Tài liệu Luận văn xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng hiv trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LỜI CẢM ƠN Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri đã tận tình hướng dẫn khoa học, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau Đại học của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, anh chị trong Bộ môn Hóa Phân tích- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Bộ môn Hóa Phân tích & Độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm thực nghiệm. Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian qua. Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV....................................................................3 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay...................6 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV..............................................7 1.3.1.Các phương pháp sắc ký 7 1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 8 1.4. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản...........................................9 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản.......................................9 1.4.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản...........................................10 1.4.3. Các quá trình xảy ra trong mao quản.......................................................11 1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản...12 1.4.5. Điện di mao quản vùng (CZE).................................................................12 1.4.6. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)......13 1.4.7. Phân tích định lượng theo điện di mao quản............................................23 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................24 2.1.1. Điều kiện nghiên cứu.............................................................................24 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................25 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu...............................................................26 2.2.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................26 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................26 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................29 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT...........................29 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất ..............................................................29 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản ................................................................31 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu..................................................................32 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng.........................................................33 3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách..............................................................................34 3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di.............................................36 3.1.7. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm.............................................39 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS...........................39 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm....................................................41 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu...............................................43 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di.............................................................45 3.1.12. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản ........................................46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu ......................................................................47 3.1.14. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập.............47 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích........................................................................50 3.2.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống.........................................................50 3.2.2 Tính đặc hiệu............................................................................................50 3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn....................................52 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).............................56 3.2.5. Độ lặp lại của phương pháp....................................................................57 3.2.6. Độ đúng của phương pháp..............................................................................58 3.2.7. Kết quả định lượng trong chế phẩm.............................................................. 61 3.3. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)...............................................................................................................................63 3.4. Hướng phát triển của đề tài.................................................................................64 KẾT LUẬN...............................................................................................................65 DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC 19 3.1 Tổng kết các điều kiện điện di tối ưu 47 3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng 52 3.4 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng 54 3.5 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng 55 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 57 Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng 3TC Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng AZT Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng NVP Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn 3TC Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn AZT Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn NVP 57 3.13 Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N 61 3.14 Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 62 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 58 58 59 60 60 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách các chất trong CZE 13 1.3 Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC 15 1.4 Cấu trúc không gian của β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP 31 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC 35 3.3 Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17. 37 3.4 Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM 40 3.5 Điện di đồ tại nồng độ đệm 5mM; 10mM và 20mM 42 3.6 Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s 44 3.7 Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV 46 3.8 Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ưu 48 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm 3TC tại điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm AZT tại điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi thêm NVP tại điều kiện tối ưu 48 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP 51 3.9 3.10 3.11 3.12 49 49 49 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP 51 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP thêm hỗn hợp chuẩn Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ 3TC Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ AZT Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng độ NVP 52 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb-N 62 3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 63 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 53 54 55 DANH MỤC VIẾT TẮT ARV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human Immunodeficiency Virus) Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (Acquired immunodeficiency syndrome) Thuốc kháng virut USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) HIV AIDS CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Spic Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow) Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic chromatography) Diện tích pic tm Thời gian di chuyển (Migration times) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) HPLC MEKC RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine MỞ ĐẦU Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh. Đến tháng 12/2008 ước tính khoảng 4 triệu người nhiễm HIV ở các nước có thu nhập thấp và trung bình được điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết do AIDS đã giảm 10% [12]. HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh,...). Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người HIV/AIDS. Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trước đây nước ta chưa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trường hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia được cấp [12] Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV. Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa lý đa số được sử dụng để định lượng các loại thuốc. Ưu điểm của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã 1 được tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây ô nhiễm môi trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phương pháp định lượng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15]. CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều ưu điểm vượt trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu về Dược. Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã được quy định trong Dược điển một số nước như Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chưa được ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc ở nước ta. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản”. 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleosides (nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine (DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir disoproxil fumarate. Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleosides (nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine, Effavirenz. Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir . Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao. Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm3 lên 1547/mm3), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm 3. Liệu pháp này cũng có thể dùng cho những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12]. 3 Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm. 150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho người cân nặng dưới 60kg với người lớn và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B * Lamivudin: (3TC) Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lượng 229,3. Tên khoa học: 4amino-1[2(hydroxymethyl)1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C. Dễ tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan trong các dung môi hữu cơ. Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % trong methanol ) Hằng số pKa= 3,31. Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A1%1cm trong H+ 1M ~ 600 abs 4 Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 150mg là khoảng 1,5μg/ml. *Zidovudin: (AZT) Công thức phân tử C10H13N5O4 . Phân tử lượng 267.242 g/mol. Tên khoa học: 1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5(hydroxymethyl) oxolan2-yl]-5methylpyrimidine-2,4-dione Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu. Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn . Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pKa= 9,36 Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hưởng khi ăn nhiều chất béo. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml. *Nevirapin (NVP) 5 Công thức phân tử C15H14N4O. Phân tử lượng 266.888 g/mol. Tên khoa học: 11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6- one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, ít tan trong CH3Cl. Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pKa= 2,42. Sau khi uống Nevirapin khoảng 4 giờ, sinh khả dụng > 90%, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid. Đạt Tmax khoảng 4h sau khi dùng liều duy nhất. 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có 62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng người nhiễm HIV đang điều trị. Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV đang điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10]. Tốc độ tăng trưởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh nhân/tháng. Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là 2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác. - Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” được ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐBYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã ban hành các văn bản hướng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa phương với các nội dung chính như sau: - Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV 6 hoặc TDF/3TC/NVP. Không sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV. - Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013. Thuốc d4T chủ yếu được chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT. Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối toàn bộ các nguồn thuốc ARV do các chương trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị cho bệnh nhân trên toàn quốc. Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cường sự tuân thủ điều trị ở người bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV ngày uống 1 lần.[10] Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS. So sánh với năm 1999, số người nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009 đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận Saharan, Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so sánh giữa năm 1999 và 2009[11]. 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1.3.1. Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… 7 Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là 20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26] Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F 254 và định lượng các chất ở bước song hấp thụ 265nm. Hệ số lưu giữ của Stavudine, Lamivudine và Nevirapine lần lượt là 0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26] Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước : axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực. [21] 1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2propanol. Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s. Tất cả các chất 8 được tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r 2= 0,9996) cho 3TC; 5-50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r2= 0,9987) cho NVP[24] Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25 0C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm… Về định lượng lamivudin trong chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể phân tích đồng thời lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm, dung dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9] Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng thời lamivudine và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách, chẳng hạn như pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã được tối ưu hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium và 15 mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile (ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p-aminobenzoic acid (PABA) đã được sử dụng như là chất chuẩn nội (IS). Phát hiện chất phân tích và IS được thực hiện ở bước sóng 210 nm. Điện di đồ đã được quan sát thấy rằng cả hai loại thuốc và IS đã được di chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV. Đánh giá của phương pháp này đã được thực hiện về tính chính xác, độ tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ). Khoảng tuyến tính từ 10-80 mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho Zidovudine. Các giới hạn phát hiện cho Lamivudine và Zidovudine được tìm thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tương ứng. Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và Zidovudine trong huyết tương. Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên 9 thuốc và trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25] 1.4. Giới thiê êu chung về phương pháp Điê ên di mao quản 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng N ef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm). 1.4.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính như sau: 1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt). 2. Cột tách (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản), 3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di của các chất. 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách). 5. Bô ô phâ ôn phát hiê ôn các chất sau khi tách (detector). 6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản. 10 7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu. Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 2.1 Hình 1.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 1.4.3 . Các quá trình xảy ra trong mao quản Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là: 1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản. 2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 A). 3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu EOF. 4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản. 5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển. 6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC). 7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên. 8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh. 11 9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất. Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất. Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế, muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được hiệu quả tách cao. 1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là: 1. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE) 2. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-Kenetic:MEK hay MCEK). 3. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), 4. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF). 5. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP). 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophiresis- CZE) là phương pháp phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE vì đơn giản, linh hoạt và dễ thao tác. Phương pháp này có phạm vi ứng dụng rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất 12