Tài liệu Luận văn thạc sĩ Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ BẢO TỒN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Đức Minh PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đức Minh cùng PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, là những người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thầy cô đã cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn cũng như bồi đắp niềm đam mê, tính sáng tạo trong quá trình nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo của Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong quá trình học tập tại bộ môn, đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; cùng các bạn đồng nghiệp đã giúp tôi thu thập, phân loại các mẫu vật quý giá để sử dụng trong nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 06 năm 2015 Học viên Nguyễn Văn Thành MỤC LỤC: DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Tổng quan về nhóm Mang 2 1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới 2 1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam 4 2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử 8 2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng trong nghiên cứu 8 2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh 10 2.3. Phân tích thời gian tiến hóa 13 2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích 13 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu 16 16 1.1. Mẫu vật nghiên cứu 16 1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 16 1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 17 1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu: 23 2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.1. Tách chiết ADN tổng số 23 2.2. Phản ứng PCR 24 2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen 26 2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 31 2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR 32 3. Kết quả giải trình tự 34 4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại 35 4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ 36 4.2. Nhánh B 36 5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 45 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 47 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 47 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribo nucleic acid Axit deoxyribonucleic bp base pair Cặp bazơ nitơ EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit ethylen diamin tetraaxetic kb kilobase(=1000bp) Kilo bazơ ML Maximum Likelyhood Hợp lý tối đa MP Maximum Parsimony Tiết kiệm tối đa mtDNA mitochondrial DNA Hệ gen ty thể OD Optical Density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối nR Number of root tree Số cây có gốc nU Number of unroot tree Số cây không gốc unweighted pair group with unweighted pair group with arithmetic mean arithmetic mean UPGMA i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) 4 Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) 6 Hình 3. Mang Trường Sơn (M truongsonensis) 7 Hình 4. Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 Hình 5. Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu xương trên gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu da khô trên gel Agarose 1%, Marker 1kb Hình 7. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 8. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 9. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4 (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 10. Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib (450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 Hình 12. Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng giải trình tự Hình 13. Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên dữ liệu gen cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian Hình 14. 31 31 32 32 33 33 33 34 38 Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 3 gen ty thể và 1 gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị 41 thông tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML Hình 15. Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của nhóm Mang ii 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới 3 Bảng 2. Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxa 10 từ 2 - 10 Bảng 3. Danh sách và thông tin mồi sử dụng cho nghiên cứu 17 Bảng 4. Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự cùng tên 18 mẫu, địa điểm thu mẫu Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang 40 Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4, 16S, G - fibrinogen Bảng 8. Khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn 42 Bảng 9. Địa điểm thu các mẫu Mang lớn 42 Bảng 10. Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến 43 hóa iii MỞ ĐẦU Việt Nam được biết đến là một đất nước đa dạng cao về hệ sinh thái, sông ngòi, cũng như hệ thống các loài động thực vật. Các vùng tự nhiên của Việt Nam có nhiều loài và nhiều trong số đó không tìm thấy ở nơi khác trên thế giới. Các nghiên cứu nhằm tìm kiếm các loài mới, đánh giá chi tiết về mức độ đa dạng của hệ thống động thực vật ở Việt Nam đã và đang được tiếp tục thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều loài ở Việt Nam chưa được nghiên cứu chi tiết bởi nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình nghiên cứu. Cụ thể, trong 15 năm trở lại đây, năm loài Mang (Muntiacus) đã được tìm thấy ở Việt Nam dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có ở trong nước [7 , 12 , 42]. Mặc dù vậy, vẫn chưa có các nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di truyền cũng như quan hệ tiến hóa giữa các loài Mang trên lãnh thổ Việt Nam. Điều này một phần do tính quý hiếm, khó bắt gặp cùng tập tính nhút nhát của các loài Mang. Ngoài ra, chúng đã được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu, sắp nguy cấp và nguy cấp trong sách đỏ thế giới. Do đó, việc điều tra sử dụng các phương pháp truyền thống có thể không đánh giá được chính xác mức độ đa dạng trong nhóm này, vì những mẫu thu được từ điều tra thực địa hầu như không cho phép thực hiện những nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng về mặt hình thái. Trong khi đó, với sự phát triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây, những phương pháp sử dụng ADN đã dần trở thành những công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể những loài khó bắt gặp và có thể giúp làm sáng tỏ những mối quan hệ tiến hóa của những loài được nghiên cứu. Trong hoàn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu không trực tiếp dựa, và các chỉ thị phân tử ADN đối với các mẫu Mang hứa hẹn có hiệu quả cao. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài Mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, cũng như phân bố, cùng mối quan hệ tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nhóm Mang 1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới Mang là một nhóm các loài thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm này hiện nay trên thế giới cho đến nay, dựa theo dữ liệu thu được của sách đỏ thế giới (The IUCN red list of threatended species) được xác định có 13 loài (Bảng 1). Mang có cơ thể nhỏ, sống đơn độc hoặc theo các nhóm nhỏ, môi trường sống của chúng thường là các khu rừng xanh nhiệt đới ở châu Á với độ cao tương đối lớn. Rất nhiều loài Mang hiện đang bị đe dọa bởi tình trạng săn bắn bất hợp pháp, cũng như tình trạng mất dần môi trường sống của chúng [20 , 30]. Hiện nay, một vài loài Mang như Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang Reeve (Muntiacus reevesi) đang được tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35]. Tuy nhiên, phần lớn các loài Mang khác đều chưa có các nghiên cứu cụ thể. Do đó, thông tin về các loài này còn rất ít, thậm chí một số loài Mang đã không được phát hiện cho đến cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21 (như Mang Roosevelt ở Việt Nam - Lào, Mang Ghongshan ở tây nam Trung Quốc, Mang lớn ở vùng biên giới Việt Nam Lào) [30]. Loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) từ sau khhi được mô tả năm 1932 rất hiếm khi được bắt gặp, cho đến năm 1999 được tái phát trở lại tại hiện tại Lào, mặc dù vậy các mẫu tìm thấy chỉ là các mẩu xương nhỏ sọ [7]; và từ thời điểm 1999 cho đến nay chưa có công bố của nghiên cáo nào cho thấy sự xuất hiện của loài này. Loài Mang Putao (M. putaoensis) được mô tả năm 1999 [6] có vùng phân bố ở phía Bắc Myanmar có quan hệ rất gần với 2 loài Mang khác có khu phân bố ở trong dãy Trường Sơn là Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang Roosevelt (M. rooseveltorum). Ba loài này có hình thái nhỏ và nhiều đặc điểm khá giống nhau kể cả về quan hệ di truyền [6 , 23]. Mang vàng Borneo (Muntiacus 2 atherodes) là loài đặc hữu ở Borneo. Trong suốt một thời gian dài, đã có sự nhầm lẫn giữa loài Mang vàng Borneo và loài Mang thường [30]. Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới STT Tên loài Phân bố 1 Muntiacus atherodes Đảo Borneo (Brunei, Indonesia và Malaysia) 2 Muntiacus crinifrons Trung Quốc 3 Muntiacus feaes Myanmar, Thái Lan 4 Muntiacus gongshanensis Trung Quốc, Myanmar 5 Muntiacus montanus Indonesia 6 Muntiacus muntjak Bruine, Indonesia, Malaysia, Thái Lan 7 Muntiacus vaginalis 8 Muntiacus puhoatensis Việt Nam 9 Muntiacus putaoensis Ấn độ, Myanmar 10 Muntiacus reveesi Trung Quốc, Đài Loan 11 Muntiacus rooseveltorum Lào, Việt Nam 12 Muntiacus truongsonensis Lào, Việt Nam 13 Muntiacus vuquangensis Lào, Việt Nam Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc. Nhóm Mang hiện được các nhà tiến hóa rất quan tâm bởi sự đa dạng trong số lượng nhiễm sắc thể giữa các loài Mang. Cụ thể, ở Mang thường, đây là cũng là loài thú có số lượng nhiễm sắc thể ít nhất với 2n = 6 ở giống cái và 2n = 7 ở giống đực; Mang Trung Quốc (M. reevesi) có 2n = 46 ở cả hai giới, M. crinifrons 2n = 8 ở giống cái và 2n = 9 ở giống đực, M. feae 2n = 13 ở giống cái và 2n = 14 ở giống đực [44]. Tuy nhiên, cho đến nay, nguyên nhân của hiện tượng này còn chưa được biết rõ. 3 1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam Hiện nay, Việt Nam được thống kê có 5 loài Mang sinh sống [7 , 12 , 42] bao gồm: Mang Ấn Độ (M. vaginalis) [42], Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) [10], Mang Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) [36], Mang Vũ Quang hay Mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis hay Muntiacus vuquangensis) [40 , 43]. Sau đây là một số mô tả về 5 loài Mang được xác định là có thể có mặt ở Việt Nam. 1.1.2.1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis) Mang Ấn Độ (M. vaginalis) hay Mang thường (common muntjac) là tên gọi thông thường của loài Mang này (Hình 1). Loài này, con đực có sừng nhỏ dài khoảng 15cm và chỉ có duy nhất 1 nhánh. Mang Ấn Độ đôi lúc còn được gọi là “Mang sủa” bởi tiếng kêu đặc trưng của nó khi có nguy hiểm. Những bằng chứng cổ sinh vật học cho thấy Mang Ấn Độ đã xuất hiện ít nhất là từ cuối kỷ Pleistocene cách đây 12.000 năm. Loài này thường bị săn bắn để lấy da và thịt. Mang Ấn Độ là loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang. Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet, Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân bố về địa lý [16]. 4 1.1.2.2. Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) Loài Mang này được mô tả một cách ngẫu nhiên trong một bài báo phổ thông [10] dựa trên cơ sở các mẫu gạc và một phần trán được Lê Trọng Trải và Đỗ Tước thu được từ khu vực Pù Hoạt, Quế Phong, Nghệ An, Việt Nam vào năm 1997 [41]. Tuy vậy, loài Mang này chưa từng được nghiên cứu chi tiết về mặt hình thái cũng như chưa từng được đưa vào những nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại để đánh giá tính xác thực về mặt di truyền. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiến hành phân tích di truyền cho loài này dựa trên các mẫu được xác định về mặt hình thái là của loài Mang Pù Hoạt. 1.2.3. Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) Loài Mang Roosevelt được mô tả vào năm 1932 bởi Osgood [33] và trong suốt 60 năm tiếp theo không có bất kỳ mẫu vật nào được ghi nhận. Loài này được ghi nhận tại 3 địa điểm ở Lào, và các mẫu thu được từ thợ săn đều là các mẫu vật không nguyên vẹn. Cụ thể, vào tháng 2 năm 1995, hai mẫu xương sọ gần như nguyên vẹn và 6 phần xương sọ khác đã được tìm thấy tại Lào [7]. Loài này hiện nay được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu trong danh sách đỏ thế giới (IUCN). Hiện nay phân loại cho loài này còn khá nhiều tranh cãi. Về mặt hình thái, loài này rất khó phân biệt với các loài Mang có quan hệ gần khác như Mang Putao và Mang Trường Sơn. Nguyên nhân của vấn đề này là bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật cho đến nay rất ít [42]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào, chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này. Khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở Việt Nam [28]. Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di 5 truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn Xuân Liên, kết quả cho thấy, trong loài này có những nhánh tiến hóa riêng biệt. Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu bảo tồn. Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể trong hai khu bảo tồn [4]. Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) 1.2.4. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) hay còn được gọi là Mang lớn (Giant muntjac hay Megamuntiacus vuquangensis) (Hình 2). Vào năm 1994 nhóm nghiên cứu của Tổ chức Bảo tồn Động vật Hoang dã (Wildlife Conservation Society) đã tìm thấy một số mẫu sừng có kích thước lớn bất thường của nhóm Mang tại các ngôi làng thuộc dãy Trường Sơn ở phía Đông trung tâm Lào, gần với biên giới VN và họ cũng tìm thấy một con đực có sừng Mang các đặc điểm tương tự bị nhốt ở một gánh xiếc vào tháng 3 năm 1994. Với kích thước lớn và có nhiều đặc điểm hình thái khác biệt với các loài đã mô tả, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết về khả năng đây là một loài mới [17 , 40]. Trong giai đoạn này, các mẫu sừng và hộp sọ có các đặc điểm tương tự cũng được tìm thấy xung quanh khu bảo tồn Vũ Quang ở Việt Nam [38], và ở một số khu vực khác cùng địa bàn trên [12]. Vì vậy, loài Mang lớn (Megamunticus vuquangensis) đã được mô tả vào năm 1994. Chúng đã được chứng minh là một loài mới dựa trên cơ sở về kích thước và sự sai khác của trình tự 6 ADN của các gen ty thể giữa Mang lớn, Mang Ấn Độ, Mang Trung Quốc (Muntiacus reevesi) [19]. Vncreatures W. Robichaud Hình 3. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) 1.2.5. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) Về mặt hình thái, Mang Trường Sơn (Hình 3) được mô tả có kích thước cơ thể nhỏ hơn Mang Ấn Độ. Chúng có màu đen, trọng lượng xấp xỉ 15kg; đuôi rộng và ngắn, đen ở đỉnh đồng thời có dải trắng bên dưới. Hộp sọ của Mang Trường Sơn nhỏ hơn so với Mang thường, gạc chính ngắn [36]. Trình tự ADN của 6 mẫu có đặc điểm nhận dạng của Mang Trường Sơn cho thấy đây là loài Mang khác với các loài đã biết. Với phát hiện mới này, đây là loài móng guốc thứ 3 được xác nhận là loài mới ở Việt Nam trong vòng 5 năm. Mang Trường Sơn là loài Mang thứ hai được tìm thấy và mô tả ở dãy Trường Sơn là loài mới sau Mang Vũ Quang (M. vuquangensis). Các mô tả này dựa trên hình thái xương sọ, trình tự ADN và thông qua phỏng vấn người dân [36]. Trong các loài trên, ngoại trừ loài Mang Ấn Độ, bốn loài Mang còn lại đều được tìm thấy trong vòng 15 năm trở lại đây hoặc dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có mặt trong nước. Những loài Mang cho đến nay vẫn được coi là không có ở Việt Nam nhưng phân bố ở gần biên giới , như loài M. reevesi có thể có mặt ở nước ta nếu có những điều tra chi tiết hơn ở khu vực phía Bắc. Đồng thời loài Mang 7 Pù Hoạt được mô tả vào năm 1997 cho đến nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào ở cấp độ phân tử để đánh giá tính xác thực của loài này. Hơn nữa, Việt Nam có thể còn có những loài ẩn sinh chưa được biết đến. Để hiểu rõ hơn mức độ đa dạng của nhóm này ở nước ta, xác định những thông tin cơ bản như vùng phân bố và số lượng chính xác của các loài thuộc nhóm Mang cần có những nghiên cứu chi tiết hơn đặc biệt cần có những nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền [2]. 2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử 2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử dụng trong nghiên cứu Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào. Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu hình thái cho thấy một số hạn chế, cụ thể như ở các loài rất xa nhau nhưng do hiện tượng đồng hình nên có hình thái giống nhau, hay ở một số trường hợp, đặc điểm kiểu hình rất khó quan sát như ở các vi sinh vật [1]. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một số phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử [1]. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) để giúp xây dựng cây phát sinh chủng loại. Trong đó, việc sử dụng chỉ thị là trình tự ADN cho hiệu quả và độ tin cậy cao trong các nghiên cứu [25]. Trong trường hợp này, các dấu hiệu phân tử (chủ yếu là nucleotide) có thể khắc phục những khó khăn của phương pháp phân loại dựa trên hình thái [1]. Hiện nay có một số phương pháp cơ bản sử dụng chỉ thị ADN để xác định các mối quan hệ di truyền như: Microsatellites, RFLP (restriction fragment length polymorphisms), giải trình tự ADN (DNA sequence). Với phương pháp giải trình tự (DNA sequence) các vùng gen cần thiết được nhân lên bằng phản ứng PCR để tiến hành xác định chính xác trình tự các nucleotide trên đoạn gen mong muốn. Dựa vào 8 tốc độ biến đổi của các nucleotide trên các vùng gen, chúng ta có thể xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Cụ thể, mức độ thay thế các nucleotide tại mỗi vùng ADN của hệ gen là khác nhau và phụ thuộc áp lực chọn lọc tự nhiên trên mỗi locut và chức năng của sản phẩm gen. Tuy vậy, ở các locut có áp lực chọn lọc tương đương thì tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN là ổn định, khi xét trong quãng thời gian tiến hóa lâu dài. Quan hệ di truyền giữa tất cả các dạng sống đều có thể được xác định dựa trên việc so sánh các chỉ thị phân tử giữa chúng với nhau. Có nhiều phương pháp được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Một trong nhưng phương pháp cơ bản nhất là xây dựng sơ đồ hình cây dựa trên các chỉ thị di truyền để mô tả mối quan hệ giữa các loài, gọi là cây phát sinh chủng loại hay cây tiến hóa (Phylogenetic tree). Ngoài việc khắc phục được một số hạn chế của phân loại học truyền thống, nó cũng có nhiều ưu điểm khác như: kết quả thí nghiệm thường khách quan, chính xác, không phụ thuộc vào chủ quan của người quan sát như trong phân loại học dựa trên hình thái [25]. Cơ sở phân loại của phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự ADN được xây dựng từ bốn nucleotide là giống nhau ở mọi sinh vật do đó tiện so sánh, nghiên cứu ngay cả ở những sinh vật khác xa nhau [25]. Sự sai khác trong các trình tự ADN được xem là kết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo thời gian. Do vậy, các nhà khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng việc so sánh các trình tự ADN và phân tích sử dụng các thuật toán xác suất. Cây phát sinh chủng loại thể hiện đa dạng di truyền, mối quan hệ và tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Dựa trên loại thuật toán xác suất được sử dụng để phân tích dữ liệu, người ta chia thành nhiều phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại khác nhau. Phân tích phát sinh chủng loại sử dụng trình tự ADN là một phần quan trọng trong các nghiên cứu như: sinh học phân tử, sinh học phát triển, di truyền học quần thể, tiến hóa và đa dạng sinh học [25]. Mỗi cây phát sinh chủng loại thường chỉ là một phần của cây tiến hóa xuất phát từ một tổ tiên chung. Tận cùng của mỗi cây phát sinh chủng loại thường là một hoặc một số taxon. Điểm nằm giữa phân nhánh (node) đại diện cho tổ tiên chung của các nhóm loài riêng biệt trước khi phân li tiến hóa. Chiều dài mỗi nhánh thể hiện mức 9 độ khác biệt giữa các taxon. Các cây tiến hóa có điểm xác định tổ tiên chung gọi là các cây tiến hóa có gốc (root trees), ngược lại, các cây tiến hóa không gốc (unroot trees) chỉ phản ánh mối quan hệ và sự sai khác giữa các taxon. Số lượng cây tiến hóa tăng lên cùng với số lượng taxon nghiên cứu (Bảng 2) [1]. Cụ thể, số cây phát sinh chủng loại có gốc (NR) và không gốc (NU) tương ứng là: NR = (2n-3)!/[2n-2(n-2)!] với n ≥ 2 (Phương trình 2.1) NU = (2n-5)!/[2n-3(n-3)!] với n ≥ 3 (Phương trình 2.2) Dù vây, việc xây dựng cây tiến hóa nào cũng đều cần đến nhóm ngoài, hay còn gọi là các taxon đối chứng [1 , 34]. Bảng 2. Số lượng cây không gốc và có gốc với số lượng taxon từ 2-10 Số Số lượng Số lượng taxon cây không gốc cây có gốc 2 1 1 3 1 3 4 3 15 5 15 105 6 105 945 7 945 10395 8 10395 135135 9 135135 2027025 10 2027025 34459425 2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh Để xác định được cây loài phát sinh, các dữ liệu ADN thường được phân tích bằng các thuật toán xác suất. Hiện nay nhiều dạng thuật toán khác nhau được dùng trong các phần mềm máy tính là cơ sở của nhiều phương pháp xây dựng cây loài phát sinh khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), neighbour joining, tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) và Bayesian. Trong nghiên này, chúng tôi sử dụng đồng thời 3 phương 10 pháp là tiết kiệm tối đa (MP), hợp lý tối đa (ML) và Bayesian nhằm so sánh các kết quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng. Ba phương pháp kể trên đều đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34]. 2.2.1. Ma trận khoảng cách (Distance matrix) Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa. Trong số đó, thuật toán UPGMA (unweighted pair group with arithmetic mean) phân tích tất cả các dấu hiệu, qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp nhóm từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền ngắn nhất. Thuật toán này coi tốc độ tiến hóa của các nucleotide là như nhau ở mọi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, điều này không phải lúc nào cũng đúng, bởi vì tốc độ tiến hóa tại các vùng gen khác nhau có tốc độ khác nhau phụ thuộc sản phẩm chúng mã hóa và áp lực chọn lọc đối với vùng gen đó [1]. Do vậy, ưu điểm của thuật toán này là có tốc độ phân tích nhanh và đơn giản, UPGMA sẽ phù hợp nhất khi sử dụng với cây tiến hóa có tốc độ tiến hóa ở các nhánh là như nhau. Thuật toán này cũng sẽ dùng phù hợp để xử lý một lượng lớn dữ liệu, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài, nhưng không phản ánh được tiến hóa ở mỗi gen [1]. 2.2.2. Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony) Phương pháp này được đề xuất vào năm 1963 bởi Edwards và Cavalli-Sforza [15]. Tích phân tiến hóa là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên hệ dữ liệu là các trình tự ADN, so sánh các vị trí giữa các nucleotide tương ứng trong hệ dữ liệu ADN này. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi phương pháp này dựa trên nguyên tắc sinh học “đột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật toán này cho rằng cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có số đột biến thấp nhất trong tất cả các cây có thể tìm được giữa các taxon được phân tích [1 , 34]. Thuật toán của tích phân tiến hóa đầu tiên sẽ xác định tất cả các vị trí có giá trị thông tin bằng cách so sánh tất cả các trình tự nucleotide tại mỗi vị trí, rồi từ xác định ra cây cần ít đột biến nhất tại mỗi vị 11 trí. Cây phát sinh nào cần ít đột biến nhất khi xét tại tất cả các vị trí được gọi là cây tiến hóa phỏng đoán. Đây là cây được cho là gần với cây tiến hóa đúng nhất. Với phương pháp này, chúng ta có thể dự đoán tổ tiên của mỗi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, tốc độ biến đổi giữa các nucleotide là không như nhau, ví dụ như các đột biến đồng hoán có tỷ lệ xảy ra cao gấp 3 lần các đột biến dị hoán. Bởi vậy đôi khi phương pháp tiêt kiệm tối đa có thể không phản ánh đúng về thời điểm xảy ra sự tách ly tiến hóa giữa các loài vì tốc độ tiến hóa của các nucleotide giữa các nhánh là khác nhau [1]. 2.2.3. Hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) Phương pháp hợp lý tối đa là một phương pháp xác suất thuần túy. Phương pháp này đánh giá một giả thuyết tiến hóa bằng việc xây dựng tất cả cây tiến hóa có thể có dựa trên mô hình tiến hóa và cơ sở dữ liệu đưa vào, rồi từ đó xác định cây có xác suất xảy ra cao nhất. Phương pháp này thường được xem là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn các phương pháp khác [1]. Tuy nhiên, khi dữ liệu đưa vào lớn thì số cây phát sinh chủng loại thu được sẽ trở nên rất lớn (với số taxa > 30 thì số cây phát sinh chủng loại thu có thể có > 5x1038 [1]) từ đó khiến khả năng tính toán rất chậm. Do vậy, phương pháp này bước đầu sẽ chỉ được áp dụng với một số lượng dự liệu nhỏ và với các mẫu có đủ số liệu. 2.2.4. Bayesian Trong phân tích Bayesian, kết quả về phát sinh chủng loại dựa trên xác suất hậu nghiệm thu được qua cây phát sinh chủng loại. Bayesian là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng Markov Chain Monte Carlo (MCMC) có kết hợp của mô hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào, từ đấy tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây. Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mô hình vào, cơ sở dữ liệu. Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp nhận và sử dụng rộng rãi như là một phương pháp tin cậy trong xây dựng cây phát sinh chủng loại [22]. 12