Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Luan văn tốt nghiệp.nọp...

Tài liệu Luan văn tốt nghiệp.nọp

.DOC
63
383
92

Mô tả:

Tinh sạch enzym chitosanza từ Penicillium oxalicum
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng Penicillium oxalicum Currie and Thom. Sinh viên: Lê thị Ngọc Bích Lớp: Tp1 K48 GVHD: TS Lê Thanh Hà Hà Nội 5 – 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc TRƯỜNG ĐẠIHỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------- ----------------------- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Lê Thị Ngọc Bích………… Số hiệu sinh viên: 2003C125 Khóa: 48……… Viện: Công Nghệ Sinh Học  Công Nghệ Thực Phẩm Nghành: Công Nghệ Các Sản Phẩm Lên Men 1. Đề tài nghiên cứu: Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng Penicillium oxalicum Currie and Thom 2. Nội dung chính của đề tài:  - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym .  Qui trình tinh sạch enzym chitosanase  Khảo sát đặc tính của enzym chitosanza ( nhiệt độ, pH,…) 3. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Thanh Hà 4. Ngày giao nhiệm vụ làm luận văn: 14 / 12 / 2007 5. Ngày hoàn thành luận văn: 27 / 5 / 2008 Trưởng Bộ môn: ( Ký, ghi rõ họ, tên) Ngày……Tháng..….Năm 2008 Cán bộ hướng dẫn ( Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành và nộp luận văn tốt nghiệp ngày…. tháng….năm 2008 Người duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Lời Cảm Ơn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học-Công Nghệ Thực Phẩm và bộ môn Công Nghệ Lên Men đã tạo mọi điều kiện để cho em học tập và nghiên cứu đề tài trong suốt quá trình học tập. Với tất cả lòng chân thành em xin cảm ơn TS. Lê Thanh Hà đã định hướng và hướng dẫn tận tình giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng em xin cảm ơn người thân và bạn bè đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đề tài. Em Xin Chân Thành Cảm Ơn ! Sinh viên: Lê Thị Ngọc Bích Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 2 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Abstract Chitosanase (EC 3.2.1.132) is extracellular enzyme hydrolyzing 1,4- linked D-glucosamine of acelated chitosan into chitosan-oligosaccharides. Enzym chitosanase was produced from Penicillium oxalicum currie and Thom. It was cultured in MS-Chitosan medium at pH=7, 300C for 4 days on a rotary shaker at 170 rpm. The crude enzym from Penicillium oxalicum currie and Thom was removed from biomass by filtration. The filtrate was fractionated by the addition of solid (NH4)2SO4 between 60-85% saturation. The fractionated chitosanase reached productivity of 50.99% and purification fold of 5,5. Then amonium sulfate purified chitosanase was fractionated by filtration cut-off into three fraction <10kDa, 10-50 kDa, >50kDa. The effect of pH and temperature on the chitosanase activity in each fraction was investigated. Finally first step of chitosanase purification on Mono Q column was tested. Tóm Tắt Luận Văn Enzym Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết -1,4 D-Glucosamine trong phân tử acetylated chitosan tạo sản phẩm là các chitosan oligosaccharides. Enzym chitosanase được thu nhận từ Penicillium oxalicum currie and Thom. ở điều kiện môi trường nuôi cấy pH=7, 300C, 170 vòng/phút, trong 4 ngày ở môi trường MS-Chitosan. Dịch enzym thu được sau khi loại bỏ phần sinh khối được kết tủa phân đoạn bằng muối amoni sulphat bão hoà 60- 85% và đạt hiệu suất thu hồi 50,99% và độ tinh sạch 5,5 lần. Tinh sạch enzym bằng phương pháp lọc cut-off thu được 3 phân đoạn <10kDa , 10-50 kDa, 50kDa và xác định đặc tính enzym trong từng phân đoạn như nhiệt độ hoạt động, khoảng pH. Bước đầu khảo sát tinh sạch enzym chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột Mono Q. Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 3 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Mục Lục. Abstract.......................................................................................................4 Lời Mở Đầu.......................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN....................................................................................3 I.1. Giới Thiệu Chung Về Enzym.....................................................................3 I.1.1. Sơ lược lịch sử của enzym [2, 3]......................................................................3 I.1.2 Cấu Trúc của enzym............................................................................................4 I.1.3 Tính đặc hiệu của enzym....................................................................................4 I.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym [3]................................6 I.2 Tách Và Tinh Chế Enzym [2].....................................................................7 I.2.1. Các dạng chế phẩm enzym ...............................................................................7 I.2.1.1.Chế phẩm enzym thô[2]...............................................................................7 I.2.1.2 Chế phẩm kỹ thuật.......................................................................................8 I.2.1.3 Chế phẩm enzym tinh khiết..........................................................................8 I.2.2 Tách và tinh chế enzym[2].................................................................................8 I.2.2.1 Kết tủa phân đoạn enzym [2].......................................................................8 I.2.2.2 Sắc Ký [1,2].................................................................................................9 I.3 Tình Hình Sản Xuất Và Ứng Dụng Enzym.............................................10 I.3.1. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới. [2.3]........................10 I.3.2. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam....................................11 I.4 Enzym Chitosanase....................................................................................11 I.4.1. Giới thiệu về enzym chitosanase....................................................................11 I.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.................13 I.4.2.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ...................13 1.4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ..........14 I.4.2.3 Ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng..............................................14 I.5 Khả năng ứng dụng của chitosanase .......................................................15 I.5.1. Ứng dụng của chitosan oligosaccharide trong y học [29,35,36]................15 I.5.2 Ứng dụng trong thực phẩm..............................................................................16 I.5.3 Ứng dụng trong ngành nông nghiệp [15,23,35]............................................16 I.5.4 Ứng dụng trong xử lý nước thải [5,6,23]........................................................16 I.5.5 Chitosan oligosaccharide là chất dinh dưỡng [15,21]..................................17 I.5.6 Ứng dụng trong mỹ phẩm.................................................................................17 I.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym chitosanase........17 PH ẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................20 Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm 2.1 Vật Liệu Và Thiết Bị Nghiên Cứu............................................................20 2.1.1 Nguyên Liệu......................................................................................................20 2.1.1.1 Chủng vi sinh vật.......................................................................................20 2.1.1.2 Môi trường................................................................................................20 2.1.2 Hoá chất.............................................................................................................21 2.1.3 Thiết bị...............................................................................................................22 2.2 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................22 2.2.1 Phương pháp vi sinh.........................................................................................22 2.2.2. Phương pháp hoá sinh.....................................................................................22 2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanase........................................................22 2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford [1].......................24 2.2.3 Tách enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ muối amoni sulphat[2].........26 2.2.4 Phân đoạn enzym bằng phương pháp lọc cut-off.........................................26 2.2.5 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên FPLC................................................26 2.2.6 Phương pháp cô đặc protein............................................................................27 Cách tiến hành...............................................................................................28 2.2.7 Kiểm tra độ tinh sạch của enzym bằng phương pháp điện di. [1,2]...........28 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................32 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh tổng hợp chitosanase 32 3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ.............................................................................32 3.1.2 Ảnh hưởng của pH.....................................................................................33 3.1.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon...................................................................33 3.1.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ........................................................................34 3.2 Khảo sát thu nhận chitosanase bằng kết tủa muối amoni sulphat.......36 3.3 Kết tủa phân đoạn enzym chitosanase bằng muối amoni sulphat bão hoà............................................................................................................. 37 3.4 Phân đoạn dịch enzym chitosanase bằng phương pháp màng lọc cutoff..............................................................................................................40 3.4.1 Xác định đặc tính enzym trong từng phân đoạn..........................................41 3.4.1.1 Ảnh hưởng của pH........................................................................................41 3.4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ...............................................................................43 3.3 Tinh sạch enzym bằng FPLC..................................................................45 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................47 4.1 KẾT LUẬN................................................................................................47 4.2 KIẾN NGHỊ...............................................................................................47 Tài Liệu Tham Khảo........................................................................................48 Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm CÁC CHỮ VIẾT TẮT. CMC : Cacbonxymethylcellulose Da: Dalton GlcN: N- glucosamine GlcNAc: N- acetylglucosamine KDa: kilo dalton SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-Polyacylanimide gel electrophoresis Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Lời Mở Đầu. Trong một vài thập kỷ trở lại đây, cùng với việc phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc nghiên cứu các ứng dụng của enzym ngày càng được quan tâm và chú trọng. Công nghệ enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao chất lượng của một số quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế… Hàng năm lượng enzym được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên 300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và được phân bố trên các lĩnh vực khác nhau. Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzym mới, và nghiên cứu các đặc điểm, tính chất, ứng dụng của nó luôn là mục tiêu của các nhà khoa học. Một trong số các enzyme đó là enzyme chitosanase. Chitosanza là một enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết trong nội phân tử cơ chất chitosan. Enzym chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosanoligosaccharides Chitosan-oligosaccharides có nhiều ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hòa tan trong nước mà chitooligosaccharide được ứng dụng trong y học và dược phẩm: Chitosan oligosaccharides giúp kích thích tiêu hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, giảm cholesterol huyết tương, giúp giảm cân và ngăn chặn các căn bệnh ở người trưởng thành, ngăn ngừa các bệnh về gan nhờ sự tạo thành kháng thể nhanh trong gan và lá lách, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, làm giảm chất béo trong máu, ức chế sự phát triển của E.coli, phòng chống hữu hiệu các bệnh về đường tiêu hoá…[5,7,12,21] Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng to lớn của chitosan oligosaccharides đặc biệt trong y học và trong dược phẩm ,em đã thực hiện đề tài: “ Tinh sạch và xác định đặc tính của chitosanase sinh tổng hợp từ Penicillium oxalicum Currie and Thom”. Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 1 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Mục tiêu của đề tài là  Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym .  Qui trình tinh sạch enzym chitosanase  Khảo sát đặc tính của enzym chitosanza ( nhiệt độ, pH,…) Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 2 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm PHẦN I: TỔNG QUAN. I.1. Giới Thiệu Chung Về Enzym I.1.1. Sơ lược lịch sử của enzym [2, 3]. Enzym hay còn gọi là fecmen là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein. Ngay từ đầu thế kỷ 18, sự tiêu hoá của thịt bởi dịch vị dạ dày và sự chuyển hoá của tinh bột thành đường đã được phát hiện. Nghiên cứu sự lên men của đường thành rượu nhờ nấm men, Louis Pasteur đã đưa ra kết luận sự lên men này được xúc tác bởi một chất trong mấn men, và người ta nghĩ rằng chỉ khi vi sinh vật sống chức năng xúc tác của chất này mới thực hiện.Tuy nhiên, vào năm 1897, hai nhà khoa học là Hans và Eduard Bucher đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm men ( không có mặt tế bào nấm men sống ) cho các mục đích y học, và với mục đích bảo quản, họ đã bổ sung một lượng lớn đường sucrose vào dịch chiết nấm men. Một cách tình cờ và ngạc nhiên, họ đã phát hiện ra lượng đường này đã bị lên men mà không cần sự có mặt của tế bào nấm men sống. Thuật ngữ “enzym” ra đời từ đó và được sử dụng để miêu tả “chất” trong dịch chiết tách nấm men đã làm chuyển hoá đường. Enzym là chất quan trọng để duy trì sự sống bởi vì hầu hết các phản ứng chuyển hoá quan trọng trong tế bào sinh học đều do enzym xúc tác chuyển hoá. Bất kỳ sự trục trặc nào của enzym như đột biến, tạo thừa hoặc thiếu sản phẩm… đều dẫn đến bệnh tật nghiêm trọng. Enzym có cường lực xúc tác rất lớn, ở điều kiện phản ứng thích hợp enzym có thể xúc tác phản ứng xảy ra nhanh gấp 1010 lần phản ứng không có chất xúc tác hay các chất xúc tác hoá học khác. Ví dụ trong phản ứng H 2O2 1/2 O2 + H2O nếu chỉ có Fe3+ thì phản ứng xảy ra yếu 1 mol Fe 3+ xúc tác phân ly 10-6 mol H2O2/phút, nhưng nếu có thêm enzym catalaza thì vận tốc phản ứng tăng hàng triệu lần 5.106mol H2O2/phút. Hơn nữa enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao nghĩa là mỗi enzym chỉ xúc tác làm chuyển hoá một cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định mà không tạo thành những sản phẩm phụ. [3] Hiện nay trên thế giới lượng enzym sản xuất ra khoảng 300.000 nghìn tấn và có khoảng 5000 enzym đã được biết đến. Để đặt tên cho enzym thông thường người ta thêm đuôi –aza(ase) và cơ chất đặc hiệu mà enzym đó có thể chuyển hóa cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác. [2,3] Ví dụ enzym Hydrolaza enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân. [2] Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 3 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm I.1.2 Cấu Trúc của enzym Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein nên có cấu trúc tương tự protein. Một enzym có thể là một protein monomer, chứa đựng một chuỗi polypeptit duy nhất được tạo bởi hàng trăm axit amin; cũng có thể là một chuỗi các protein oligomer bao gồm nhiều chuỗi polypeptit, giống hệt hoặc khác nhau và hoạt động cùng nhau. [3] Phần lớn các enzym có phân tử lượng lớn hơn cơ chất mà chúng tác động và chỉ khoảng một phần nhỏ của enzym khoảng 10 axit amin trực tiếp tiếp xúc với cơ chất. Những phần liên kết giữa cơ chất và phản ứng xảy ra được biết đến như trung tâm hoạt động của enzym. Một vài enzym chứa thêm các phần liên kết khác. Một số khác lại có vùng liên kết cho một cofactor cần thiết cho việc xúc tác [3] Hình 1.1 Trung tâm hoạt động của một enzym Chuỗi axit amin của enzym liên quan đến hoạt lực cũng như vùng liên kết của enzym, hoặc chúng cần thiết cho việc tạo cấu trúc 3D của protein. I.1.3 Tính đặc hiệu của enzym Enzym có tính đặc hiệu cao, đây là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzym với các chất xúc tác khác. Mỗi enzym chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Enzym có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra các sản phẩm phụ. Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 4 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm  Những kiểu đặc hiệu cơ bản của enzym [2,3] Đặc hiệu kiểu phản ứng. Đặc hiệu này thể hiện enzym chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng nhất định. Ví dụ phản ứng oxy hóa khử, phản ứng thuỷ phân, phản ứng đồng phân hoá… Đặc hiệu cơ chất. Ta biết cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzym. Enzym chỉ có thể tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như không tác dụng lên một cơ chất nào khác ( tính đặc hiệu tuyệt đối). Ví dụ ureaza chỉ tác dụng với ure. Hay enzym có khả năng tác dụng lên môt kiểu liên kết hoá học nhất định trong phân tử cơ chất (tính đặc hiệu tương đối). Ví dụ lipaza có khả năng thủy phân tất cả các mối liên kết este. Enzym còn có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hoá học nhất định khi một trong hai thành phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo nhất định (đặc hiệu kiểu nhóm) như cacboxypeptidaza có khả năng phân cắt liên kết peptit gần nhóm cacboxly tự do… Tính đặc hiệu của enzym đã được Emil Fischer đề cập đến vào năm 1890. Ông đã cho rằng enzym có một hình dạng đặc biệt mà cơ chất có thể phù hợp một cách hoàn toàn chính xác như “ chìa khoá và ổ khoá” [3] Hình 1.2 Mô hình “chìa khoá và ổ khoá” của Emil Fischer. Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 5 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Đến năm 1958, Daniel Koshland đã bổ sung thêm về giả thiết “chìa khoá và ổ khoá”. Theo ông, enzym có cấu trúc linh hoạt hơn. Trung tâm hoạt động của enzym thay đổi khi cơ chất tương tác với enzym thay đổi. Những chuỗi axit amin làm nên trung tâm hoạt động của enzym để thực hiện một chức năng xúc tác có một khuôn chính xác khi enzym tương tác với cơ chất, các nhóm chức ở trung tâm hoạt động của enzym thay đổi vị trí trong không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất, gọi là khớp cảm ứng Hình 1.3 Mô hình của Emil Fischer(A) Mô hình khớp phản ứng của Daniel Koshland(B) I.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym [3] Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH của môi trường, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym các ion kim loại và các chất vô cơ, hữu cơ….  Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ[2,3] Mỗi enzym có khoảng nhiệt độ và pH tối thích. Tức là ở nhiệt độ đó thì enzym hoạt động mạnh nhất, vận tốc phản ứng đạt cao nhất. Nếu nhiệt độ cao quá hay quá kiềm, quá axit làm vô hoạt enzym phản ứng không xảy ra. Mỗi enzym khác nhau có khoảng nhiệt độ và pH tối thích khác nhau.  Ảnh hưởng của nồng độ enzym . [3] Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 6 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym. Nếu nồng độ enzym tăng vận tốc phản ứng tăng nhưng nếu nồng độ enzym quá lớn thì vận tốc phản ứng tăng chậm  Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [2,3] Theo công bố của Leonon Michaelis và Maud Menten công bố năm 1913 đã đưa ra mô hình giải thích tính chất động học của phản ứng enzym và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ với vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và đưa ra kết luận: Khi vận tốc đạt đến cực đại sẽ không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất như vậy khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn đến mức nào đó nếu tiếp tục tăng cơ chất thì vận tốc phản ứng không tăng. Điều này thể hiện thông qua hắng số MichaelisMenten (Km). Mỗi enzym có một hằng số Km riêng cho mỗi cơ chất, đặc trưng cho ái lực của enzym đối với cơ chất.  Ảnh hưởng của chất kìm hãm đối với enzym Hoạt độ của enzym có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzym gọi là các chất kìm hãm. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, thậm chí cả các protein. Người ta phân ra làm nhiều loại kìm hãm như: kìm hãm cạnh tranh, kìm hãm không cạnh tranh, phi cạnh tranh hay cạnh tranh cục bộ, nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym. [3] I.2 Tách Và Tinh Chế Enzym [2] I.2.1. Các dạng chế phẩm enzym . Trong thực tế sản xuất các chế phẩm enzym có thể sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau tuỳ theo mục đích và yêu cầu sử dụng như: Chế phẩm thô có thể sử dụng trong một số lĩnh vực mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng, màu sắc, mùi vị của sản phẩm như công nghệ sản xuất cồn, công nghệ xử lý nước thải…Chế phẩm enzym kỹ thuật thường được sử dụng trong thực phẩm để giữ màu sắc, hương vị và chất lượng của sản phẩm. Còn trong y học và dùng trong phân tích cũng như khoa học thì người ta sử dụng chế phẩm enzym tinh khiết I.2.1.1.Chế phẩm enzym thô[2]  Chế phẩm thô từ canh trường lỏng Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 7 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Môi trường vi sinh vật sau khi lọc nồng độ enzym rất thấp, nên bước đầu ta phải cô đặc. Dịch lọc thường được cô đặc trong thiết bị chân không và được bổ sung một số chất bảo quản, thời gian bảo quản từ 1-2 năm. Hoặc có thể bổ sung thêm các chất ổn định có nồng độ chất khô 30-40 g/l. Sau đó sấy phun ở thiết bị có nhiệt độ dịch đầu vào là 1200C và đầu ra là 400C sẽ thu được chế phẩm dạng bột.  Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt. Canh trường rắn sau khi nuôi cấy được đem sấy ở nhiệt độ 400C đến độ ẩm còn khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm dạng thô. Chế phẩm thu có thể sử dụng trong một số lĩnh vực mà không làm ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị và chất lượng sản phẩm như: Công nghệ thuộc da, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất rượu cồn, xử lý nước thải…. I.2.1.2 Chế phẩm kỹ thuật Là chế phẩm đã được tách sơ bộ, trong đó một số protein và enzym tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường có một vài enzym chủ yếu. Và chế phẩm này thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để giữ màu sắc, mùi vị, hương thơm và chất lượng của sản phẩm. I.2.1.3 Chế phẩm enzym tinh khiết Trong chế phẩm loại này đã loại hoàn toàn các protein và enzym tạp chỉ có duy nhất một enzym mong muốn. Các chế phẩm loại này chỉ ứng dụng trong y học, nghiên cứu khoa học, và phân tích. I.2.2 Tách và tinh chế enzym[2] Tuỳ vào mục đích sử dụng mà người ta tinh sạch enzym ở các mức độ khác nhau. Để có được enzym thuần khiết hơn người ta tiến hành tinh chế enzym từ chế phẩm enzym thô. Có nhiều phương pháp tinh chế:  Phương pháp kết tủa dựa trên tính hoà tan  Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên độ tinh sạch của enzym Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 8 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm  Phương pháp lọc gel dựa vào khối lượng phân tử, kích thước enzym  Phương pháp sắc ký ái lực dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu của enzym Hiện nay việc tách tinh chế enzym được tiến hành dựa trên sự kết hợp nhiều phương pháp. I.2.2.1 Kết tủa phân đoạn enzym [2] Dịch enzym thô thu được, ngoài enzym mong muốn còn chứa nhiều loại enzym, protein không hoạt động và các tạp chất khác. Do đó muốn thu được enzym kỹ thuật hoặc enzym tinh khiết ta phải loại bỏ các enzym và protein tạp này. Để tách và tinh chế enzym thì cần làm cho các phân tử protein enzym kết hợp với nhau tạo ra kết tủa. Một số phương pháp kết tủa thường dùng là:  Kết tủa đẳng điện: Một protein hay một protein enzym thường hoà tan ít nhất ở điểm đẳng điện pI vì ở pI các phân tử protein enzym có tổng điện tích bằng 0, tức là không có lực đẩy tĩnh điện. Do đó các phân tử protein sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa  Kết tủa bằng muối trung tính: Độ hoà tan của một protein tăng cùng với lực ion của môi trường. Tuy nhiên khi lực ion vượt quá một ngưỡng nào đó thì độ hoà tan lại giảm nhanh và protein bị kết tủa. Mỗi protein có một khoảng nồng độ muối mà tại đó enzym bị kết tủa hoàn toàn gọi là khoảng nồng độ muối tích. Muối thường sử dụng để kết tủa là amonisulphat [2]  Kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Khi dung môi hữu cơ trung tính được trộn lẫn với dung dịch có chứa enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, vì vậy làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, làm cho các phân tử này liên hợp với nhau tạo thành kết tủa. Tuỳ mỗi loại enzym, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa mà ta kết tủa enzym thu được ở nồng độ dung môi khác nhau. Các dung môi được sử dụng phổ biến như: etanol, axeton, izopropanol…[2] I.2.2.2 Sắc Ký [1,2] Phép phân tích sắc ký dựa vào sự chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hoà tan được gắn trên pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất lỏng có khả năng phả huỷ dần các tương tác giứa chất hoà tan và pha tính rồi kéo theo chất hoà tan cùng với nó. Tương tác chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 9 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm tương tác kỵ nước, tương tác kiểu dây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu đặc hiệu sinh học. Một trong những phương phân tích hay được sử dụng đó là sắc ký ái lực. Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một enzym với một phân tử khác có tên là phối tử, đã được gắn bằng liên kết đồng hoá trị vào một chất mang không hoà tan chứa trong cột. Khi cho một hỗn hợp protein có chứa enzym cần làm sạch qua thì chỉ có protein cần làm sạch được giữ lại còn tất cả các protein không tương tác được phối tử sẽ bị trôi ra khỏi cột. Sau đó enzym được rửa giải bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong đề tài nghiên cứu của mình em sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ái lực cao áp (FPLC) và đây được coi là biến thể của sắc ký ái lực. I.3 Tình Hình Sản Xuất Và Ứng Dụng Enzym I.3.1. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới. [2.3] Ngày nay, khoa học thế giới đã biết tới khoảng hơn 2000 loại enzym khác nhau và khoảng 20 loại sản xuất ở quy mô lớn. Hàng năm lượng enzym sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bổ trong các lĩnh vực khác nhau. Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất chính với trên 60 nhà cung cấp lớn. Châu Âu với hai hãng sản xuất lớn nhất thế giới là Novo Nordisk và Gist Brocades chiếm trên 60% lượng enzym thị trường. Nhật Bản với chế phẩm enzym khá đa dạng chiếm khoảng 12-15% trên thị trường thế giới. Theo sau là các nước khác như Mỹ, Anh, Pháp Đan Mạch, Thuỵ Điển…Các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu phát triển công nghệ enzym nhưng sản xuất ra chủ yếu dùng cho nhu cầu trong nước. Enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghành công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm chiểm khoảng 70% sản lượng enzym. Người ta sử dụng enzym như là công cụ đê điều chỉnh những khuyết thiếu tự nhiên của nguyên liệu, cũng như cải thiện chất lượng của sản phẩm và làm tăng giá trị của nguyên liệu tự nhiên…Ngoài ứng dụng trong thực phẩm enzym được ứng dụng trong các nghành như: Công nghệ xử lý nước thải, công nghệ dệt, nhuộm. Trong những năm gần đây ứng dụng enzym trong viếc cải tiến các quá trình truyền thống, tăng độ bền độ sáng của giấy trắng trong công nghệ sản xuất bột giấy được tăng lên đáng kể. Một lượng Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 10 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm lớn enzym được sử dụng so với các nghành công nghiệp khác là công nghệ bột giặt và các chất tẩy rửa. Sử dụng enzym để tẩy rửa các chất bẩn có nguồn gốc protein. Ngoài ra enzym còn được bổ sung vào các loại xà phòng tắm, kem bôi mặt dưỡng da, thuốc đánh răng… Gần đây vai trò của enzym trong công nghệ dựơc và y tế đặc biệt được nhắc đến. Các nhà khoa học thường sử dụng những “tín hiệu enzym “ làm chỉ tiêu đánh giá tình trạng cơ thể. Cũng như một số enzym tiêu hoá cũng được nghiên cứu sử dụng góp phần khắc phục tình trạng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và người bệnh… I.3.2. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam. Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng enzym mới được tập trung chú ý trong một vài chục năm gần đây và vẫn chưa có enzym nào đựơc sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hầu hết các kết quả chỉ dừng lại ở phòng thí nghiệm của các Viện nghiên cứu hoặc các trường Đại học. Do đó phần lớn enzym đựơc dùng hiện nay là nhập ngoại. Những chế phẩm enzym sử dụng phần chính mua ở hãng Novo Đan Mạch. Enzym được sử dụng rất rộng rãi hiện nay là các chế phẩm enzym amylase và protease được sử dụng trong công nghệ đồ uống, sản xuất đường, công nghệ dệt. I.4 Enzym Chitosanase I.4.1. Giới thiệu về enzym chitosanase Chitosanase ( EC 3.2.1.132) còn được gọi là chitosan N-acetylglucosaminohydrolaza là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết -1,4 giữa các D-glucosamine trong phân tử acetylated chitosan. [5,6,8,13] Hình 1.4:Công thức cấu tạo của chitosan Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 11 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Enzym chitosanase có thể thuỷ phân các liên kết khác nhau trong phân tử chitosan như: liên kết GlcN-GlcN , GlcN-GlcNAc hoặc GlcN-GlcNAc-GlcNAc nhưng không thuỷ phân liên kết GlcNAc-GlcNAc trong phân tử chitosan khi deacetyl hoá một phần [20] Nguyên tắc của quá trình thuỷ phân chitosan nhờ enzym chitosanase được thể hiện ở hình sau: Hình 1.5 Cơ chế xúc tác của chitosanase lên cơ chất chitosan Chitosanase được tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật khác nhau từ vi khuẩn Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, cổ khuẩn Acinetobacter sp., nấm mốc Aspergillus oryzae đến xạ khuẩn Streptomyces. [5,6,9,13,21,32] Tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật và chủng vi sinh vật cũng như điều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần môi trường mà hoạt lực enzym thu được khác nhau. Nhìn chung, vận tốc sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn cao hơn của nấm mốc nhưng hoạt tính lại thấp hơn. Enzym thu được từ vi sinh vật thường là các enzym chịu nhiệt tốt. Dải nhiệt độ thích hợp cho các enzym hoạt động là 30-650C. Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 12 Luận Văn Tốt Nghiệp Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Đặc tính của chitosanase phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc vi sinh vật sinh tổng hợp ra nó. Chitosanase thu được từ vi khuẩn Bacillus sp. KCTC 0377BP có khối lượng phân tử khoảng 45kDa và pH hoạt động từ 4-8 pH tối ưu 4-6 và nhiệt độ tối ưu 600C. ; từ vi khuẩn Bacillus subtilis IMR-NK1 có khối lượng phân tử khoảng 36kDa và nhiệt độ, pH tối ưu là 450C và pHotp là 4; từ Bacillus sp. là enzym chịu nhiệt có khối lượng phân tử là 29,5kDa. [5,6,9,13,32,34,38] Nói chung enzym chitosanase thường hoạt động trong vùng axit yếu. Khoảng pH thích hợp thường 4-6,5 tuỳ vào nguồn gốc mà nhiệt độ và pH tối thích của enzym khác nhau. [5,7,9,13,32,35,38] Ví dụ: Hình 1.6 Cấu trúc protein 3D của enzym chitosanase thu được từ Streptomyces sp.N174(trái) và Bacillus MH-K1(phải) Trên đây là cấu trúc protein 3D của enzym chitosanase thu được từ Bacillus circulans MH-K1 và Streptomyces sp. N174 được nghiên cứu bởi nhóm Dr.Jon D.Robertus ( trường đại học Texas tại Austin). Hai gốc amino axit được thể hiện màu đỏ trên hình là GLU22 và ASP40 đóng vai trò xúc tác cho phản ứng Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48 Trang 13
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan