Tinh sạch enzym chitosanza từ Penicillium oxalicum
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng
Penicillium oxalicum Currie and Thom.
Sinh viên: Lê thị Ngọc Bích
Lớp:
Tp1 K48
GVHD: TS Lê Thanh Hà
Hà Nội 5 – 2008
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
CỘNG HOÀ XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
TRƯỜNG ĐẠIHỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------
-----------------------
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Lê Thị Ngọc Bích………… Số hiệu sinh viên: 2003C125
Khóa: 48………
Viện: Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm
Nghành: Công Nghệ Các Sản Phẩm Lên Men
1.
Đề tài nghiên cứu:
Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng Penicillium oxalicum
Currie and Thom
2.
Nội dung chính của đề tài:
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzym .
Qui trình tinh sạch enzym chitosanase
Khảo sát đặc tính của enzym chitosanza ( nhiệt độ, pH,…)
3.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Thanh Hà
4.
Ngày giao nhiệm vụ làm luận văn: 14 / 12 / 2007
5.
Ngày hoàn thành luận văn: 27 / 5 / 2008
Trưởng Bộ môn:
( Ký, ghi rõ họ, tên)
Ngày……Tháng..….Năm 2008
Cán bộ hướng dẫn
( Ký, ghi rõ họ, tên)
Sinh viên hoàn thành và nộp luận văn tốt nghiệp ngày…. tháng….năm 2008
Người duyệt
(Ký, ghi rõ họ, tên)
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Lời Cảm Ơn.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban lãnh đạo Viện Công Nghệ
Sinh Học-Công Nghệ Thực Phẩm và bộ môn Công Nghệ Lên Men đã tạo mọi điều
kiện để cho em học tập và nghiên cứu đề tài trong suốt quá trình học tập.
Với tất cả lòng chân thành em xin cảm ơn TS. Lê Thanh Hà đã định hướng
và hướng dẫn tận tình giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin cảm ơn người thân và bạn bè đã giúp đỡ và động viên em
trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đề tài.
Em Xin Chân Thành Cảm Ơn !
Sinh viên: Lê Thị Ngọc Bích
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
2
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Abstract
Chitosanase (EC 3.2.1.132) is extracellular enzyme hydrolyzing 1,4- linked
D-glucosamine of acelated chitosan into chitosan-oligosaccharides.
Enzym chitosanase was produced from Penicillium oxalicum currie and
Thom. It was cultured in MS-Chitosan medium at pH=7, 300C for 4 days on a rotary
shaker at 170 rpm. The crude enzym from Penicillium oxalicum currie and Thom
was removed from biomass by filtration. The filtrate was fractionated by the
addition of solid (NH4)2SO4 between 60-85% saturation. The fractionated
chitosanase reached productivity of 50.99% and purification fold of 5,5. Then
amonium sulfate purified chitosanase was fractionated by filtration cut-off into three
fraction <10kDa, 10-50 kDa, >50kDa. The effect of pH and temperature on the
chitosanase activity in each fraction was investigated. Finally first step of
chitosanase purification on Mono Q column was tested.
Tóm Tắt Luận Văn
Enzym Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết
-1,4 D-Glucosamine trong phân tử acetylated chitosan tạo sản phẩm là các chitosan
oligosaccharides.
Enzym chitosanase được thu nhận từ Penicillium oxalicum currie and Thom.
ở điều kiện môi trường nuôi cấy pH=7, 300C, 170 vòng/phút, trong 4 ngày ở môi
trường MS-Chitosan. Dịch enzym thu được sau khi loại bỏ phần sinh khối được kết
tủa phân đoạn bằng muối amoni sulphat bão hoà 60- 85% và đạt hiệu suất thu hồi
50,99% và độ tinh sạch 5,5 lần. Tinh sạch enzym bằng phương pháp lọc cut-off thu
được 3 phân đoạn <10kDa , 10-50 kDa, 50kDa và xác định đặc tính enzym trong
từng phân đoạn như nhiệt độ hoạt động, khoảng pH. Bước đầu khảo sát tinh sạch
enzym chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột Mono Q.
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
3
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Mục Lục.
Abstract.......................................................................................................4
Lời Mở Đầu.......................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN....................................................................................3
I.1. Giới Thiệu Chung Về Enzym.....................................................................3
I.1.1. Sơ lược lịch sử của enzym [2, 3]......................................................................3
I.1.2 Cấu Trúc của enzym............................................................................................4
I.1.3 Tính đặc hiệu của enzym....................................................................................4
I.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym [3]................................6
I.2 Tách Và Tinh Chế Enzym [2].....................................................................7
I.2.1. Các dạng chế phẩm enzym ...............................................................................7
I.2.1.1.Chế phẩm enzym thô[2]...............................................................................7
I.2.1.2 Chế phẩm kỹ thuật.......................................................................................8
I.2.1.3 Chế phẩm enzym tinh khiết..........................................................................8
I.2.2 Tách và tinh chế enzym[2].................................................................................8
I.2.2.1 Kết tủa phân đoạn enzym [2].......................................................................8
I.2.2.2 Sắc Ký [1,2].................................................................................................9
I.3 Tình Hình Sản Xuất Và Ứng Dụng Enzym.............................................10
I.3.1. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới. [2.3]........................10
I.3.2. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam....................................11
I.4 Enzym Chitosanase....................................................................................11
I.4.1. Giới thiệu về enzym chitosanase....................................................................11
I.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.................13
I.4.2.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ...................13
1.4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ..........14
I.4.2.3 Ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng..............................................14
I.5 Khả năng ứng dụng của chitosanase .......................................................15
I.5.1. Ứng dụng của chitosan oligosaccharide trong y học [29,35,36]................15
I.5.2 Ứng dụng trong thực phẩm..............................................................................16
I.5.3 Ứng dụng trong ngành nông nghiệp [15,23,35]............................................16
I.5.4 Ứng dụng trong xử lý nước thải [5,6,23]........................................................16
I.5.5 Chitosan oligosaccharide là chất dinh dưỡng [15,21]..................................17
I.5.6 Ứng dụng trong mỹ phẩm.................................................................................17
I.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym chitosanase........17
PH ẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................20
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
2.1 Vật Liệu Và Thiết Bị Nghiên Cứu............................................................20
2.1.1 Nguyên Liệu......................................................................................................20
2.1.1.1 Chủng vi sinh vật.......................................................................................20
2.1.1.2 Môi trường................................................................................................20
2.1.2 Hoá chất.............................................................................................................21
2.1.3 Thiết bị...............................................................................................................22
2.2 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................22
2.2.1 Phương pháp vi sinh.........................................................................................22
2.2.2. Phương pháp hoá sinh.....................................................................................22
2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanase........................................................22
2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford [1].......................24
2.2.3 Tách enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ muối amoni sulphat[2].........26
2.2.4 Phân đoạn enzym bằng phương pháp lọc cut-off.........................................26
2.2.5 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên FPLC................................................26
2.2.6 Phương pháp cô đặc protein............................................................................27
Cách tiến hành...............................................................................................28
2.2.7 Kiểm tra độ tinh sạch của enzym bằng phương pháp điện di. [1,2]...........28
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................32
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh tổng hợp chitosanase
32
3.1.1
Ảnh hưởng của nhiệt độ.............................................................................32
3.1.2
Ảnh hưởng của pH.....................................................................................33
3.1.3
Ảnh hưởng của nguồn cacbon...................................................................33
3.1.4
Ảnh hưởng của nguồn nitơ........................................................................34
3.2 Khảo sát thu nhận chitosanase bằng kết tủa muối amoni sulphat.......36
3.3 Kết tủa phân đoạn enzym chitosanase bằng muối amoni sulphat bão
hoà............................................................................................................. 37
3.4 Phân đoạn dịch enzym chitosanase bằng phương pháp màng lọc cutoff..............................................................................................................40
3.4.1 Xác định đặc tính enzym trong từng phân đoạn..........................................41
3.4.1.1 Ảnh hưởng của pH........................................................................................41
3.4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ...............................................................................43
3.3 Tinh sạch enzym bằng FPLC..................................................................45
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................47
4.1 KẾT LUẬN................................................................................................47
4.2 KIẾN NGHỊ...............................................................................................47
Tài Liệu Tham Khảo........................................................................................48
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
CMC :
Cacbonxymethylcellulose
Da:
Dalton
GlcN:
N- glucosamine
GlcNAc:
N- acetylglucosamine
KDa:
kilo dalton
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate-Polyacylanimide gel
electrophoresis
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Lời Mở Đầu.
Trong một vài thập kỷ trở lại đây, cùng với việc phát triển mạnh mẽ của công
nghệ sinh học, việc nghiên cứu các ứng dụng của enzym ngày càng được quan tâm
và chú trọng. Công nghệ enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao chất lượng
của một số quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm cũng như trong nông
nghiệp, dược phẩm, y tế…
Hàng năm lượng enzym được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên
300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và được phân bố trên các lĩnh vực khác
nhau. Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzym mới, và nghiên cứu các
đặc điểm, tính chất, ứng dụng của nó luôn là mục tiêu của các nhà khoa học. Một
trong số các enzyme đó là enzyme chitosanase.
Chitosanza là một enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết trong nội phân tử cơ
chất chitosan. Enzym chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosanoligosaccharides
Chitosan-oligosaccharides có nhiều ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc
tính dễ hòa tan trong nước mà chitooligosaccharide được ứng dụng trong y học và
dược phẩm: Chitosan oligosaccharides giúp kích thích tiêu hoá thức ăn, tăng tính
thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn dịch, ngăn cản sự
phát triển của tế bào ung thư, giảm cholesterol huyết tương, giúp giảm cân và ngăn
chặn các căn bệnh ở người trưởng thành, ngăn ngừa các bệnh về gan nhờ sự tạo
thành kháng thể nhanh trong gan và lá lách, giảm huyết áp và lượng đường trong
máu, làm giảm chất béo trong máu, ức chế sự phát triển của E.coli, phòng chống
hữu hiệu các bệnh về đường tiêu hoá…[5,7,12,21]
Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng to lớn của chitosan oligosaccharides
đặc biệt trong y học và trong dược phẩm ,em đã thực hiện đề tài: “ Tinh sạch và xác
định đặc tính của chitosanase sinh tổng hợp từ Penicillium oxalicum Currie and
Thom”.
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 1
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Mục tiêu của đề tài là
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzym .
Qui trình tinh sạch enzym chitosanase
Khảo sát đặc tính của enzym chitosanza ( nhiệt độ, pH,…)
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 2
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
PHẦN I: TỔNG QUAN.
I.1. Giới Thiệu Chung Về Enzym
I.1.1. Sơ lược lịch sử của enzym [2, 3].
Enzym hay còn gọi là fecmen là những chất xúc tác sinh học có bản chất
protein. Ngay từ đầu thế kỷ 18, sự tiêu hoá của thịt bởi dịch vị dạ dày và sự chuyển
hoá của tinh bột thành đường đã được phát hiện. Nghiên cứu sự lên men của đường
thành rượu nhờ nấm men, Louis Pasteur đã đưa ra kết luận sự lên men này được xúc
tác bởi một chất trong mấn men, và người ta nghĩ rằng chỉ khi vi sinh vật sống chức
năng xúc tác của chất này mới thực hiện.Tuy nhiên, vào năm 1897, hai nhà khoa học
là Hans và Eduard Bucher đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm men ( không có
mặt tế bào nấm men sống ) cho các mục đích y học, và với mục đích bảo quản, họ
đã bổ sung một lượng lớn đường sucrose vào dịch chiết nấm men. Một cách tình cờ
và ngạc nhiên, họ đã phát hiện ra lượng đường này đã bị lên men mà không cần sự
có mặt của tế bào nấm men sống. Thuật ngữ “enzym” ra đời từ đó và được sử dụng
để miêu tả “chất” trong dịch chiết tách nấm men đã làm chuyển hoá đường.
Enzym là chất quan trọng để duy trì sự sống bởi vì hầu hết các phản ứng
chuyển hoá quan trọng trong tế bào sinh học đều do enzym xúc tác chuyển hoá. Bất
kỳ sự trục trặc nào của enzym như đột biến, tạo thừa hoặc thiếu sản phẩm… đều dẫn
đến bệnh tật nghiêm trọng.
Enzym có cường lực xúc tác rất lớn, ở điều kiện phản ứng thích hợp enzym có
thể xúc tác phản ứng xảy ra nhanh gấp 1010 lần phản ứng không có chất xúc tác hay
các chất xúc tác hoá học khác. Ví dụ trong phản ứng H 2O2 1/2 O2 + H2O nếu chỉ
có Fe3+ thì phản ứng xảy ra yếu 1 mol Fe 3+ xúc tác phân ly 10-6 mol H2O2/phút,
nhưng nếu có thêm enzym catalaza thì vận tốc phản ứng tăng hàng triệu lần
5.106mol H2O2/phút. Hơn nữa enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao nghĩa là mỗi
enzym chỉ xúc tác làm chuyển hoá một cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng
nhất định mà không tạo thành những sản phẩm phụ. [3]
Hiện nay trên thế giới lượng enzym sản xuất ra khoảng 300.000 nghìn tấn và
có khoảng 5000 enzym đã được biết đến. Để đặt tên cho enzym thông thường người
ta thêm đuôi –aza(ase) và cơ chất đặc hiệu mà enzym đó có thể chuyển hóa cùng với
tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác. [2,3] Ví dụ enzym Hydrolaza enzym xúc tác
phản ứng thuỷ phân. [2]
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 3
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
I.1.2 Cấu Trúc của enzym
Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein nên có cấu trúc tương tự
protein. Một enzym có thể là một protein monomer, chứa đựng một chuỗi polypeptit
duy nhất được tạo bởi hàng trăm axit amin; cũng có thể là một chuỗi các protein
oligomer bao gồm nhiều chuỗi polypeptit, giống hệt hoặc khác nhau và hoạt động
cùng nhau. [3]
Phần lớn các enzym có phân tử lượng lớn hơn cơ chất mà chúng tác động và
chỉ khoảng một phần nhỏ của enzym khoảng 10 axit amin trực tiếp tiếp xúc với cơ
chất. Những phần liên kết giữa cơ chất và phản ứng xảy ra được biết đến như trung
tâm hoạt động của enzym. Một vài enzym chứa thêm các phần liên kết khác. Một số
khác lại có vùng liên kết cho một cofactor cần thiết cho việc xúc tác [3]
Hình 1.1 Trung tâm hoạt động của một enzym
Chuỗi axit amin của enzym liên quan đến hoạt lực cũng như vùng liên kết của
enzym, hoặc chúng cần thiết cho việc tạo cấu trúc 3D của protein.
I.1.3 Tính đặc hiệu của enzym
Enzym có tính đặc hiệu cao, đây là một trong những khác biệt chủ yếu giữa
enzym với các chất xúc tác khác. Mỗi enzym chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển
hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Enzym có tính
đặc hiệu cao nên không tạo ra các sản phẩm phụ.
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 4
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Những kiểu đặc hiệu cơ bản của enzym [2,3]
Đặc hiệu kiểu phản ứng. Đặc hiệu này thể hiện enzym chỉ có thể xúc tác
cho một trong các kiểu phản ứng nhất định. Ví dụ phản ứng oxy hóa khử, phản ứng
thuỷ phân, phản ứng đồng phân hoá…
Đặc hiệu cơ chất. Ta biết cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung
tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzym. Enzym chỉ có
thể tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như không tác dụng lên một cơ chất
nào khác ( tính đặc hiệu tuyệt đối). Ví dụ ureaza chỉ tác dụng với ure. Hay enzym có
khả năng tác dụng lên môt kiểu liên kết hoá học nhất định trong phân tử cơ chất
(tính đặc hiệu tương đối). Ví dụ lipaza có khả năng thủy phân tất cả các mối liên kết
este. Enzym còn có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hoá học nhất định khi
một trong hai thành phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo nhất định (đặc
hiệu kiểu nhóm) như cacboxypeptidaza có khả năng phân cắt liên kết peptit gần
nhóm cacboxly tự do…
Tính đặc hiệu của enzym đã được Emil Fischer đề cập đến vào năm 1890. Ông
đã cho rằng enzym có một hình dạng đặc biệt mà cơ chất có thể phù hợp một cách
hoàn toàn chính xác như “ chìa khoá và ổ khoá” [3]
Hình 1.2 Mô hình “chìa khoá và ổ khoá” của Emil Fischer.
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 5
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Đến năm 1958, Daniel Koshland đã bổ sung thêm về giả thiết “chìa khoá và ổ
khoá”. Theo ông, enzym có cấu trúc linh hoạt hơn. Trung tâm hoạt động của enzym
thay đổi khi cơ chất tương tác với enzym thay đổi. Những chuỗi axit amin làm nên
trung tâm hoạt động của enzym để thực hiện một chức năng xúc tác có một khuôn
chính xác khi enzym tương tác với cơ chất, các nhóm chức ở trung tâm hoạt động
của enzym thay đổi vị trí trong không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể của
cơ chất, gọi là khớp cảm ứng
Hình 1.3 Mô hình của Emil Fischer(A) Mô hình khớp phản ứng của Daniel
Koshland(B)
I.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym [3]
Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH của
môi trường, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym các ion kim loại và các chất vô cơ,
hữu cơ….
Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ[2,3]
Mỗi enzym có khoảng nhiệt độ và pH tối thích. Tức là ở nhiệt độ đó thì enzym
hoạt động mạnh nhất, vận tốc phản ứng đạt cao nhất. Nếu nhiệt độ cao quá hay quá
kiềm, quá axit làm vô hoạt enzym phản ứng không xảy ra. Mỗi enzym khác nhau có
khoảng nhiệt độ và pH tối thích khác nhau.
Ảnh hưởng của nồng độ enzym . [3]
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 6
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng
độ enzym. Nếu nồng độ enzym tăng vận tốc phản ứng tăng nhưng nếu nồng độ
enzym quá lớn thì vận tốc phản ứng tăng chậm
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [2,3]
Theo công bố của Leonon Michaelis và Maud Menten công bố năm 1913 đã
đưa ra mô hình giải thích tính chất động học của phản ứng enzym và đã lập được
phương trình biểu diễn mối quan hệ với vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và
đưa ra kết luận: Khi vận tốc đạt đến cực đại sẽ không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất
như vậy khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn đến mức nào đó nếu tiếp tục tăng cơ chất thì
vận tốc phản ứng không tăng. Điều này thể hiện thông qua hắng số MichaelisMenten (Km). Mỗi enzym có một hằng số Km riêng cho mỗi cơ chất, đặc trưng cho ái
lực của enzym đối với cơ chất.
Ảnh hưởng của chất kìm hãm đối với enzym
Hoạt độ của enzym có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản
chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzym gọi là các chất kìm hãm.
Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, thậm chí cả các protein.
Người ta phân ra làm nhiều loại kìm hãm như: kìm hãm cạnh tranh, kìm hãm không
cạnh tranh, phi cạnh tranh hay cạnh tranh cục bộ, nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ
so với nồng độ enzym. [3]
I.2 Tách Và Tinh Chế Enzym [2]
I.2.1. Các dạng chế phẩm enzym .
Trong thực tế sản xuất các chế phẩm enzym có thể sử dụng dưới nhiều dạng
khác nhau tuỳ theo mục đích và yêu cầu sử dụng như: Chế phẩm thô có thể sử dụng
trong một số lĩnh vực mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng, màu sắc, mùi vị của
sản phẩm như công nghệ sản xuất cồn, công nghệ xử lý nước thải…Chế phẩm
enzym kỹ thuật thường được sử dụng trong thực phẩm để giữ màu sắc, hương vị và
chất lượng của sản phẩm. Còn trong y học và dùng trong phân tích cũng như khoa
học thì người ta sử dụng chế phẩm enzym tinh khiết
I.2.1.1.Chế phẩm enzym thô[2]
Chế phẩm thô từ canh trường lỏng
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 7
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Môi trường vi sinh vật sau khi lọc nồng độ enzym rất thấp, nên bước đầu ta
phải cô đặc. Dịch lọc thường được cô đặc trong thiết bị chân không và được bổ sung
một số chất bảo quản, thời gian bảo quản từ 1-2 năm. Hoặc có thể bổ sung thêm các
chất ổn định có nồng độ chất khô 30-40 g/l. Sau đó sấy phun ở thiết bị có nhiệt độ
dịch đầu vào là 1200C và đầu ra là 400C sẽ thu được chế phẩm dạng bột.
Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt.
Canh trường rắn sau khi nuôi cấy được đem sấy ở nhiệt độ 400C đến độ ẩm
còn khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm dạng thô. Chế phẩm thu có thể sử dụng
trong một số lĩnh vực mà không làm ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị và chất lượng
sản phẩm như: Công nghệ thuộc da, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất rượu cồn,
xử lý nước thải….
I.2.1.2 Chế phẩm kỹ thuật
Là chế phẩm đã được tách sơ bộ, trong đó một số protein và enzym tạp đã được
tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường có một vài enzym chủ yếu. Và chế phẩm
này thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để giữ màu sắc, mùi vị, hương
thơm và chất lượng của sản phẩm.
I.2.1.3 Chế phẩm enzym tinh khiết
Trong chế phẩm loại này đã loại hoàn toàn các protein và enzym tạp chỉ có duy
nhất một enzym mong muốn. Các chế phẩm loại này chỉ ứng dụng trong y học,
nghiên cứu khoa học, và phân tích.
I.2.2 Tách và tinh chế enzym[2]
Tuỳ vào mục đích sử dụng mà người ta tinh sạch enzym ở các mức độ khác
nhau. Để có được enzym thuần khiết hơn người ta tiến hành tinh chế enzym từ chế
phẩm enzym thô.
Có nhiều phương pháp tinh chế:
Phương pháp kết tủa dựa trên tính hoà tan
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên độ tinh sạch của enzym
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 8
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Phương pháp lọc gel dựa vào khối lượng phân tử, kích thước enzym
Phương pháp sắc ký ái lực dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu của enzym
Hiện nay việc tách tinh chế enzym được tiến hành dựa trên sự kết hợp nhiều
phương pháp.
I.2.2.1 Kết tủa phân đoạn enzym [2]
Dịch enzym thô thu được, ngoài enzym mong muốn còn chứa nhiều loại
enzym, protein không hoạt động và các tạp chất khác. Do đó muốn thu được enzym
kỹ thuật hoặc enzym tinh khiết ta phải loại bỏ các enzym và protein tạp này. Để tách
và tinh chế enzym thì cần làm cho các phân tử protein enzym kết hợp với nhau tạo
ra kết tủa. Một số phương pháp kết tủa thường dùng là:
Kết tủa đẳng điện: Một protein hay một protein enzym thường hoà tan
ít nhất ở điểm đẳng điện pI vì ở pI các phân tử protein enzym có tổng điện tích bằng
0, tức là không có lực đẩy tĩnh điện. Do đó các phân tử protein sẽ kết hợp với nhau
tạo ra kết tủa
Kết tủa bằng muối trung tính: Độ hoà tan của một protein tăng cùng
với lực ion của môi trường. Tuy nhiên khi lực ion vượt quá một ngưỡng nào đó thì
độ hoà tan lại giảm nhanh và protein bị kết tủa. Mỗi protein có một khoảng nồng độ
muối mà tại đó enzym bị kết tủa hoàn toàn gọi là khoảng nồng độ muối tích. Muối
thường sử dụng để kết tủa là amonisulphat [2]
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Khi dung môi hữu cơ trung tính được
trộn lẫn với dung dịch có chứa enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch,
vì vậy làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, làm cho các phân tử này
liên hợp với nhau tạo thành kết tủa. Tuỳ mỗi loại enzym, dung môi hữu cơ và điều
kiện kết tủa mà ta kết tủa enzym thu được ở nồng độ dung môi khác nhau. Các
dung môi được sử dụng phổ biến như: etanol, axeton, izopropanol…[2]
I.2.2.2 Sắc Ký [1,2]
Phép phân tích sắc ký dựa vào sự chuyển khác nhau trong một pha động của
các chất hoà tan được gắn trên pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các
chất có khả năng gắn kết được với các chất lỏng có khả năng phả huỷ dần các tương
tác giứa chất hoà tan và pha tính rồi kéo theo chất hoà tan cùng với nó. Tương tác
chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion),
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 9
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
tương tác kỵ nước, tương tác kiểu dây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu đặc hiệu
sinh học.
Một trong những phương phân tích hay được sử dụng đó là sắc ký ái lực.
Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một
enzym với một phân tử khác có tên là phối tử, đã được gắn bằng liên kết đồng hoá
trị vào một chất mang không hoà tan chứa trong cột. Khi cho một hỗn hợp protein
có chứa enzym cần làm sạch qua thì chỉ có protein cần làm sạch được giữ lại còn tất
cả các protein không tương tác được phối tử sẽ bị trôi ra khỏi cột. Sau đó enzym
được rửa giải bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Trong đề tài nghiên cứu của mình em sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ái lực
cao áp (FPLC) và đây được coi là biến thể của sắc ký ái lực.
I.3 Tình Hình Sản Xuất Và Ứng Dụng Enzym
I.3.1. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới. [2.3]
Ngày nay, khoa học thế giới đã biết tới khoảng hơn 2000 loại enzym khác nhau
và khoảng 20 loại sản xuất ở quy mô lớn. Hàng năm lượng enzym sản xuất trên thế
giới đạt khoảng 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bổ trong các
lĩnh vực khác nhau.
Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất chính với trên 60 nhà
cung cấp lớn. Châu Âu với hai hãng sản xuất lớn nhất thế giới là Novo Nordisk và
Gist Brocades chiếm trên 60% lượng enzym thị trường. Nhật Bản với chế phẩm
enzym khá đa dạng chiếm khoảng 12-15% trên thị trường thế giới. Theo sau là các
nước khác như Mỹ, Anh, Pháp Đan Mạch, Thuỵ Điển…Các nước Đông Âu và
Trung Quốc cũng bắt đầu phát triển công nghệ enzym nhưng sản xuất ra chủ yếu
dùng cho nhu cầu trong nước.
Enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghành công nghiệp, nhất là công
nghiệp thực phẩm chiểm khoảng 70% sản lượng enzym. Người ta sử dụng enzym
như là công cụ đê điều chỉnh những khuyết thiếu tự nhiên của nguyên liệu, cũng
như cải thiện chất lượng của sản phẩm và làm tăng giá trị của nguyên liệu tự
nhiên…Ngoài ứng dụng trong thực phẩm enzym được ứng dụng trong các nghành
như: Công nghệ xử lý nước thải, công nghệ dệt, nhuộm. Trong những năm gần đây
ứng dụng enzym trong viếc cải tiến các quá trình truyền thống, tăng độ bền độ sáng
của giấy trắng trong công nghệ sản xuất bột giấy được tăng lên đáng kể. Một lượng
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 10
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
lớn enzym được sử dụng so với các nghành công nghiệp khác là công nghệ bột giặt
và các chất tẩy rửa. Sử dụng enzym để tẩy rửa các chất bẩn có nguồn gốc protein.
Ngoài ra enzym còn được bổ sung vào các loại xà phòng tắm, kem bôi mặt dưỡng
da, thuốc đánh răng…
Gần đây vai trò của enzym trong công nghệ dựơc và y tế đặc biệt được nhắc
đến. Các nhà khoa học thường sử dụng những “tín hiệu enzym “ làm chỉ tiêu đánh
giá tình trạng cơ thể. Cũng như một số enzym tiêu hoá cũng được nghiên cứu sử
dụng góp phần khắc phục tình trạng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và người
bệnh…
I.3.2. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam.
Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng enzym mới được tập trung chú ý trong
một vài chục năm gần đây và vẫn chưa có enzym nào đựơc sản xuất ở quy mô công
nghiệp. Hầu hết các kết quả chỉ dừng lại ở phòng thí nghiệm của các Viện nghiên
cứu hoặc các trường Đại học. Do đó phần lớn enzym đựơc dùng hiện nay là nhập
ngoại. Những chế phẩm enzym sử dụng phần chính mua ở hãng Novo Đan Mạch.
Enzym được sử dụng rất rộng rãi hiện nay là các chế phẩm enzym amylase và
protease được sử dụng trong công nghệ đồ uống, sản xuất đường, công nghệ dệt.
I.4 Enzym Chitosanase
I.4.1. Giới thiệu về enzym chitosanase
Chitosanase ( EC 3.2.1.132) còn
được
gọi
là
chitosan
N-acetylglucosaminohydrolaza là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết -1,4 giữa
các D-glucosamine trong phân tử acetylated chitosan. [5,6,8,13]
Hình 1.4:Công thức cấu tạo của chitosan
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 11
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Enzym chitosanase có thể thuỷ phân các liên kết khác nhau trong phân tử
chitosan như: liên kết GlcN-GlcN , GlcN-GlcNAc hoặc GlcN-GlcNAc-GlcNAc
nhưng không thuỷ phân liên kết GlcNAc-GlcNAc trong phân tử chitosan khi
deacetyl hoá một phần [20]
Nguyên tắc của quá trình thuỷ phân chitosan nhờ enzym chitosanase được thể
hiện ở hình sau:
Hình 1.5 Cơ chế xúc tác của chitosanase lên cơ chất chitosan
Chitosanase được tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật khác nhau từ vi khuẩn
Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, cổ
khuẩn Acinetobacter sp., nấm mốc Aspergillus oryzae đến xạ khuẩn Streptomyces.
[5,6,9,13,21,32]
Tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật và chủng vi sinh vật cũng như điều kiện môi
trường nuôi cấy, thành phần môi trường mà hoạt lực enzym thu được khác nhau.
Nhìn chung, vận tốc sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn cao hơn của nấm mốc
nhưng hoạt tính lại thấp hơn.
Enzym thu được từ vi sinh vật thường là các enzym chịu nhiệt tốt. Dải nhiệt
độ thích hợp cho các enzym hoạt động là 30-650C.
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 12
Luận Văn Tốt Nghiệp
Viện Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm
Đặc tính của chitosanase phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc vi sinh vật sinh tổng
hợp ra nó. Chitosanase thu được từ vi khuẩn Bacillus sp. KCTC 0377BP có khối
lượng phân tử khoảng 45kDa và pH hoạt động từ 4-8 pH tối ưu 4-6 và nhiệt độ tối
ưu 600C. ; từ vi khuẩn Bacillus subtilis IMR-NK1 có khối lượng phân tử khoảng
36kDa và nhiệt độ, pH tối ưu là 450C và pHotp là 4; từ Bacillus sp. là enzym chịu
nhiệt có khối lượng phân tử là 29,5kDa. [5,6,9,13,32,34,38]
Nói chung enzym chitosanase thường hoạt động trong vùng axit yếu. Khoảng
pH thích hợp thường 4-6,5 tuỳ vào nguồn gốc mà nhiệt độ và pH tối thích của
enzym khác nhau. [5,7,9,13,32,35,38]
Ví dụ:
Hình 1.6 Cấu trúc protein 3D của enzym chitosanase thu được từ
Streptomyces sp.N174(trái) và Bacillus MH-K1(phải)
Trên đây là cấu trúc protein 3D của enzym chitosanase thu được từ Bacillus
circulans MH-K1 và Streptomyces sp. N174 được nghiên cứu bởi nhóm Dr.Jon
D.Robertus ( trường đại học Texas tại Austin). Hai gốc amino axit được thể hiện
màu đỏ trên hình là GLU22 và ASP40 đóng vai trò xúc tác cho phản ứng
Sinh Viên: Lê Thị Ngọc Bích- lên men k48
Trang 13
- Xem thêm -