Tài liệu Luận văn tốt nghiệp khảo sát quy trình xác định hàm lượng ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằngsắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN HÓA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHOXYQUIN TRÊN THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Chuyên ngành: Sư phạm Hóa Học Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thu Thủy CN. La Văn Thái Sinh viên thực hiện: Đặng Thị Xuân Hoa Lớp: Sư phạm Hóa Học K38 MSSV: B1200580 CẦN THƠ - 2016 Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Thời gian làm luận văn tôi đã luôn học tập và tích lũy được nhiều kiến thức, nhiều kinh nghiệm làm hành trang vững chắc giúp tôi bước đi trên con đường sắp tới. Để đạt được những kết quả như ngày hôm nay ngoài nổ lực bản thân; tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè vào những lúc khó khăn. Vì thế tôi xin dành trang đầu tiên này để gửi lời cảm ơn chân thành đến:  Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học đã trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian quý báu tận tình chỉ dạy, quan tâm, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp.  Xin cảm ơn tất cả các quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ nói chung, bộ môn Hóa Khoa Sư Phạm nói riêng đã truyền dạy những kiến thức, kỹ năng quý báu cũng như đã tạo điều kiện cho chúng tôi có được môi trường học tập tốt nhất.  Thầy Hồ Hoàng Việt cố vấn lớp Hóa K38 đã dẫn dắt, định hướng và giúp đỡ tận tình lớp Hóa của chúng tôi trong suốt bốn năm học qua.  Chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để tôi hoàn thành tốt luận văn.  Anh La Văn Thái - trưởng phòng Trung Tâm Phân Tích – Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, chị Võ Thị Thúy An, chị Bùi Thị Quỳnh Hoa và các anh chị trong trung tâm, đặc biệt là anh chị trong phòng sắc ký đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẻ cho tôi những kinh nghiệm bổ ích.  Cuối cùng, cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, yêu thương, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn cũng như chương trình học của mình. Cảm ơn tập thể lớp Hóa K38 đặc biệt là những người bạn đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ mình trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 15 tháng 05, năm 2016 i Luận văn tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ------------........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ hướng dẫn Nguyễn Thị Thu Thủy ii Luận văn tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ------------........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ phản biện iii Luận văn tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ------------........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ phản biện iv Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ................................................................. ii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ................................................................... iii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ....................................................................iv MỤC LỤC ....................................................................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... viii DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................................ix DANH SÁCH BẢNG BIỂU ........................................................................................... x MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài .......................................................................................................... 1 2. Mục đích ...................................................................................................................... 1 3. Mục tiêu ....................................................................................................................... 2 4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 2 5. Giới hạn đề tài ............................................................................................................. 2 6. Các bước thực hiện đề tài ............................................................................................ 2 NỘI DUNG...................................................................................................................... 3 Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT .................................................................................... 3 1.1. CƠ SỞ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .......................................................... 3 1.1.1. Khái niệm ..............................................................................................................3 1.1.2. Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC .............................................3 1.1.3. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................................................7 1.1.3.1. Sắc ký pha thường .............................................................................................. 7 1.1.3.2. Sắc ký trao đổi ion .............................................................................................. 7 1.1.3.3. Sắc ký hấp phụ.................................................................................................... 7 1.1.3.4. Sắc ký pha đảo .................................................................................................... 8 1.1.4. Các cách rửa giải trong HPLC...............................................................................8 1.1.5. Giới thiệu thiết bị HPLC .......................................................................................9 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHẤT BÉO (LIPIT) VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA ETHOXYQUIN ............................................................................................................. 16 v Luận văn tốt nghiệp 1.3. TÌM HIỂU CHUNG VỀ ETHOXYQUIN ............................................................. 17 1.3.1. Công thức phân tử, công thức cấu tạo và một số tính chất của ethoxyquin ........17 1.3.2. Tác hại của ethoxyquin ........................................................................................18 1.3.3. Một số ứng dụng chủ yếu của ethoxyquin........................................................... 18 1.3.4. Tình hình nghiên cứu về Ethoxyquin ..................................................................18 1.3.4.1. Tình hình sử dụng ethoxyquin trong thức ăn thuỷ sản ..................................... 18 1.3.4.2. Một số nghiên cứu về ethoxyquin .................................................................... 19 1.3.4.3. Qui định mức dư lượng tối đa của ethoxyquin ................................................. 20 Chương 2: THỰC NGHIỆM ......................................................................................... 21 2.1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .............................................................. 21 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................................21 2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 22 2.2.1. Phương pháp thu mẫu ..........................................................................................22 2.2.2. Phương pháp phân tích ........................................................................................22 2.2.2.1. Phạm vi, mục đích ............................................................................................ 22 2.2.2.2. Nguyên tắc ........................................................................................................ 22 2.2.2.3. Phương pháp phân tích ..................................................................................... 22 2.2.2.4. Điều kiện chạy máy HPLC ............................................................................... 25 2.2.2.5. Phương pháp tính kết quả ................................................................................. 25 2.2.2.6. Các biện pháp đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm .................................. 26 2.2.2.7. Phương pháp đánh giá ...................................................................................... 26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 30 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ .......................................................................................... 30 3.1.1. Khoảng tuyến tính ............................................................................................... 30 3.1.2. Độ lặp lại .............................................................................................................31 3.1.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi ...................................................................................33 3.1.4. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD), giới hạn định lượng của phương pháp (MLOQ) ......34 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ETHOXYQUIN ................................... 35 3.2.1. Một số qui định về giới hạn cho phép (MRL) của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam ............................................................................................................ 35 vi Luận văn tốt nghiệp 3.2.2. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi ................................................................................................................... 35 3.2.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho tôm ............................................................................................................. 36 3.2.2.2. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho cá ................................................................................................................ 38 3.2.2.3. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn gia cầm và thức ăn cho heo............................................................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 43 1. Kết luận...................................................................................................................... 43 2. Kiến nghị ................................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 45 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 48 vii Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt C Độ Celcius µl microliters ACN Acetonitrile AOAC Association Of Analytical Communities CRM Certified reference material – Mẫu chuẩn được chứng nhận. HPLC High Performance Liquid Chromatography– Sắc ký lỏng hiệu năng cao. LOD Limit of detection – Giới hạn phát hiện. LOQ Limit of quantitation – Giới hạn định lượng. MLOD Method limit of detection – Giới hạn phát hiện của phương pháp. MLOQ Method limit of quantitation – Giới hạn định lượng của phương pháp. ml milliliters ppb parts per billion ppm parts per million PTN Phòng Thí Nghiệm QC Quality Control – Kiểm soát và kiểm tra chất lượng. QUECHERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn. TACN Thức ăn chăn nuôi. TAGC Thức ăn gia cầm. TACC Thức ăn cho cá. TACH Thức ăn cho heo. TACT Thức ăn cho tôm. UV Ultra Violet – Cực tím. viii Luận văn tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Trang Hình1.1. Thời gian lưu của cấu tử phân tích. ............................................................................. 4 Hình 1.2. Pic sắc ký ........................................................................................................ 6 Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................ 9 Hình 3.1. Đường chuẩn ethoxyquin nồng độ từ 1 – 40 ppm ........................................ 30 Hình 3.2. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACT ( từ TACT 1 – TACT 8) ........................................................................................................................ 37 Hình 3.3. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACT ( từ TACT 9 – TACT 23) ...................................................................................................................... 37 Hình 3.4. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACC ( từ TACC 1 – TACC 17) ...................................................................................................................... 38 Hình 3.5. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACC ( từ TACC 18 – TACC 37) ...................................................................................................................... 38 Hình 3.6. Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TAGC và TACH....... 40 ix Luận văn tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1. Qui định giới hạn cho phép của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi, thực phẩm ............................................................................................................................. 20 Bảng 2.1. Số lượng các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích .................................. 22 Bảng 2.2. Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .................. 27 Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC). ................ 28 Bảng 3.1. Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn Ethoxyquin .................... 30 Bảng 3.2. Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi ............................................................................................................................... 31 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi của ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi. ............ 33 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát MLOD và MLOQ trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi......... 35 Bảng 3.5. Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên 84 mẫu thức ăn chăn nuôi .......................................................................................................... 36 Bảng 3.6. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho tôm... 37 Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho cá ..... 39 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn gia cầm (bao gồm gà và vịt) ............................................................................................................... 41 Bảng 3.9. Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho heo ... 41 x Luận văn tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Trong thức ăn chăn nuôi, các thành phần dinh dưỡng chủ yếu bao gồm protein, lipid, carbohydrate, chất xơ, chất khoáng, vitamin và các acid amin. Cung cấp đầy đủ dinh dưỡng sẽ giúp vật nuôi tăng trưởng nhanh, hiệu quả nuôi trồng cao. Ngoài ra, trong thức ăn chăn nuôi còn bổ sung thêm một số chất phụ gia, chất bảo quản, chất chống oxy hóa,… Ethoxyquin là một chất chống oxy hoá được sử dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi. Từ lâu ethoxyquin đã bị cấm sử dụng trong thức ăn dành cho người (trừ một số gia vị như bột ớt, …). Nhưng con người có thể tiếp xúc với ethoxyquin thông qua vật nuôi từ thức ăn chăn nuôi có chứa hàm lượng cao chất chống oxy hoá ethoxyquin. Trong những năm gần đây, việc xuất khẩu tôm của nước ta sang các thị trường Mỹ, EU, …, và đặc biệt là Nhật Bản gặp nhiều khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu là do dư lượng ethoxyquin trong tôm vượt quá giới hạn cho phép. Để khắc phục tình trạng trên, Tổng cục Thuỷ sản đã thông báo và yêu cầu các cơ sở sản xuất, kinh doanh đã đăng kí lưu hành sản phẩm thức ăn chăn nuôi có chứa thành phần ethoxyquin phải công bố về thành phần và hàm lượng ethoxyquin trên nhãn sản phẩm theo qui định của Thông tư 66/2011/TT-BNNPTNT ngày 10/10/2011 của Bộ Nông nghiệp và PTNT qui định chi tiết một số điều Nghị định số 08/2010/NĐ-CP ngày 05/02/2010 của Chính phủ về thức ăn chăn nuôi. Trên cơ sở đó, các nghiên cứu được tiến hành tìm hiểu về các phương pháp phát hiện và định lượng ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi. Trong các phương pháp phân tích ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi thì phương pháp phân tích bằng HPLC được xem là đạt hiệu quả cao và phù hợp với các yêu cầu đặt ra. Vì vậy, đề tài được chọn nghiên cứu: “Khảo sát quy trình xác định hàm lượng ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”. 2. Mục đích Tìm hiểu phương pháp phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng). Xác định hàm lượng của chất chống oxy hoá – Ethoxyquin trong 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (trong đó 1 Luận văn tốt nghiệp 23 mẫu thức ăn cho tôm, 37 mẫu thức ăn cho cá, 14 mẫu thức ăn gia cầm và 10 mẫu thức ăn cho heo). Nhận định được tình hình sử dụng chất chống oxy hoá – Ethoxyquin có trong thức ăn chăn nuôi để giúp người tiêu dùng sử dụng sản phẩm hợp lý và phục vụ tốt cho xuất khẩu thủy sản ở nước ta. 3. Mục tiêu Trình bày quy trình phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC. Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng). Phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi đã thu thập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 4. Đối tượng nghiên cứu Đề tài thực hiện trên 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (bao gồm 23 mẫu thức ăn cho tôm, 37 mẫu thức ăn cho cá, 14 mẫu thức ăn gia cầm và 10 mẫu thức ăn cho heo). 5. Giới hạn đề tài Khảo sát trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi do phòng thí nghiệm hoá Trung Tâm Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm Vinacert Cần Thơ cung cấp. 6. Các bước thực hiện đề tài  Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm tài liệu có liên quan đến đề tài, viết đề cương.  Giai đoạn 2: Thực hiện đề tài.  Giai đoạn 3: Thu thập kết quả, xử lý số liệu, viết bài, báo cáo. Nơi thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm hoá Trung Tâm Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm Vinacert Cần Thơ. 2 Luận văn tốt nghiệp NỘI DUNG Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1. CƠ SỞ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.1.1. Khái niệm[12, 18] HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử). Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… 1.1.2. Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC[1, 2, 12, 18] 1.1.2.1. Hệ số phân bố K Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình: X pha tĩnh  X pha động Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K K= CS CM Trong đó: CS là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh. CM là nồng độ mol chất tan trong pha động. Trị số K càng lớn chất tan phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn. 3 Luận văn tốt nghiệp 1.1.2.2. Thời gian lưu (tR) Thời gian lưu của một chất là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:  Bản chất sắc ký của pha tĩnh.  Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.  Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.  Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động. Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị doãng và độ lặp lại của pic kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích. Hình1.1. Thời gian lưu của cấu tử phân tích. t 'R = t R - t 0 Thời gian t 'R là thời gian lưu thực của một cấu tử. Thời gian t0 của các chất không lưu giữ được gọi là thời gian lưu chết. 1.1.2.3. Hệ số dung lượng k Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng. 4 Luận văn tốt nghiệp k' = CS×VS V =K× S CM ×VM VM ' Hay k = t R -t 0 t0 Nếu k nhỏ thì t R cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu k lớn thì pic bị doãng. Trong thực tế k từ 1 - 5 là tối ưu. 1.1.2.4. Hệ số chọn lọc α Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có kA và kB khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc. k 'B α= (Với điều kiện k 'B ˃ k'A nên α luôn lớn hơn 1). k'A Thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 – 2. Nếu α lớn quá thời gian phân tích sẽ dài. Hệ số tách phụ thuộc vào:  Bản chất pha tĩnh của cột phân tích.  Pha động.  Nhiệt độ. 1.1.2.5. Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào:  Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh.  Tốc độ và độ phân cực của pha động.  Hệ số khếch tán của các chất trong cột. Trong cùng một điều kiện sắc ký chiều cao H là hằng định với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết cũng là hằng định. Số đĩa lý thuyết có thể tính dựa trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được: 5 Luận văn tốt nghiệp 2  t t  N = 16   R  = 5,54   R  W1 W  2 Trong đó:     t R : thời gian lưu. W: chiều rộng của pic sắc ký ở đáy. W1 : chiều rộng pic sắc ký ở vị trí 1 Nồng độ 2 2 chiều cao pic. tR h W1/2 W Thời gian Hình 1.2. Pic sắc ký. Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng W càng nhỏ thì mũi sắc ký càng nhọn. Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng tách của cột càng cao. 1.1.2.6. Độ phân giải RS Độ phân giải là đại lượng đánh giá khả năng tách giữa hai cấu tử, được tính theo công thức: RS = Hay RS =  t R B -  t R A 0,5×(WA + WB ) N (α-1) k 'B × × ' 4 α kA Trong đó (t R )A , (t R ) B : lần lượt là thời gian lưu của chất A và chất B. WA, WB: lần lượt là chiều rộng đáy pic sắc ký của chất A và chất B. N: số đĩa lý thuyết. 6 Luận văn tốt nghiệp α: độ chọn lọc. k 'B : hệ số dung lượng của chất B. Trong thực tế các pic cân đối thì độ phân giải tối thiểu RS = 1. Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp. Nếu độ phân giải quá thấp thì các pic chưa tách hẳn. 1.1.3. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao[1, 8, 12] 1.1.3.1. Sắc ký pha thường Pha tĩnh lỏng phân cực như triethylene glycol, nước, silica, amino, cyano. Pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexane, isopropyl ether, isooctane, ethyl acetate. Cấu tử có độ phân cực càng cao càng lưu giữ mạnh, độ lưu giữ giảm đi khi độ phân cực của pha động tăng lên. Ứng dụng: phân tích tốt các cấu tử kỵ nước, các đồng phân, dung môi pha mẫu không phân cực. 1.1.3.2. Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh. Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan. Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm trên pha tĩnh sẽ hút cation chất tan. Pha tĩnh có các nhóm trao đổi ion: sulfonate, tetraalkyl ammonium… Pha động là dung dịch đệm trong nước. Ứng dụng: phân tích tốt các đối tượng là anion, cation cả vô cơ và hữu cơ trong dung dịch nước. 1.1.3.3. Sắc ký hấp phụ Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Ở các vị trí hấp phụ chất phân tích tranh chấp với pha động. Lưu giữ chất phân tích là do lực hấp phụ. Pha tĩnh thường dùng là silic oxide (silica) và aluminum oxide. Pha động ảnh hưởng đến hệ số phân bố của chất phân tích, để rửa giải các chất đã bị hấp phụ người ta dùng pha động có sức rửa giải khác nhau. Ứng dụng: tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ; phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm. 7 Luận văn tốt nghiệp 1.1.3.4. Sắc ký pha đảo Phân tách các cấu tử dựa trên sự phân bố của các cấu tử giữa pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực. Pha tĩnh thường dùng: C18, C8, phenyl, C3… Pha động: là hỗn hợp dung dịch nước (đệm) với các dung môi hữu cơ tan trong nước như acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), tetrahydrofuran (THF)… nhằm đảm bảo tương tác với chất tan để tách pha đảo hỗn hợp nhiều chất. Ứng dụng: sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến để phân tích các chất thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau như dược, hoá sinh, thực phẩm, môi trường… 1.1.4. Các cách rửa giải trong HPLC[1, 16] Trong HPLC có hai chế độ rửa giải là isocratic và gradient: 1.1.4.1. Rửa giải với chế độ isocratic Theo cơ chế này thành phần pha động không đổi trong suốt qua trình rửa giải. Ưu điểm:  Thành phần pha động chính xác.  Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền.  Đường nền ổn định do thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu dò thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu.  Thành phần pha động có thể trộn trước bằng tay. Nhược điểm:  Khả năng tách kém, thời gian phân tích dài.  Thay đổi thành phần pha động phù hợp với thành phần mẫu không thể thực hiện nhanh.  Do pha động phải trộn trước nên thành phần có thể thay đổi theo thời gian khi để lâu. 1.1.4.2. Rửa giải với chế độ gradient Theo chế độ này pha động sẽ có thành phần thay đổi trong quá trình chạy. Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường là 2 – 4 loại được đựng trong các bình khác nhau có tỉ lệ thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Ưu điểm: 8 Luận văn tốt nghiệp  Có khả năng tách tốt.  Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp.  Pha động có thành phần chính xác, có thể thay đổi rất nhiều thành phần, độ chính xác ổn định theo thời gian.  Thời gian phân tích khá ngắn.  Tăng độ bền của cột sắc ký do loại bỏ được những cấu tử có độ lưu giữ mạnh. Nhược điểm:  Thiết bị HPLC phức tạp hơn, đắt tiền.  Khi một thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động sẽ kém chính xác và không ổn định.  Một số đầu dò hoặc ứng dụng khác không thể sử dụng chế độ gradient dung môi. 1.1.5. Giới thiệu thiết bị HPLC[1, 2, 17] Do bản chất của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kiểu sắc ký lỏng để tách và định lượng chất phân tích. Mặc dù vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, gồm các bộ phận cơ bản sau: Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 1. Bình chứa dung môi pha động. 9