mori, Bmattacin2, được thể hiện. Bmattacin2 tái tổ hợp có kích thước phân tử 22 KD (bổ sung hình. S1). Hơn nữa, nó đã được làm sạch (bổ sung hình. S1). Chúng tôi đánh giá những tác động của Bmattacin2 vào sự tồn tại của hai tế bào ung thư (tế bào hắc tố ác tính, A375 và tế bào ung thư đại trực tràng của con người, HCT116) , cùng với các tế bào đối ứng bình thường của nó (nguyên bào sợi bao quy đầu người, HFF-1 và các tế bào ruột kết của thai nhi, FHC). So với các tế bào bình thường không bị ảnh hưởng (Hình. 1a2,6), hình thái bề mặt của hai tế bào ung thư (Hình. 1a4,8) bị phá hủy nghiêm trọng với sự hiện diện của 2 mM Bmattacin2 sau 24 giờ ủ. Sự phân mảnh hạt nhân hoặc sự ngưng tụ nhiễm sắc (Hình. 1b4,8) và bộ khung tế bào bị rời rạc của A375 và HCT116 (Hình. 1c4,8) so với các tế bào bình thường. IC50 của Bmattacin2 theo A375 và HCT116 là 5,23 và 1,70 mM tương ứng, trong phạm vi micro phân tử . Việc đánh giá tính khả thi (Hình. 1d, e) tiếp tục hỗ trợ tiềm năng Bmattacin2 có thề giết chọn lọc A375 và tế bào ung thư HCT116 mà vẫn duy trì các counterpart đối tác bình thường của nó dưới 12 mM. Hình 1. Ung thư tế bào mục tiêu khả năng của Bmattacin2. Các tế bào được điều trị với môi trường nuôi cấy (số lẻ) hoặc 2μM của Bmattacin2 (số chẵn) trong 24 giờ. (A) hình thái bề mặt tế bào đã được quan sát bằng kính hiển vi quét điện tử. Bar = 10μm. (B) Các nhân tế bào được nhuộm bởi DAPI. Bar = 50μm. (C) Các bộ xương tế bào (actin) đã được nhuộm màu bởi TRITC-phalloidin. Bar = 50μm. (D) Nhân ruột kết các tế bào bình thường (FHC) và các tế bào ung thư (HCT116) đã phải chịu bởi Bmattacin2 từ 1 tới 12μM trong 24 giờ và viabilities di động được đánh giá bởi MTS khảo nghiệm. (E) của thai nhi các nguyên bào sợi bao quy đầu (HFF-1) và tế bào da hắc tố ác tính (A375) từng là một cặp so sánh. Tác dụng kháng khuẩn của Bmattacin2. Bmattacin2 trong tằm được biểu hiện khi có sự xâm nhập của vi sinh vật bên ngoài. Hai loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong tằm nhiễm, S. maicesceis và B. bombysepticus, cùng với ba chủng vi khuẩn phổ biến trong phòng thí nghiệm, E. coli ATCC25922, E. coli DH5α và S. aureus ATCC25923, được sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của tái tổ hợp Bmattacin2. Khảo nghiệm MIC chỉ ra rằng Bmattacin2 đã hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm (E. coli DH5α, E. coli ATCC 25.922, và S. maicesceis) và vi khuẩn Gram dương (S. aureus ATCC 25.923 và B. bombysepticu) (Hình 2a). Sự gia tăng của những vết vi khuẩn Gram âm và Gram dương đều bị ức chế bởi Bmattacin2 ứng với từng liều lượng (Hình. 2b). Như thể hiện trong hình. 2c, vết huỳnh quang sống / chết chỉ ra rằng Bmattacin2 giết chết vi khuẩn E. coli và S. aureus tại những MIC tương ứng. Xuất hiện nhiều lỗ với các hình dạng khác nhau trên bề mặt của tế bào E. coli sau khi ủ với Bmattacin2. Các tác dụng bất lợi trên S. aureus ATCC25923 gây ra bởi Bmattacin2 là do sự mất mát của màng tế bào và các mảnh vỡ tế bào (Hình. 2d). Một phổ kháng khuẩn rộng của Bmattacin2 tái tổ hợp được quan sát rõ ràng. Hình 2. tác dụng kháng khuẩn của Bmattacin2. (A) hoạt động kháng khuẩn (MIC) của Bmattacin2 chống lại một nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm (E. coli DH5α, E. coli ATCC25922, S. maicesceis), bao gồm ba loại vi khuẩn Gram âm và hai loại vi khuẩn Gram dương (S. aureus ATCC25923 và B. bombysepticus). (B) ức chế sự tăng trưởng Bmattacin2 qua trung gian của các vi khuẩn đã được tiến hành bằng cách ghi lại các giá trị OD ở 600 nm sau khi ủ 18 giờ. Tốc độ tăng trưởng giữa các chủng vi khuẩn khác nhau trong một loạt các nồng độ Bmattacin2 đã được bình thường hóa bởi nhóm kiểm soát (b). Dữ liệu được thể hiện như có nghĩa là với độ lệch chuẩn của ít nhất ba lần nhắc lại. (C) sống/chết nhuộm của E. coli và S. aureus ATCC25922 ATCC25923 (màu xanh lá cây chỉ sống tế bào, màu đỏ là các tế bào chết) sau khi điều trị bằng Bmattacin2 tại MIC của họ trong 18 giờ tương ứng. Bar = 50μm. (D) Các hiệu ứng của Bmattacin2 chống lại bề mặt của E. coli và S. aureus ATCC25922 ATCC25923 được đánh giá thông qua SEM quan sát. Bar = 1μm. Nhắm mục tiêu động lực học. Một trong những cơ chế tấn công phổ biến nhất được công nhận của AMPs là sự phá vỡ màng khi các peptide gặp vi khuẩn và các tế bào. Để cải thiện sự hiểu biết của chúng ta về sự tương tác giữa Bmattacin2 và các tế bào khác nhau, chúng tôi đặc trưng tích điện bề mặt của các vi khuẩn và các tế bào của con người bằng cách đo giá trị tiềm năng zeta trong sự vắng mặt và sự hiện diện của Bmattacin2 (Hình. 3). Hình 3. cơ chế tiềm năng của hoạt tính kháng khuẩn và các hiệu ứng ung thư tế bào mục tiêu của Bmattacin2. Bmattacin2 được đánh giá là một protein cation ở giá trị pH sinh lý với cấu amphipathic. Hoạt tính kháng khuẩn của Bmattacin2 có thể do sự hút tĩnh điện. điện bề mặt của tế bào được đánh giá bằng cách giám sát zeta tiềm năng của các tế bào. Zeta tiềm năng của E. coli, S. aureus, FHC, HCT116, HFF-1, A375 được đo sau khi tế bào được ủ trong sự vắng mặt hoặc có mặt của Bmattacin2 trong 30 phút. Những thay đổi hình thái tương ứng của các tế bào đã được mô tả. Người ta tin rằng những bước ngoặt tích cực của thế zeta phản ánh sự tương tác tĩnh điện của bề mặt tế bào tích điện âm với peptides10-12 tích điện dương. Trong điều kiện của vi khuẩn, các tương tác tĩnh điện là bước đầu của đề xuất giả thuyết về cơ chế làm việc của AMP. Barrel ngăn chặn mô hình, mô hình thảm hoặc mô hình lỗ hình xuyến được đề xuất liên quan đến cái chết của vi khuẩn. Đối với các tế bào, các Bmattacin2 tăng gây ra một sự gia tăng tiềm năng zeta của tất cả các tế bào được thử nghiệm trừ FHC, cho thấy một sự tương tác tĩnh điện yếu giữa Bmattacin2 và tế bào ruột của thai nhi bình thường này. Các trung hoà điện tích bề mặt của các tế bào HFF-1 cũng được quan sát, mặc dù không có tác dụng phụ hơn nữa đã được tìm thấy sau đó. Nó có thể là hiệu lực ràng buộc đã không đạt được tình trạng bão hòa để bắt đầu một hiệu ứng gây chết người cho tế bào HFF-1. Một khả năng khác là hút tĩnh điện đóng góp vào hiệu quả của Bmattacin2 tương tác với các tế bào gặp phải tham gia nhiều hơn của protein và màng cũng được yêu cầu để kích hoạt các effects10,11 gây chết người. FITC nhãn Bmattacin2 cho thấy mối quan hệ ràng buộc ưu đãi cho các tế bào ung thư (bổ sung hình. S2), thể hiện một sự tham gia ổn định giữa Bmattacin2 và màng tế bào của các tế bào ung thư tăng cường khả năng Bmattacin2 trong giết chóc có chọn lọc các tế bào ung thư. Có hai loại attacins trong tằm. Cả hai attacins là các AMPs glycine giàu và các lĩnh vực của họ với những dư lượng glycine được bảo tồn một cách yếu ớt trong suốt quá trình tiến hóa giống như các gia đình attacin từ các loài khác. Các đặc tính cho thấy Bmattacin2 có cao như 25% của α-helix trong cấu trúc thứ cấp của nó, được xác định như là một cấu trúc có khả năng tương quan với hoạt tính kháng khuẩn. Trong khi đó, Bmattacin2 có điện lưới là 4,1 ở pH 7.0 mà có thể là do sự tích tụ của các axit amin cation. Việc sở hữu điện tích dương trong cấu trúc chức năng của Bmattacin2 có thể là một lý do tương tác tĩnh điện. Đối với vi khuẩn, số lượng lớn của lipopolysaccharides (LPS) hoặc axit teichoic (TA) được trình bày trên các vách tế bào mang tích điện bề mặt tiêu cực tới màng ngoài của vi sinh vật, và đối với các tế bào ung thư, biểu hiện cao phosphatidylserine, glycolipid và glycoprotein hoặc chaperone protein này cũng góp phần mật độ điện tích âm. Đối với điều tra của chúng tôi, các đặc tính này được cho là dẫn đến một sự tương tác tĩnh điện giữa cation Bmattacin2 và màng tính tiêu cực của tế bào vi khuẩn hoặc ung thư, đó là một điều kiện tiên quyết cần thiết nhưng không độc quyền cho chọn lọc giết AMP tái tổ hợp này. Hình 4. Tải trọng của Bmattacin2 trên màng PLLA và giải phóng Bmattacin2 từ PLLA / Bmattacin2 màng. Màng composite với PLLA và Bmattacin2. Nhiều chiến lược đã được thực hiện để tích hợp AMPs với các chất nền thích hợp nhằm khắc phục những hạn chế xuất phát việc dễ bị tổn thương trong dung dịch và các tác động bất lợi đối với tế bào chủ ở các nồng độ 29,30,31,32,33. Sử dụng điện hóa để đưa các phân tử sinh học chức năng vào giá đỡ sợi nano trên bề mặt hoặc bên trong của sợi, sự phóng thích các protein hay peptide thời hạn dài có thể bảo quản (Hình. 4). Trong nghiên cứu này, Bmattacin2 nồng độ 2% được nạp lên màng PLLA bằng cách mạ điện. Người ta sử dụng quang phổ FTIR để đánh giá cấu trúc micro của các màng composite quay điện. Ba đỉnh đại diện cho amide I, amide II và amide Ш tại 1634 cm-1, 1531 cm-1, và 1258 cm-1 tương ứng đã được phát hiện cho mẫu Bmattacin2 và đỉnh đầu tiên tại 1634 cm-1 được quan sát rất rõ rệt trong quang phổ của màng nano PLLA / Bmatttacin2 mặc dù hai đỉnh kia quá yếu để có thể quan sát. Ngoài ra, đỉnh tại 1757 cm-1 là một đỉnh đặc trưng của PLLA cũng được tìm thấy trong màng nano quang phổ của PLLA / Bmatttacin2 (bổ sung hình. S3), khẳng định rằng màng nano quay điện PLLA / Bmatttacin2 bao gồm PLLA và Bmattacin2. Màng quay điện PLLA / Bmattacin2 có phạm vi đường kính rộng, từ 170 nm đến 2180 nm (bổ sung hình. S4) giúp PLLA / Bmattacin2 có độ bền kéo nhỏ hơn khoảng 2,7 ± 0,3 MPa; Tuy nhiên, các mô đun kéo của PLLA / Bmattacin2 khoảng 45,7 ± 13,2 MPa và lực kéo khoảng 24,2 ± 3,9% chỉ ra màng quay điện PLLA / Bmattacin2 phù hợp để sử dụng như a scaffold (giá đỡ/ nền tảng...) in human skin TERM một giàn giáo tại HẠN da người (Bảng bổ sung S1). Hơn nữa, cuộc điều tra (bổ sung hình. S5) cho thấy hầu hết các Bmattacin2 hòa tan nhanh chóng sau khi màng bị đắm và nồng độ thấp của Bmattacin2 có thể được duy trì sau 48 giờ. Đặc tính của màng PLLA / Bmattacin2. Để phát triển một nền tảng mới với tác dụng kháng khuẩn và chống ung thư cho các ứng dụng y sinh học, màng PLLA / Bmattacin2, PLLA / 5-FU, và PLLA / 5-FU / Bmattacin2 đã được chuẩn bị bằng cách mạ điện. Như trong hình. 5a, tính khả thi của HCT116 trên PLLA / Bmattacin2, PLLA / 5-FU và PLLA / 5-FU / Bmattacin2 đã dần dần bị bỏ đi trong 1 ngày. Giá trị OD492 và những tế bào sống của các tế bào trên PLLA / 5-FU / Bmattacin2 vào ngày thứ 3 là ít nhất, cho thấy Bmattacin2 đóng vai trò hỗ trợ tế bào chống ung thư. (Hình 5b4.), khung tế bào và nhân tế bào không còn nguyên vẹn(Hình. 5b8) và lớp tế bào rời rạc( Hình. 5b16). Sự phá hủy màng tế bào cũng có thể được quan sát thấy trên PLLA / 5-FU và PLLA / Bmattacin2 (Hình. 5b14). Những kết quả này cho thấy cả ba loại màng phức hợp PLLA / Bmattacin2, PLLA / 5-FU và PLLA / 5-FU / Bmattacin2 hiệu quả có thể ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư HCT116. Hình 5. Hoạt động chống ung thư màng hỗn quay điện. (A) khả năng di động của HCT116 sau khi gieo hạt trên màng phức hợp chế tạo trong 4 giờ, 1 ngày và 3 ngày. Dữ liệu được trình bày như là giá trị trung bình với độ lệch chuẩn từ xác định ba lần, * p <0,05. (B) Quan sát các tế bào HCT116 cấy trên bề mặt của màng phức hợp chế tạo trong 3 ngày. (B1- b4) Live / chết nhuộm tế bào. Bar = 50μm. (B5-b8) nhuộm huỳnh quang của các tế bào bởi DAPI / FITC. Bar = 50μm. (B9-B16) SEM quan sát. Các hoạt động kháng khuẩn của màng quay điện PLLA / Bmattacin2 trên E. coli và S. aureus được xác định bằng AATCC100. Các phân tích cho thấy màng PLLA / Bmattacin2 đã ức chế 26,2% trên E. coli và 32,3% trên S. aureus (Hình. 6a). Nhuộm vi khuẩn bằng SYTO 9 và propidium iodide cho thấy vi khuẩn sống (xanh) (Hình. 6b1) và vi khuẩn chết (màu đỏ) (Hình. 6b3) trên màng, cho thấy tác dụng kháng khuẩn của PLLA/Bmattacin2. Hơn nữa, SEM cho thấy hình dạng nguyên vẹn của cả hai loại vi khuẩn trên bề mặt của màng PLLA (Hình 6b5.); Tuy nhiên, trên màng PLLA/Bmattacin2 (Hình. 6b6), bề mặt của hai loại vi khuẩn bị phá hủy. Điều này khẳng định rằng quay điện PLLA/Bmattacin2 có hoạt động rõ ràng đối với cả hai loại vi khuẩn, E. coli và S. aureus. Hình 6. hiệu lực kháng khuẩn của màng quay điện composite. (A) Điều tra tác dụng kháng khuẩn của màng phức hợp quay điện trên E. coli và S. aureus bởi AATCC100 phương pháp. (B) Quan sát của E. coli được nuôi cấy trên bề mặt của PLLA hoặc màng PLLA/Bmattacin2. (B1- b4) sống/chết nhuộm vi khuẩn. (B5, b6) SEM quan sát. (C) Quan sát của S. aureus nuôi cấy trên bề mặt của PLLA hoặc PLLA màng/Bmattacin2. (C1-c4) sống/chết nhuộm vi khuẩn. (C5, c6) SEM quan sát. Sự tăng sinh của các tế bào HFF1 tăng dần cả PLLA và PLLA/Bmattacin2 cho thấy những loại ma trận có khả năng tương thích tế bào thuận lợi. Đặc biệt, vào ngày 1, ngày 3 và ngày thứ 7, không có sự chênh lệch về tỷ lệ tăng sinh giữa hai màng này (Hình. 7a). Hơn nữa, SEM đã được sử dụng để quan sát hình thái học của tế bào nuôi cấy HFF1 trên PLLA và ma trận PLLA/Bmattacin2 và kết quả hàm ý một khả năng tương thích tốt của cả hai màng PLLA và PLLA/Bmattacin2 (Hình. 7b1). nhuộm huỳnh quang cũng chỉ thị thấy những tế bào sống HFF-1 lây lan khắp trên hai loại màng và hầu như không có bất kỳ tế bào chết nào được tìm thấy sau vài ngày nuôi dưỡng (7c. Fig, d). Màng phức hợp PLLA/Bmattacin2 cung cấp một con đường khuếch tán ngắn protein từ scaffold giàn giáo để các tế bào gặp phải; Tuy nhiên, trong quá trình chuẩn bị của màng, giải pháp hữu cơ được sử dụng trong mạ điện đã có một ảnh hưởng tiêu cực đến hoạt động của Bmattacin2. So với Bmattacin2 tinh khiết, hoạt động kháng khuẩn của màng sợi nano PLLA/Bmattacin2 giảm và tác động chống ung thư giảm mạnh (Hình 5a.), Một phương pháp khác để electrospinning quay điện cho việc chuẩn bị của màng phức hợp phải được giới thiệu thêm. Hiện đã có một phát hiện thú vị mà PLLA nạp vào Bmattacin2 cùng với thuốc chống ung thư 5-FU làm tăng đáng kể hiệu quả hoạt động của tế bào chống ung thư so với PLLA chỉ nạp vào Bmattacin2 hay thuốc chống ung thư 5-FU . Điều này có thể liên quan đến các cơ chế Bmattacin2 trên các tế bào ung thư với các điện tích dương ở pH 7.0, Bmattacin2 có thể góp phần tạo nên các kênh trên màng của các tế bào ung thư. Một mặt, các kênh này có thể gây ra cái chết của các tế bào ung thư trực tiếp từ sự mất mát của các thành phần tế bào. Mặt khác, các kênh này giúp thuốc được đưa vào các tế bào và làm cho thuốc hiệu quả hơn. Trong tương lai, các cơ chế chi tiết phải được nghiên cứu. Hình 7. Khả năng tương thích của các màng quay điện composite. (A) khả năng di động của HFF-1 sau khi gieo hạt trên màng phức hợp chế tạo cho 1 ngày, 3 ngày và 7 ngày. (B) SEM quan sát sau khi gieo hạt trên màng phức hợp chế tạo trong 7 ngày. (C) sống / chết nhuộm tế bào sau khi gieo hạt trên màng phức hợp chế tạo trong 7 ngày. Bar = 50μm. (D) nhuộm huỳnh quang của các tế bào bởi DAPI / FITC sau khi gieo hạt trên màng phức hợp chế tạo trong 7 ngày. Bar = 50μm. KẾT LUẬN Peptide kháng khuẩn Bmattacin2 của tằm được trình bày. Peptide tái tổ hợp này có tế bào ung thư và kháng khuẩn. Để chuẩn bị màng phức hợp cho các ứng dụng y sinh học, điện hóa đã được áp dụng để tích hợp Bmattacin2 vào màng PLLA. Việc electrospun điện hóa/ly tâm màng PLLA/Bmattacin2 có khả năng tương thích tốt giúp cải thiện sự kết nối và phát triển của các tế bào da người HFF1. Nó cũng cho thấy các tác dụng kháng khuẩn dự kiến trên vi khuẩn E. coli và S. aureus, giúp tránh nhiễm trùng, góp phần tăng tốc da lành vết thương. Ngoài ra, hoạt động tế bào chống ung thư quan trọng của PLLA/Bmattacin2 và vai trò hỗ trợ của Bmattacin2 trong hợp màng PLLA/5-FU/Bmattacin2 đã được quan sát. Với những đặc điểm này, màng nano PLLA/Bmattacin2 có một tiềm năng lớn cho các ứng dụng y sinh học trong việc tái tạo da, điều trị ung thư, và chữa lành vết thương. PHƯƠNG PHÁP. Các biểu hiện và tinh sạch Bmattacin2. Trình tự đầy đủ của cDNA và dự đoán chuỗi acid amin của Bmattacin2 (BGIBMGA002739-TA) đã được tải trực tuyến từ cơ sở dữ liệu gen của tằm (http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/). Các peptide tín hiệu của Bmattacin2 đã được dự đoán trên trang web SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) và sau đó đã được gỡ bỏ từ các trình tự tải về. Các gen Bmattacin2 mã hóa cho peptide trưởng thành được sao chép thành vector biểu hiện pET-28a (+) nhân thực (bổ sung hình. S6) và thể hiện trong E. coli BL21. SAS-PAGE đã được sử dụng để phát hiện protein tái tổ hợp . Đối với thanh lọc, 1 lít LB đã được dùng để nuôi cấy các tế bào E. coli có chứa plasmid tái tổ hợp, sau khi cảm ứng bốn giờ, thu các tế bào E. coli bằng ly tâm ở 5000 × g trong 10 phút. Kết tủa được rửa sạch hai lần, và sau đó bị huyền phù trong 20 mM Tris-HCl lạnh và được ly giải bởi sonication – Kỹ thuật nghiền mẫu bằng sóng siêu âm. Sau đó ly tâm trong 30 phút ở 14.000 × g ở 4 ° C, kết tủa thu được hòa tan trong 6 M urea. Sau khi ly tâm ở 14.000 xg trong 30 phút ở 4 ° C, thu nhận dung dịch nổi và lọc. Cột ái lực HisTrap (GE Healthcare) được sử dụng để làm sạch tái tổ hợp Bmattacin2 theo hướng dẫn. Lọc ly tâm Amicon Ultra-15 (Millipore) được sử dụng để thẩm thấu và cô đặc protein, cuối cùng, tái tổ hợp Bmattacin2 được lưu trữ trong PBS, pH 8,0. Hoạt động tế bào chống ung thư của tái tổ hợp Bmattacin2. Nguyên bào sợi bao quy đầu của người (HFF-1, ATCC® SCRC1041 ™) và các tế bào ruột kết của thai nhi (FHC, ATCC® CRL-1831 ™) được mua từ ATCC. Tế bào hắc tố ác tính ở da người (A375) được tặng bởi Giáo sư Leung YunChung từ Khoa Sinh học Ứng dụng và Công nghệ hóa học của Đại học Bách khoa Hồng Kông. Tế bào ung thư đại tràng ở người được lấy từ Ngân hàng tế bào của Học viện Khoa học Trung Quốc (Thượng Hải, Trung Quốc). Tế bào HFF-1 và A375 được nuôi cấy trong Modified trung Eagle của Dulbecco (DMEM), các tế bào HCT116 được duy trì trong RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) trong khi FHC được ủ trong Dulbecco Modified Eagle Medium: Hỗn hợp dinh dưỡng F-12 (DMEM/F12) . Tất cả các môi trường nuôi cấy được cung cấp 1% Penicillin Streptomycin và 10% huyết thanh bào thai bò (FBS). Tất cả các môi trường nuôi cấy và vật liệu nói trên được mua từ công nghệ Life. DMEM/F12 được cung cấp thêm 10 mM HEPES (nồng độ cuối cùng là 25 mM), 10 ng / ml độc tố bệnh tả, 5 mg / ml insulin, 5 mg / ml transferrin và 100 ng / ml hydrocortisone. Tất cả các nguồn cung cấp được mua từ Sigma. Các điều kiện canh tác được thiết lập ở 37 ° C, 5% CO2 và độ ẩm 95%. Đối với việc quan sát kính hiển vi quét điện, tế bào được cấy 24 giếng trong đĩa thủy tinh với nồng độ 1 × 104 tế bào / cm2 và 6 × 104 tế bào / cm2 và cho phép tăng trưởng trong 24 giờ. Sau khi ủ Bmattacin2 trong 24 giờ, các tế bào trên đĩa thủy tinh đã được cố định với 4% paraformaldehyde trong 15 phút ở nhiệt độ phòng để theo dõi sự mất nước với một loạt các giải pháp ethanol / nước được phân loại( tương ứng 50%, 70%, 80%, 95% và 100 %). Các mẫu được lưu giữ trong tủ hút để khô ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được bọc bằng vàng trước khi quan sát dưới kính hiển vi quét điện tử (JEOL mẫu JSM-6490) để xác định hình thái bề mặt của chúng. Đối với quan sát bên trong tế bào, các tế bào được cấy trong đĩa petri cho đến khi hợp lưu/ dính chùm. Nó được rửa sạch nhẹ nhàng với 37 ° C đệm muối phosphate. Các tế bào này sau đó được cố định với 4% paraformaldehyde trong đệm muối phosphate ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, và được thẩm thấu với 0,1% Triton X-100 trong đệm muối phosphate 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, bộ xương tế bào được đánh dấu bằng 10 mg / ml TRITC-phalloidin (Sigma) trong 30 phút, tránh ánh sáng. Hạt nhân của các tế bào đã được nhuộm thêm với 1 mg / ml DAPI (Sigma) trong PBS trong 5 phút. Các tế bào được nhuộm màu được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (Eclipse 80i, Nikon). Hình ảnh huỳnh quang được chụp bởi máy ảnh kỹ thuật số (DXM 1200C, Nikon). Khảo nghiệm MTS (CellTiter 96® khảo nghiệm Một Giải pháp tăng sinh tế bào, Promega) đã được thực hiện để đo lường khả năng của bốn dòng tế bào để đáp ứng với các protein tái tổ hợp Bmattacin2. Các tế bào được cấy trên đĩa 96 giếng khoảng 24 giờ để đạt được 70% confluence /hợp dòng. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được ủ với nồng độ Bmattacin2 khác nhau (1-12 mM) tương ứng cho 24 giờ. Tế bào trung bình bị loại bỏ và các tế bào được rửa bằng PBS mới. 100 ml môi trường mới đã được thêm vào mỗi giếng. Giải pháp MTS được thêm vào mỗi giếng ở tỷ lệ 1: 5. Các tấm được ủ ở 37 ° C / 5% CO2 trong 3-4 giờ tiếp theo và ghi nhận các giá trị OD ở 492 nm sử dụng Micro-tấm Reader – Máy phân tích Elisa (Infinite F200, TECAN). Tế bào khả thi được thể hiện dưới dạng trung bình ± SD, tính từ ba thí nghiệm độc lập. Hoạt động kháng khuẩn của Bmatacin2 tái tổ hợp. Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) của Bmattacin2 trên năm chủng vi khuẩn được đo bằng broth vi pha loãng thí nghiệm với một sự điều chỉnh nhỏ. Năm chủng vi khuẩn đã được sử dụng bao gồm Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Seiiatiomaicesceis, Escherichia coli DH5α và Bacillus bombysepticus. Khuẩn lạc đơn của mỗi chủng vi khuẩn đã được nuôi cấytrong 5 ml LB ở 37 ° C qua đêm, sau đó thêm 50µl dịch nuôi cấy vào 5 ml LB trong 3-4 giờ ủ cho đến khi OD đạt 0,4, nồng độ vi khuẩn sau đó được pha loãng đến 1,5 × 10 8đơn vị khuẩn lạc (CFU) / ml theo tiêu chuẩn McFarland 0.5. Pha loãng liên tục của Bmattacin2 đã tinh chế (purified) được chuyển vào đĩa 96 giếng cùng với dịch nuôi cấy vi khuẩn để đảm bảo nồng độ cuối cùng của vi khuẩn là 5 × 10 4 CFU/giếng. Tổng thể tích của hỗn hợp Bmattacin2 và vi khuẩn là 100μl. Các giá trị MIC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của Bmattacin2 mà duy trì môi trường nuôi cấy clear sau khi 18-24 giờ ủ. Dựa vào các tiêu chuẩn từ nghiên cứu của Cado, sau khi có sự điều chỉnh nhỏ, tốc độ tăng trưởng bình thường của vi khuẩn đượcbiểu thị bởi giá trị OD 600 trong sự hiện diện hay vắng mặt của Bmattacin2. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình với độ lệch chuẩn của ít nhất ba lần lặp lại. Giá trị OD600 của dịch nuôi cấykhi không có Bmattacin2 (đối chứng âm) được xem như là sự tăng trưởng 100% của vi khuẩn và giá trị OD 600 của môi trường nuôi cấy được xem như là tốc độ tăng trưởng 0 % (trống). Tương ứng với tỷ lệ tăng trưởng của vi khuẩn đã được đánh giá và tính toán bằng phương trình sau đây: Sự tăng trưởng của vi khuẩn (%) =( OD ẫ đố chứng ố ( -OD OD 600 m u âm-OD 600 n tr g) 600 i trống) ×100 60 0 Tình trạng sống/chết các vi khuẩn đã được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nồng độ của vi khuẩnđược điều chỉnh trong khoảng 2×10 8/ml theo tiêu chuẩn Mcfarland. Các tế bào được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút và các hạt nhỏ được huyền phù trong dung dịch đệm HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid, 10 mM). Huyền phù vi khuẩn (1 ml) được trộn lẫn với 3 μl hỗn hợp trộn sẵn thuốc nhuộm của SYTO9 và propidium iođua(Khảo sát khả năng sống/chết của vi khuẩn BacLight,cuộc sống công nghệ), và ủ ở nhiệt độ phòng trong tối trong 15 phút. Về hình thái bề mặt của vi khuẩn, Bmattacin2 ở nồng độ 10μM tác động đến chủngE. coli ATCC25922 hoặc S. aureus ATCC25923 trên 1 lá nhôm. Sau đó, hỗn hợp được để khô tự nhiên và tráng bằng vàng. Hỗn hợp tráng được quét qua kính hiển vi điện tử. Đo điện thế zeta của các tế bào và các mối quan hệ ràng buộc của Bmattacin2. Để đo lường điện thế zeta, nồng độ của vi khuẩn (E. coliATCC25922 hoặc S. aureus ATCC25923) đã được điều chỉnh lên khoảng 1,5×10 8/ml theo tiêu chuẩn McFarland 0.5. Điện thế zeta của tế bào người cũng được đo, 1×106 tế bào được ủ trong sự hiện diện của Bmattacin2 trong 30 phút với nồng độ khác nhau. Sau khi rửa với HEPES, vi khuẩn hoặc các tế bào người được huyền phù một lần nữa và được xử lý bằng Bmattacin2 (hòa tan trong HEPES) ở nồng độ khác nhau. Giá trị pH được theo dõi và duy trì ở mức 7.4. Dịch huyền phù được nạp vào các tế bào zeta có sẵn với điện cực vàng và cho phép cân bằng trong 30 phút ở 25°C. Điện thế zeta được đo bằng cách sử dụng phân tích tiềm năng zeta (Zeta Plus) từ Brookhaven Instruments Corporation.Các giá trị được tự động tính toán từ sự điện di lưu động dựa trên phương trình Smoluchowski. Các mối quan hệ ràng buộc của Bmattacin2 được xác định bằng cách hình dung các tế bào trong sự hiện diện của FITC ký hiệu Bmattacin2. Các tế bào được cấy vào khoang tế bào cho đến khi 70% hợp lưu, 0.5 µM FITC-Bmattacin2 được bổ sung sau 24 giờ, sau khi rửa, khung tế bào đã được nhuộm màu bởi TRITC-phalloidin. Tế bào và FITC-Bmattacin2 còn lại đã được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Sự chuẩn bị của màng phức hợp bởi mạ điện. Một dung dịch PLLA với một nồng độ 1,0% đã được chuẩn bị bằng cách hòa tan PLLA trong một dung dịch hữu cơ hỗn hợp của chloroform (90% trọng lượng) cùng với DMF (10% trọng lượng). 1 mg Bmattacin2 bột được chuẩn bịhòa tan trong 5g dung dịch PLLA để hình thành dịch huyền phù PLLA/Bmattacin2.Một ống tiêm với một kim tiêm đã được kết nối với điện áp cao được sử dụng để tải và cung cấp hệ thống huyền phù này. Quay điện được thực hiện ở điện áp 15 KV, tốc độ dòng chảy 0,3 ml / phút và khoảng cách từ mũi kim vào các thụ thể là 10 cm ,được nối với một lá nhôm. Trong khi đó, màngPLLA nanofibrous tinh khiết cũng đã được chuẩn bị cũng như kiểm soát dựa trên các thông số tương tự. Đối với quan sát vi cấu trúc của màng quay điện, các mẫu được nén lêntấm màng cùng với kali bromua có khả năng phân tách, và sau đó vi cấu trúc của chúng đã được nghiên cứu bởi biến đổi Fourier phổ hồng ngoại (FTIR, Nicolet 5700, Thermo Công ty). Tất cả các phổ được ghi lại trong chế độ hấp thụ tại 2 cm -1 số sóng khoảng từ 500 cm - 1 đển 2500 cm1. Hình thái của các sợi nano quay điện đã được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) (Stereoscan 440, LEICA). Đường kính của sợi nano quay điện được đo bằng máy Nano 1.2 bằng cách chọn các sợi ngẫu nhiên tại hơn 3 địa điểm khác nhau. Toàn bộ có hơn 100 sợi khác nhau được đo cho mỗi mẫu. Tất cả các dữ liệu đã thu thập được phân tích bằng OrginPro8 (OriginLab Corporation). Các giá trị được báo cáo là giá trị trung bình ± SD cho tất cả các kết quả. Để đo tính chất cơ, màng quay điện được cắt thành 50 × 10 mm dải tương ứng và sau đó việc thực hiện cơ học của các màng này được đặc trưng bởi Instrons 5560 (Instron, Canton, MA) với một tế bào tải 10N. Mỗi bài kiểm tra độ bền kéo được thực hiện ở nhiệt độ phòng với tốc độ con trượt 5 mm/phút và một tiền tải 0,1 MPa. Tất cả độ bền được báo cáo và các giá trị ứng với suất kéo đại diện cho giá trị trung bình 7-8 đo. Tất cả dữ liệu đã thu thập được phân tích bằng OrginPro8 (OriginLab Corporation). Các giá trị được báo cáo dưới dạng trung bình ± SD cho tất cả các kết quả. Đặc tính của màng PLLA / Bmattacin2. Để nghiên cứu về hoạt động chống tế bào ung thư, Bmattacin2 đã đông khô và 5-FU (sigma) đã được pha trộn vào dung dịch PLLA và màng quay điện PLLA/Bmattacin2 (2% trọng lượng), PLLA/5-FU (7,5% trọng lượng), và PLLA/5-FU/Bmattacin2 (7,5% trọng lượng, 2% trọng lượng) đã được chuẩn bị. Các màng dạng dợi được đặt trong đĩa đa giếng. Sau khi tiếp xúc với tia cực tím, các tế bào được cấy ở mật độ 6×10 4 tế bào trên mỗi cm2. Các tế bào trong giếng được rửa bằng PBS trước khi đánh giá. Dung dịch MTS và 100 µl môi trường mới được thêm vào mỗi giếng theo tỷ lệ 1:5, các đĩa được ủ ở 37°C trong 4 giờ.Độ hấp thụ của môi trường ở 490 nm được ghi lại micro-plate reader. Dữ liệu trung bình với độ lệch chuẩn từ ba lầnxác định. ANOVA đã được áp dụng cho nhiều nhóm so sánh theo dõi bởi sự khác biệt nhỏ nhất có nghĩa (LSD) nghiên cứu cho phương pháp so sánh giữa các nhóm. Như nhuộm sống/chết, tế bào có thể thẩm thấu diacetate esterase- substrate fluorescein (FDA) cùng với tế bào axit nucleic nhuộm propidium iodide (PI) được sử dụng để đánh giá khả năng phát triển của các tế bào trên màng nanofibrous. Mỗi mẫu được rửa bằng PBS ba lần và sau đó các tế bào được nhuộm màu bằng cách rửa trong 1µg/ml FDA và 1µg/ml PI trong 5 phút ở trong tối và nhiệt độ phòng. Sau đó mẫu được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Đánh giá việc nhuộm cấu trúc nội bào và sự quan sát bề mặt hình thái của các màng PLLA / Bmattacin2 được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp tương tự được đề cập đến tại phiên họp về hoạt động chống tế bào ung thư của Bmattacin2 tái tổ hợp. AATCC100 đã được sử dụng để xác định hoạt động của màng quay điện PLLA / Bmattacin2. Màng quay điện PLLA/attacin2 (Nồng độ Bmattacin2 là 2% trọng lượng) và màng PLLA (đối chứng âm) được cắt thành miếng với kích thước 2,5 cm 2. Sau khi khử trùng bằng tia cực tím, hai mảnh được đặt vào từng giếng của đĩa nuôi cấy mô 6 giếng.Khuẩn lạc đơn của mỗi chủng vi khuẩn (E. coli và S. aureus) được tiêm trong 5 ml LB ở 37°C qua đêm, sau đó 50 µl dịch nuôi cấy đã được thêm vào 5 ml LB ủ 3-4 giờ cho đến khi gí trị OD600 đạt 0.4, sau đó nồng độ vi khuẩn đã được pha loãng đến 1×10 5-2×105 CFU/ml. 500 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn được thêm vào từng giếng và sau đó các đĩa được ủ ở 37°C trong 4 giờ. Sau khi ủ, dịch nuôi cấy trong mỗi giếng đã được trung hòa với 4 ml nước muối đá (0,85%).Trải 50 µl hỗn hợp của mỗi giếng lên đĩa thạch LB và ủ ở 37°C qua đêm.Các khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch được đếm và khả năng kháng khuẩn của mỗi mẫu được tính theo công thức sau đây: Khả năng kháng khuẩn (%) T n h kh thi c a PLLA T nh kh thi c a PLLA/Bmattacin2T nh = í ả ủ - í ả ủ í khả thi của PLLA×100 Mỗi mẫu lặp lại hai lần. Tất cả các dữ liệu thu thập được phân tích bằng OrginPro8 (OriginLab Corporation). Các giá trị được báo cáo dưới dạng trung bình ± SD cho tất cả các kết quả. Như nhuộm vi khuẩn sống/chết, màng quay điện PLLA / attacin2 và màng PLLA (đối chứng âm) được phủ trên đĩa thủy tinh (1 cm2) đã được chuẩn bị. Sau khi khử trùng UV, đĩa thủy tinh với màng được đặt vào giếng của đĩa nuôi cấy mô 24 giếng. Khuẩn lạc đơn của mỗi chủng vi khuẩn (E. coli và S. aureus) được tiêm phòng trong 5ml LB ở 37°C qua đêm, sau đó 50 µl của dịch nuôi cấy đã được thêm vào 5ml LB ủ trong 3-4 giờ cho đến khi giá trị OD 600 đạt 0.4 và sau đó nồng độ vi khuẩn đã được pha loãng đến 1,5×10 8CFU/ml theo tiêu chuẩn McFarland 0.5. 100µl dịch nuôi cấy vi khuẩn được bổ sung vào giữa mỗi đĩa thủy tinh và sau đó các đĩa được nuôi cấy ở 37°C trong 4 giờ. Các vi khuẩn trên màng được nhuộm bởi SYTO 9 và propidium iodide và sau đó được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Các hình thái của vi khuẩn trên màng được quan sát bởi SEM.Để khảo sát về tính tương thích, màng quay điện PLLA / Bmattacin2 và màng PLLA phủ trên đĩa thủy tinh (1 cm2) đã được chuẩn bị. Sau khi khử trùng bằng tia cực tím , đĩa thủy tinh với màng được đặt vào giếng của đĩa nuôi cấy mô24 giếng. Các tế bào HFF-1 đã được cấy trên màng PLLA và PLLA/Bmattacin2 trong đĩa 24 giếng với nồng độ 6×104 tế bào/cm2 và sau đó được ủ ở 37°C trong 4 giờ để cho tế bào liên kết. 1ml môi trường tang sinh đã được thêm vào mỗi giếng và sau đó ủ toàn bộ trong 1d, 3d và 7d. Sau khi ủ, khảo sát MTS, nhuộm sống/chết, nhuộm nội bào và hình thái bề mặt của các tế bào trên màng được đánh giá bằng các phương pháp tương tự nêu tại sự đánh giá hoạt động chống tế bào ung thư. Tài liệu tham khảo: Application of silkworm (Bombyx mori) functional genes in fabricating scaffolds for tissue engineering and regenerative medicine - Li, Zhi - The Hong Kong Polytechnic University Dựa trên cơ sở dữ liệu được công bố, tằm có 41 gen AMP ứng với bảy họ (attacin, cecropin, defensin enbocin, lebocin, moricin, và gloverin), một số gen được phân tích và nhân bản gồm attacin2, cecropinB1, defensinA, enbocin1, lebocin3, moricinA1, và gloverinB. Để có AMPs tái tổ hợp, ba hệ thống biểu hiện dị loại, liên quan đến nấm men, Escherichia coli, và các hệ thống tế bào côn trùng đã được sử dụng. Hai gen AMP, attacin2 và cecropinB1, được sub-cloned - tái tạo dòng vào vector pET-28a (+) phân lập và được chuyển vào tế bào chủ BL21. Thông qua biểu hiện cảm ứng bằng IPTG, tái tổ hợp protein attacin2 (Bmattacin2) đã được phát hiện bởi SDS-PAGE, và sau đó nó đã được xác nhận bằng Western blot. Các đặc tính của tái tổ hợp Bmattacin2 là một AMP giàu glycine hòa và tỷ lệ helix cao (25%) cấu trúc thứ cấp liên quan đến hoạt động kháng khuẩn. Các thử nghiệm cho thấy đa số Bmattacin2 bị degraded giảm bớt sau khi ngâm ba ngày trong đệm PBS. Mặc dù các dung môi hữu cơ đã được chứng minh có tác động tiêu cực đến chức năng Bmattacin2 của một mức độ nào, Bmattacin2 vẫn chứng minh hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn E.coli và Siaureus, chỉ ra rằng Bmattacin2 có thể được sử dụng để làm fibrous scaffolds - giàn giáo xơ cùng với các loại polyme tổng hợp như PLLA bằng mạ điện. Nghiên cứu cho thấy, Sự biểu hiện Bmattacin2 cao nhất (42.7%) tại OD6oo = 0,2 ứng với 0,2 mM IPTG trong 1 giờ, tương đương khoảng 3.0mg / L. Bmattacin2 tinh khiết được chuẩn bị làm màng nano-nanomembrane cùng với PLLA bằng mạ điện. Bmattacin2 trong màng nanofibrous là 2%.