Luận văn thạc sỹ Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy nấm aspergillus fumigatus sinh tổng hợp phytase cao

  • Số trang: 70 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 122 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27372 tài liệu

Mô tả:

Ket-noi.com LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG THÍCH HỢP NUÔI CẤY NẤM Aspergillus fumigatus SINH TỔNG HỢP PHYTASE CAO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ NGỌC ĐIỆP MSSV: 3083916 LỚP: CNSHTT K34 Cần Thơ, Tháng 05/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. Dương Thị Hương Giang Nguyễn Thị Ngọc Điệp DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………….. Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CẢM TẠ Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Đại học thì sự cố gắng của bản thân tôi là chưa đủ, tôi đã nhận được sự ủng hộ và giúp đỡ nhiệt tình của rất nhiều người. Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Dương Thị Hương Giang đã tận tâm hướng dẫn, định hướng cho tôi thực hiện đề tài, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bạn Nguyễn Văn Tính đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, luôn sẵn sàng chia sẽ những kinh nghiệm và đóng góp những ý kiến quý báo, tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này. Trân trọng cám ơn bạn Trần Nguyễn Nhật Khoa, anh Tạ Duy Tiên và chị Nguyễn Thị Xuân Dung, cùng các anh chị em cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ, động viên và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cám ơn các anh, chị quản lý phòng thí nghiệm Thực Phẩm cũng như các phòng thí nghiệm thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học là những người đã hỗ trợ trực tiếp trong việc hướng dẫn và cách thức sử dụng trang thiết bị phục vụ cho đề tài. Tôi rất biết ơn PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp - Cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 34 và tập thể lớp đã quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian vừa qua. Ngoài ra, tôi xin ghi nhận và cám ơn những thầy cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức chuyên môn và tạo những điều kiện tốt nhất cho sinh viên chúng tôi được tiếp cận và tham gia nghiên cứu khoa học, từ đó tạo tiền đề vững chắc để đề tài luận văn tốt nghiệp được tiến hành. Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi gửi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến Cha Mẹ và anh chị em trong gia đình đã luôn hết lòng yêu thương, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này. Kính chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cám ơn. Cần Thơ, ngày 15 tháng 05 năm 2013 Nguyễn Thị Ngọc Điệp Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Phytase là enzyme có khả năng giải phóng phosphorus từ phytate, khiến phosphorus trở nên dễ hấp thu nên được dùng phổ biến trong thức ăn gia súc. ần đây, trong ph ng th nghiệm Công nghệ en yme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học chủng nấm m i củ Aspergillus fumigatus được xem là nguồn tiềm năng cao trong việc sản sinh enzyme phytase. Trong nghi n cứu này, việc khảo s t điều kiện nuôi cấy đ cải thiện s sinh tổng hợp phytase cao từ d ng nấm mốc A. fumigatus T1 m i đ được tiến hành. Chủng nấm mốc th hiện s sinh tổng hợp enzyme phytase cao nhất tr n môi trường b n r n ở tuổi bào tử củ ngày thứ nhất và trong môi trường có bổ sung hàm lượng KH2PO4 thích hợp là 1%, nguồn carbon là glucose v i hàm lượng 0,5%, và nguồn và hàm lượng nitrogen chọn được là malt extract 0,5%. Môi trường nuôi cấy A. fumig tus s u khi tối ưu hó cho hoạt t nh phyt se c o gấp hơn 3 lần so v i môi trường b n đầu. Từ kết quả trên, qui trình chung cho quá trình sinh tổng hợp phytase cao từ A. fumigatus đ được thiết lập. Từ khóa: Aspergillus fumigatus T1, KH2PO4, malt extract, phytase, phytate, tuổi bào tử. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... CẢM TẠ ........................................................................................................................... TÓM LƢỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... vii CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................. viii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Phytic acid và muối phytate ................................................................................ 3 2.2. Enzyme phytase .................................................................................................... 3 2.2.1. Sơ lược về enzyme phytase ............................................................................... 3 2.2.2. Đặc điểm của phytase........................................................................................ 4 2.2.3. Phân loại và danh pháp ..................................................................................... 4 2.2.4. Cơ chế thủy phân phytate của phytase .............................................................. 6 2.2.5. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ............................................................................ 7 2.2.5.1. pH tối ưu ................................................................................................................. 7 2.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu ........................................................................................................ 8 2.2.5.3. Ảnh hưởng của cơ chất ........................................................................................... 8 2.2.6. Ứng dụng của phytase ....................................................................................... 8 2.2.6.1. Trong công nghiệp thức ăn gia súc, thủy sản ......................................................... 9 2.2.6.2. Trong sản xuất thực phẩm ...................................................................................... 9 2.2.6.3. Trong công nghiệp bột giấy và giấy ..................................................................... 10 2.2.6.4. Trong trồng trọt .................................................................................................... 10 2.2.6.5. Trong sản xuất myo-inositol phosphate ............................................................... 10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 2.2.7. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ........................................................... 11 2.2.7.1. Phytase từ thực vật ............................................................................................... 11 2.2.7.2. Phytase từ mô động vật ........................................................................................ 11 2.2.7.3. Phytase từ vi sinh vật ............................................................................................ 11 2.3. Sơ lƣợc về nấm mốc A. fumigatus ..................................................................... 12 2.3.1. Phân loại .......................................................................................................... 12 2.3.2. Đặc điểm cấu tạo hệ sợi và cơ quan sinh sản của A. fumigatus ...................... 12 2.3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của A. fumigatus ............................................................. 14 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ............................ 14 2.3.4.1. Các yếu tố vật lý ................................................................................................... 14 2.3.4.2. Các yếu tố dinh dưỡng.......................................................................................... 15 2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và lượng giống cấy vào ......................... 16 2.4. Các nghiên cứu về phytase từ A. fumigatus trong và ngoài nƣớc .................. 17 2.4.1. Nghiên cứu trong nước.................................................................................... 17 2.4.2. Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................... 17 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................................... 18 3.1.1. Thời gian và địa điểm...................................................................................... 18 3.1.2. Nguyên liệu ..................................................................................................... 18 3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ......................................................................... 18 3.1.3.1. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................................. 18 3.1.3.2. Hóa chất ................................................................................................................ 19 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 19 3.2.1. Chuẩn bị mốc giống và môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp phytase ............. 19 3.2.2. Trích ly phytase thô từ sinh khối nấm mốc A. fumigatus ............................... 20 3.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính phytase ........................................................ 20 3.3. Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus vừa phân lập ..................................................................... 23 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi bào tử lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ................................................................................................................... 23 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phosphorus (KH2PO4) bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................... 23 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ........................................................................ 24 3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng carbon bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ........................................................................ 24 3.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 25 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 26 4.1. Ảnh hƣởng của tuổi bào tử lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus....................................................................................................................... 26 4.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phosphorus (KH2PO4) bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................................ 27 4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và hàm lƣợng nitrogen bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................................ 29 4.4. Ảnh hƣởng của nguồn và hàm lƣợng carbon bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ..................................................................................... 31 4.5. Qui trình nuôi cấy chủng A. fumigatus sinh phytase cao và thu nhận chế phẩm phytase thô ......................................................................................................... 32 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 34 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 34 5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 35 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... Phụ lục 1: Các phƣơng pháp sinh hóa - vi sinh 1. Phương pháp nuôi cấy nấm A. fumigatus để thu sinh khối 2. Các bước chuẩn bị môi trường Agar khoai tây gây giống và giữ giống (PGA Potato Glucose Agar) 3. Phương pháp trữ nấm mốc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 4. Các bước chuẩn bị môi trường bán rắn nuôi cấy nấm để thu dịch trích enzymes thô 5. Phương pháp Bradford Phụ lục 2: Số liệu và kết quả phân tích thống kê 1. Số liệu về xây dựng đường chuẩn BSA (µg/mL) 2. Số liệu về xây dựng đường chuẩn phosphate (KH2PO4) (mM) 3. Kết quả phân tích thống kê các thí nghiệm Phụ lục 3: Số liệu thô của các thí nghiệm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Phân loại và danh pháp phytase ......................................................................... 6 Bảng 2. Xây dựng đường chuẩn phosphate ................................................................... 21 Bảng 3. Dãy nồng độ tăng dần của dung dịch BSA chuẩn ................................Phụ lục 1 Bảng 4. Giá trị OD của dung dịch BSA chuẩn ...................................................Phụ lục 2 Bảng 5. Giá trị OD của dung dịch KH2PO4 chuẩn .............................................Phụ lục 2 Bảng 6. Sự ảnh hưởng của tuổi bào tử đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus .........................................................................................Phụ lục 2 Bảng 7. Sự ảnh hưởng của hàm lượng phosphorus (KH2PO4) đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus .....................................................Phụ lục 2 Bảng 8. Sự ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus ............................................................Phụ lục 2 Bảng 9. Sự ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng carbon đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus .............................................................Phụ lục 2 Bảng 10. Hoạt tính phytase của A. fumigatus theo tuổi bào tử ..........................Phụ lục 2 Bảng 11. Hàm lượng protein trong dịch enzyme thô của A. fumigatus theo tuổi bào tử ...........................................................................................................Phụ lục 3 Bảng 12. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo hàm lượng KH2PO4 ...............................................................................................................Phụ lục 3 Bảng 13. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus theo hàm lượng KH2PO4 ....................................................................................Phụ lục 3 Bảng 14. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo các nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung .......................................................................................Phụ lục 3 Bảng 15. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus theo các nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung .................................................Phụ lục 3 Bảng 16. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo các nguồn và hàm lượng carbon bổ sung .........................................................................................Phụ lục 3 Bảng 17. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus theo các nguồn và hàm lượng carbon bổ sung..................................................................Phụ lục 3 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Tương tác phytase nhóm Histidine Phosphotase với cơ chất phytate ................ 6 Hình 2. Phản ứng xúc tác của phytase ............................................................................. 7 Hình 3. Khuẩn ty dinh dưỡng (trái) và khuẩn ty sinh sản (phải) của A. fumigatus ....... 13 Hình 4. Cấu tạo cơ quan sinh sản của A. fumigatus ...................................................... 14 Hình 5. Khuẩn lạc của A. fumigatus .............................................................................. 14 Hình 6. Qui trình thu nhận phytase thô từ A. fumigatus ................................................ 20 Hình 7. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo tuổi bào tử (ngày) .. 26 Hình 8. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo hàm lượng KH2PO4 bổ sung ........................................................................................................................... 28 Hình 9. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung ............................................................................................................ 29 Hình 10. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo nguồn và hàm lượng carbon bổ sung ............................................................................................................... 31 Hình 11. Quy trình nuôi cấy và thu nhận phytase thô của A. fumigatus ....................... 33 Hình 12. Biểu đồ đường chuẩn protein (BSA) ...................................................Phụ lục 2 Hình 13. Biểu đồ đường chuẩn phosphate (KH2PO4) ........................................Phụ lục 2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine Diphosphate AMP Adenosine Monophosphate ATP Adenosine Triphosphate BPP -Propellar Phytase CP Cysteine Phosphatase DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FDA Food and Drug Administration GMP Guanosine Monophosphate GTP Guanosin Triphosphate HAP Histidine Acid Phytase HIV Human Immunodeficiency Virus NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NC-IUBMB Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology P Phosphorus PAP Purple Acid Phosphatase PGA Potato Glucose Agar RNA Ribonucleic Acid TCA Trichloroacetic Acid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Phosphorus là một trong những nguyên tố thiết yếu cho sinh vật, là hợp phần cấu trúc của nucleic acid (DNA, RNA), màng phospholipid, các hợp chất cao năng (như ATP, NADPH) và các mô liên kết như xương,... (Jahnke, 2000). Do đó phosphorus vô cơ cũng như các loại thực vật giàu phosphorus được bổ sung vào thức ăn gia súc để đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển tốt cho động vật. Điều đáng chú ý là trong thực vật, phần lớn lượng phosphorus dự trữ tồn tại ở dạng phytic acid và muối phytate khó hấp thu. Thêm vào đó, phytic acid cũng là chất kháng dưỡng, chúng liên kết chặt chẽ với các khoáng chất thiết yếu như Ca2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+/3+ dẫn đến việc làm giảm khả năng hấp thụ các khoáng chất cần thiết này trong cơ thể động vật (Singh, 2008). Do vậy, phần lớn lượng phosphorus hữu cơ trong thực vật cũng như các khoáng dưỡng không được sử dụng hiệu quả. Muốn chuyển hóa được các hợp chất phosphorus này phải nhờ hệ enzyme phytase có ở một số động thực vật và vi sinh vật. Phytase là enzyme có khả năng phá vỡ các liên kết của phức hệ phytate không tiêu hoá được và giải phóng phosphorus, calcium và các chất dinh dưỡng khác (Debnath et al., 2005; Cao et al., 2007). Phytase giải phóng phosphorus bằng cách phân cắt liên kết của các gốc phosphate với inositol. Khi các liên kết này bị phá vỡ, các gốc phosphate cùng một số dưỡng chất khác như khoáng kim loại, amino acid, đạm và tinh bột ở dạng muối phytate khó hòa tan sẽ được giải phóng và trở nên dễ hấp thu. Đối với các loài động vật có cấu tạo dạ dày đơn giản như lợn, gia cầm, thỏ, ngựa, cá,… khả năng hấp thu phosphorus từ phytate rất thấp vì chúng thiếu phytase trong hệ tiêu hóa. Kết quả là một lượng lớn phytate trong thức ăn có nguồn gốc thực vật được thải ra trong phân, có thể làm ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước, đặc biệt là tầng nước mặt. Đồng thời lượng phosphorus này sẽ là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn gây bệnh sống trong đất phát triển và phát tán trong nước gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa (Mullaney et al., 2000). Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách bổ sung phytase vào thức ăn gia súc để thủy phân các hợp chất phytate, tăng khả năng hấp thu phosphorus và một số chất dinh dưỡng. Theo Nguyễn Thu Quyên et al. (2011) việc bổ sung phytase vào khẩu phần ăn cho gà Broiler có ảnh hưởng tích cực đến khả năng khoáng hóa xương cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa calcium, phosphorus của gà Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Broiler. Ngoài ra, các dưỡng chất khác khi tạo phức với phytate cũng trở nên dễ tiêu hoá hơn, từ đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm ô nhiễm môi trường. Việt Nam là một nước chăn nuôi nông nghiệp nên nhu cầu về thức ăn gia súc rất cao. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất phytase để bổ sung vào thức ăn gia súc là hết sức cần thiết. Phytase được tìm thấy ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, vi sinh vật được xem là nguồn sản xuất phytase chính cho việc nghiên cứu và ứng dụng của enzyme này. Nhiều nghiên cứu cho thấy phytase có ở vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Trong đó, nấm mốc được xem là nguồn sản xuất phytase dồi dào và phong phú với nhiều loài trong chi Aspergillus như A. ficuum, A. carbonarius, A. oryzae, A. niger và A. fumigatus (Shimizu, 1993; Volfova et al., 1994; Liu et al., 1999). So với phytase từ các loài khác trong chi Aspergillus thì phytase từ A. fumigatus có nhiều đặc tính nổi trội hơn như tính đặc hiệu với cơ chất rộng, vùng pH tối ưu 2,5 và 5,5, có khả năng hồi tính cao sau khi biến tính ở nhiệt độ cao (Pasamontes et al., 1997; Wyss et al., 1998). Với những ưu điểm này, phytase từ A. fumigatus được các nhà khoa học chú ý và nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở Việt Nam có ít tài liệu nghiên cứu về phytase từ loài nấm mốc này. Do đó đề tài “Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy nấm A. fumigatus sinh tổng hợp phytase cao” được thực hiện nhằm tiếp tục hoàn thiện nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, với mong muốn sản xuất phytase từ loài nấm mốc A. fumigatus. Trong nghiên cứu này, sự phát triển của dòng nấm A. fumigatus T1 sinh tổng hợp phytase sẽ được khảo sát dưới các điều kiện như tuổi bào tử chủng vào, hàm lượng phosphorus (KH2PO4), nguồn và hàm lượng nitrogen, nguồn và hàm lượng carbon của môi trường nuôi cấy để tăng năng suất sinh tổng hợp phytase. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus và thiết lập được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất để thu nhận hàm lượng phytase cao. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Phytic acid và muối phytate Phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate) là thành phần dự trữ phosphorus chính, nguồn inositol và nhiều chất khoáng trong cây. Vì thế nó đóng vai trò quan trọng đối với động vật cũng như thực vật, con người và vi khuẩn. Trong các loại hạt dùng làm thực phẩm như hạt đậu, hạt ngũ cốc, và hạt có dầu, phytic acid chiếm 1-5% trọng lượng của chúng. Thêm vào đó, trong tổng số lượng phosphorus ở các hạt này, phần lớn phosphorus (75-80%) hiện diện dưới dạng phytic acid (Vohra và Satyanarayana, 2003; Oh et al., 2004). Trong tự nhiên, phytic acid tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate nên khi nói về phytic acid thì thường dùng thuật ngữ phytate. Phytate chứa 14-25% phosphorus, 12-20% calcium, 1-2% kẽm và sắt. Hỗn hợp muối Ca-Mg của phytic acid được gọi là phytin). Trong lá mầm của các hạt đậu khô, phytate chứa 99% và trong phôi là 1% (Ferguson và Bollard, 1976). Reddy et al. (1989) đã phát hiện ra hàm lượng phytate cao nhất trong số các loại ngũ cốc là ở trong bắp (0,83-2,22%) và giữa các cây họ đậu là ở trong đậu que (5,92 – 9,15%). Phytic acid có công thức tổng quát là C6H18O24P6. Do cấu trúc phân tử đặc biệt nên phytic acid có tác động kháng dưỡng mạnh trong thức ăn có nguồn gốc từ thực vật (Pallauf và Rimbach, 1997). Khác với các phân tử chứa phosphorus vô cơ khác, phytic acid là một phân tử có cấu trúc hóa học bền, chứa hàm lượng phosphate cao, mang điện tích âm trong khoảng pH rộng. Ở điều kiện sinh lý bình thường phytic acid kết hợp với các khoáng chất thiết yếu như calcium, magnesium, sắt và kẽm tạo phức phytate-khoáng không hòa tan trong đường ruột ngăn cản sự hấp thu khoáng (Davies, 1982). Phytic acid cũng liên kết với các protein tạo thành phức hợp phytate-protein làm giảm độ hòa tan của protein, dẫn đến giảm khả năng tiêu hóa protein và gây ức chế men tiêu hoá (Pallauf và Rimbach, 1997). 2.2. Enzyme phytase 2.2.1. Sơ lƣợc về enzyme phytase Phytase là một enzyme có thể phân hủy phytic acid và phytate để giải phóng ra phosphoric acid, inositol, nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và liposome. Phytase không chỉ có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic, tăng khả năng hấp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT thụ phosphorus từ thực vật trong thức ăn, giải phóng một số amino acid, tinh bột, calcium và các nguyên tố vi lượng khác; mà còn giúp hạn chế lượng phosphorus vô cơ sử dụng và do đó có thể giúp giảm được chi phí thức ăn. Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) là một enzyme đặc biệt của lớp phosphatase enzyme xúc tác thủy phân liên kết monoester của phytic acid (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisdihydrogenphosphate hay myo-inositol hexakisphosphate) giải phóng orthophosphate vô cơ và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm phosphate hơn, có thể thành myo-inositol tự do (Vohra và Satyanarayana, 2003; Oh et al., 2004). 2.2.2. Đặc điểm của phytase Phytase có trọng lượng phân tử lớn từ 40-500 kDa. Phytase có thể là những protein đơn phân như phytase của Selenomonas ruminantium (46 kDa) (Yanke et al., 1998), ở A. niger là 85 kDa (PhyA) (Ullah và Gibson, 1987) và 68 kDa (PhyB) (Ehrlich et al., 1993); đồng thời, phytase có thể gồm nhiều tiểu đơn vị như ở Schwanniomyces castellii (490 kDa) (Segueilha et al., 1992). Cấu trúc của phytase đã được nghiên cứu nhờ kỹ thuật nhiểu xạ tia X (X-ray crystallography hay X-ray diffraction). Cấu trúc bậc một của phytase từ A. ficcum gồm 594 amino acid trong đó có 37% amino acid không phân cực, 42% phân cực, 11% có tính acid và 9,5% có tính kiềm (Ullah, 1988; Ullah và Dischinger, 1993). Ullah et al. (1994) đã chỉ ra rằng cấu trúc bậc hai của phytase có 17,3% dạng -helix, 29% dạng -sheet, 32,6% dạng turn; trong đó tryptophan và cầu nối disulfide đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính phytase. Các chất có khả năng phân cắt các cầu nối disulfide như guanidinium hydrochloride hay -mercaptoethanol sẽ làm cho phytase mất hoạt tính hoàn toàn (Ullah và Mullaney, 1996). 2.2.3. Phân loại và danh pháp Dựa vào đặc điểm cấu trúc và cơ chế xúc tác, (Lei et al., 2007) đã chia phytase thành bốn lớp: Histidine Acid Phosphatase (HAP), -Propellar Phytase (BPP), Cysteine Phosphatase (CP) và Purple Acid Phosphatase (PAP).  Histidine Acid Phosphatase (HAP): các phytase thuộc nhóm này có cơ chế phản ứng và cấu trúc hoạt điểm giống nhau. Ở đầu N, bắt đầu là trình tự các amino acid RHGXRXP và kết thúc bằng HD ở đầu C (Wodzinski và Ullah, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 1996). Phytase được biết đến nhiều nhất trong nhóm này là Escherichia coli phytase và các phytase từ nấm mốc như A. niger, A. fumigatus…  -Propellar Phytase (BPP): phân tử protein chủ yếu gồm -sheet xếp thành cấu trúc sáu cánh quạt (six-bladed propeller). Tất cả các đặc tính của phytase như xúc tác, khả năng chịu nhiệt đòi hỏi phải có sự hiện diện của Ca2+ trong môi trường vì Ca2+ quyết định đến sự bám dính của phytase. Điển hình của nhóm enzyme này là phytase từ Bacillus sp. (Lei et al., 2007).  Cysteine Phosphatase (CP): có ở một số vi sinh vật sống trong dạ cỏ như vi khuẩn Selenomonas ruminantium. Phytase của S. ruminantium được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm CP: hoạt động tốt ở pH 4-5,5 và nhiệt độ từ 50-55°C. Một số ion kim loại như Cu2+, Zn2+, Hg2+ sẽ ức chế enzyme hoạt động.  Purple Acid Phosphatase (PAP): nhóm enzyme này cần có một hay một vài ion kim loại như một chất hoạt hóa. PAP được tìm thấy ở lá mầm của cây đậu nành (Glycine max L. (Merr.)) đang ở giai đoạn nảy mầm (Hegeman và Grabau, 2001). Theo Ủy Ban Thuật ngữ thuộc Hiệp hội Sinh hóa và Sinh học Phân tử Quốc tế (Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology-NC-IUBMB) và Hệ thống thông tin Enzyme (The Comprehensive Enzyme Information System) dựa trên thứ tự ưu tiên nhóm phosphate bị phân cắt trong cấu trúc vòng inositol, phytase được phân loại theo Bảng 1. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Bảng 1. Phân loại và danh pháp phytase (Scheer et al., 2011) E.C. 3.1.3.8 Tên thông thƣờng Tên hệ thống E.C. 3.1.3.26 E.C. 3.1.3.72 4-phytase 5- phytase 6-phytase alkaline phytase myo-inositol- myo-inositol- myo-inositol- hexakisphosphate 3- hexakisphosphate 4- hexakisphosphate 5- phosphohydrolase phosphohydrolase phosphohydrolase phytate 4-phosphatase phytate 5-phosphatase 1D-myo-inositol 1,2,4,5,6- 1D-myo-inositol 1,2,3,5,6- 1L-myo-inositol 1,2,3,4,6- pentakisphosphate + pentakisphosphate + pentakisphosphate + phosphate phosphate phosphate Aspergillus niger; Escherichia coli; Lilium longiflorum; Aspergillus awamori; Aspergillus niger; Medicago sativa; Aspergillus ficuum; Aspergillus fumigatus; Phaseolus vulgaris; Pisum Aspergillus fumigatus Bacillus sp. sativum 3-phytase 1-phytase; Các tên khác phytate 3-phosphatase Sản phẩm sau phản ứng Nguồn gốc 2.2.4. Cơ chế thủy phân phytate của phytase Hình 1. Tƣơng tác phytase nhóm Histidine Phosphotase với cơ chất phytate (Lim et al., 2000) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Phytase thủy phân liên kết ester trong phân tử phytic acid và phytate để giải phóng ra myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và một gốc phosphate. Các phytase thuộc nhóm histidine phosphatase có trình tự tương đối giống nhau (có RHG- ở đầu N và -HD ở đầu C). Ở đầu N (điện tích dương), các gốc amino acid R16, R20, R92, H303 và E304 sẽ tương tác trực tiếp với các gốc phosphate trong phân tử phytic acid và có vai trò cố định các gốc phosphate này (Hình 1). Đồng thời gốc amino acid H17 (không có trên hình) hoạt động như một nhóm thân hạch (nucleophile) trong việc hình thành cầu nối cộng hóa trị phosphohistidine giữa hoạt điểm của enzyme và cơ chất dưới sự giúp đỡ của các gốc amino acid R20 và H303 sau đó sẽ cung cấp proton cho điện tích âm -Ocủa gốc -O-PO32- làm giải phóng nhóm -OH. Cuối cùng, gốc aspartate sẽ chuyển một proton từ nước vào nhóm phosphohistidine và làm giải phóng nhóm phosphate ra khỏi vòng inositol (Ostanin et al., 1992; Mullaney et al., 2002). Khi phytase thủy phân phytic acid và muối phytate, các nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và liposome cũng được tạo thành (Hình 2). Hình 2. Phản ứng xúc tác của phytase (Yao et al., 2012) 2.2.5. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa 2.2.5.1. pH tối ƣu Phytase có pH tối ưu là 5. Nhiều nghiên cứu cho thấy đa phần các phytase là phytase acid có pH tối ưu trong khoảng 4,5-6. Còn pH tối ưu của alkaline phytase là 8 từ những nghiên cứu về phytase từ hạt đậu (Scott, 1991), phấn hoa lily (Baldi et al., 1988), và cây hương bồ (Hara et al., 1985). Phytase từ vi khuẩn có pH tối ưu trong khoảng 6,5-7,5, theo Powar và Jagannathan (1982) thì phytase từ Bacillus có pH tối ưu 6-8. Các phytase có nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4-7,5. Tuy nhiên, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT theo Kerovuo (2000) đa số phytase thực vật pH tối ưu trong khoảng pH 4-5,6. Giá trị pH tối ưu của các phytase nấm men tùy thuộc vào nhiệt độ (Nakamura et al., 2000) và thường nằm trong khoảng 4-5. Không giống như tất cả các phytase từ nấm khác, phytase từ A. fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng 4-7,3 (Wyss et al., 1999). 2.2.5.2. Nhiệt độ tối ƣu Nhiệt độ tối ưu cho phytase nói chung từ 35-77°C. Nhiệt độ tối ưu của phytase từ thực vật thấp hơn so với phytase vi sinh vật. Nhìn chung các phytase có khả năng chịu nhiệt cao, đặc biệt trong trường hợp của phytase từ A. fumigatus có độ bền nhiệt rất cao. Nghiên cứu của Pasamontes et al. (1997) cho thấy phytase từ loài nấm mốc này có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100°C trong 20 phút mà hoạt tính xúc tác vẫn còn giữ được 90% so với hoạt tính ban đầu. 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của cơ chất Phytase có phổ cơ chất đặc hiệu rộng bao gồm phytate, adenosine monophosphate (AMP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), guanosine monophosphate (GMP), guanosin triphosphate (GTP), nicotilamide-adenine dinucleotide phosphate, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, 1-naphthyl phosphate, 2-naphthyl-phosphate, fructose 1,6-diphosphate, fructose 6-phosphate, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, galactose 1-phosphate, α- glycerophosphate, β-glycerophosphate, pyridoxalphosphate, o-phospho-l-serine và pyrophosphate. Trong đó, các phytase có tính đặc hiệu cao với phytate như phytase acid từ E. coli (Greiner et al., 1993), A. niger, A. terreus (Wyss et al., 1999) và alkaline phytase từ B. Subtilis (Powar và Jagannathan, 1982), phấn hoa lily (Barrientos et al., 1994). Các phytase từ A. fumigatus, E. nidulans và M. thermophia thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A. niger, A. terrus CBS và E.coli có tính đặc hiệu cao hơn đối với phytic acid (Wyss et al., 1999). Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây ức chế enzyme. Ullah (1988) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt qua mức 2 nmol/L sẽ gây hiện tượng ức chế. 2.2.6. Ứng dụng của phytase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Phytase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thức ăn chăn nuôi, thủy sản, thực phẩm, sản xuất myo-inositol phosphate, công nghiệp giấy và bột giấy. Ngoài ra enzyme này còn có ứng dụng trong nông nghiệp, làm gia tăng độ phì của đất trồng. 2.2.6.1. Trong công nghiệp thức ăn gia súc, thủy sản Phosphorus rất cần cho động vật (thiếu phosphorus động vật chán ăn, sụt cân, giảm sinh sản...) và myo-inositol (thành phần cấu tạo glycerophospholipid, là lipid chủ yếu của màng sinh học). Vì vậy, phosphorus vô cơ thường được thêm vào thức ăn gia súc. Việt Nam có số lượng gia súc và gia cầm rất lớn, tại những trang trại nuôi tập trung, do thiếu phytase nên hằng năm lượng phosphorus được thải ra trong phân vật nuôi xâm nhập vào môi trường và tích tụ trong đất là khá lớn. Các nhà chăn nuôi vừa tốn chi phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Bằng cách bổ sung phytase từ vi sinh vật vào thức ăn gia súc không chỉ làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn, giảm tác dụng kháng dinh dưỡng của phytic acid mà còn làm giảm ô nhiễm môi trường. Phytase được bổ sung vào khẩu phần thức ăn của lợn có chứa bắp và đậu tương sẽ chuyển đổi được khoảng một phần ba lượng phosphate từ dạng không hấp thu sang dạng hấp thu được (Cromwell et al., 1993). Các thí nghiệm tiếp theo của Cromwell et al. (1995), Yi et al. (1996) và O'Quinn et al. (1997) cũng cho kết quả tương tự. Bên cạnh đó, phytase được dùng trong chế biến thức ăn cá để làm giảm lượng phosphorus thải ra môi trường nước và giảm chi phí bổ sung phosphorus vô cơ vào thức ăn cho cá (Kerovuo, 2000). Vấn đề sử dụng phytase bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được phê duyệt ở 22 quốc gia. FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ) đã công nhận phytase là chất không gây độc hại (Wodzinski và Ullah, 1996). 2.2.6.2. Trong sản xuất thực phẩm Chế biến thực phẩm cho con người cũng là một lĩnh vực ứng dụng của phytase. Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu với hàm lượng phytate cao là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến thực phẩm. Phytate không tiêu hoá được trong ruột non ảnh hưởng tiêu cực đến sự hấp thu của kẽm, calcium, magnesium và sắt. Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa của protein và ức chế các enzyme tiêu hóa. Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghĩa lớn (Kerovuo, 2000). Anno et al. (1985) đã loại phytate từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase từ lúa mì. Bổ sung phytase của A. niger vào bột mì để tăng hấp thu sắt ở người (Sandberg et al., 1996), làm bánh mì giàu sắt, phosphorus, protein dễ tiêu vì bánh mì bán ngoài thị Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -