Tài liệu Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu và sử dụng vi sinh vật tạo nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine và protein từ cua đồng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------- Nguyễn Thu Hiền LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------- Nguyễn Thu Hiền Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành tốt được luận văn này, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: TS. Lê Chiến Phương là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kiến thức chuyên môn, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn thầy đã giúp em gắn kết được khoa học với thực tiễn cuộc sống. TS. Trần Thanh Thủy đã nhiệt tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến để em hoàn thành đề tài này. Các thầy cô đã giảng dạy trong suốt khóa học để em có được kiến thức nền. Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn của em. Các anh chị cán bộ phòng Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các chị học viên lớp vi sinh khóa 21 luôn giúp đỡ em trong suốt khóa học. Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ, những người thân yêu luôn bên cạnh, động viên con hoàn thành luận văn này. Nguyễn Thu Hiền MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục kí hiệu và các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Danh mục các sơ đồ, biểu đồ và đồ thị MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. Tổng quan về glucosamine...................................................................................3 1.1.1. Khái quát về glucosamine ..........................................................................3 1.1.2. Nguồn thu nhận glucosamine trong tự nhiên .............................................3 1.1.3. Tác dụng dược lý của glucosamine ............................................................5 1.1.4. Tình hình sản xuất và sử dụng glucosamine hiện nay ...............................6 1.2. Tổng quan về protein ...........................................................................................6 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu .....................................................................................6 1.2.2. Cấu trúc protein ..........................................................................................7 1.2.3. Chức năng sinh học ....................................................................................8 1.2.4. Nguồn cung cấp protein trong tự nhiên và nhu cầu sử dụng protein của cơ thể người ...................................................................................................8 1.2.4.1. Nguồn cung cấp protein...............................................................................8 1.2.4.2. Nhu cầu sử dụng protein của cơ thể người ...........................................10 1.3. Tổng quan về nguyên liệu cua đồng ..................................................................10 1.3.1. Vị trí phân loại của cua đồng ...................................................................10 1.3.2. Khu vực phân bố ......................................................................................10 1.3.3. Đặc tính sinh học ......................................................................................11 1.3.3.1. Hình thái ........................................................................................................11 1.3.3.2. Cấu tạo bộ vỏ................................................................................................11 1.3.4. Thành phần dinh dưỡng và tình hình sử dụng nguyên liệu cua đồng hiện nay ...........................................................................................................12 1.3.4.1. Giá trị dinh dưỡng .......................................................................................12 1.3.4.2. Tình hình sử dụng cua nguyên liệu hiện nay .......................................12 1.3.5. Giá trị thực tiễn của cua đồng ..................................................................13 1.3.5.1. Nguồn thực phẩm ........................................................................................13 1.3.5.2. Cua trong đông, nam dược .......................................................................13 1.3.5.3. Những biến đổi bất lợi từ cua đồng ........................................................14 1.4. Tổng quan về các giống vi sinh vật sử dụng ......................................................16 1.4.1. Nấm mốc Aspergillus niger .....................................................................16 1.4.1.1. Vị trí phân loại .............................................................................................16 1.4.1.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................16 1.4.1.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của A.niger ....................17 1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp chitinase của A.niger .........................................................................18 1.4.1.5. Ứng dụng của A.niger và enzyme chitinase .........................................19 1.4.2. Vi khuẩn Lactobacillus casei ...................................................................20 1.4.2.1. Vị trí phân loại .............................................................................................20 1.4.2.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................20 1.4.2.3. Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men lactic ........................................20 1.4.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của L.casei...21 1.4.2.5. Các ứng dụng của vi khuẩn lactic và L.casei.......................................23 1.4.3. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens .......................................................25 1.4.3.1. Vị trí phân loại .............................................................................................25 1.4.3.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................25 1.4.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens .........................................................................................................................25 1.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp protease của B.amyloliquefaciens ..................................................26 1.4.3.5. Các ứng dụng của B.amyloliquefaciens và protease ..........................28 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................29 2.1. Vật liệu ...............................................................................................................29 2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................29 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................29 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .................................................29 2.1.4. Các môi trường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu ...............................29 2.2. Phương pháp.......................................................................................................30 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái, các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật ................................................................................................30 2.2.1.1. Phương pháp quan sát hình thái A.niger .............................................30 2.2.1.2. Phương pháp quan sát hình thái, đặc tính sinh học của vi khuẩn L.casei và B.amyloliquefaciens...............................................................32 2.2.1.3. Xác định sinh khối tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .....35 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và xác định hoạt độ enzyme ..............36 2.2.2.1. Nuôi cấy và xác định hoạt độ chitinase của A.niger ..........................36 2.2.2.2. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của A.niger..................................................................................37 2.2.2.3. Phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens ...................................................................................38 2.2.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của B.amyloliquefaciens ..........................................................40 2.2.3. Phương pháp khảo sát thành phần môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp acid của L.casei ................................................41 2.2.3.1. Khảo sát môi trường lên men ...................................................................41 2.2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp acid của L.casei ....................................................................................................43 2.2.4. Phân tích các chỉ tiêu của nguyên liệu và sản phẩm ................................43 2.2.4.1. Xác định độ ẩm ...........................................................................................43 2.2.4.2. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl ...........44 2.2.4.3. Xác định hàm lượng Nitơ formol (N formol ) theo phương pháp Sorensen .......................................................................................................45 2.2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amoniac (N amoniac ) theo phương pháp chưng cất ......................................................................................................46 2.2.4.5. Xác định hàm lượng calci ........................................................................47 2.2.4.6. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành (phương pháp ElsonMorgan) ........................................................................................................48 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................50 3.1. Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh học của các vi sinh vật ....................50 3.1.1. Bacillus amyloliquefaciens.......................................................................50 3.1.1.1. Hình thái ........................................................................................................50 3.1.1.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................50 3.1.2. Lactobacillus casei ...................................................................................51 3.1.2.1. Hình thái ........................................................................................................51 3.1.2.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................51 3.1.3. Aspergillus niger ......................................................................................52 3.1.3.1. Hình thái ........................................................................................................52 3.1.3.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................52 3.2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật ............................................53 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy 53 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường .................................................................................................................54 3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường......55 3.2.4. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase theo nồng độ chất cảm ứng ..............57 3.2.5. Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy ...................................................................................................58 3.2.6. Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo nhiệt độ môi trường ...............................................................................................59 3.2.7. Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo pH môi trường ......................................................................................................61 3.3. Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng được tổng hợp bởi L.casei ....................62 3.3.1. Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng theo thành phần môi trường .......62 3.3.2. Kết quả khảo sát lượng acid tổng tạo ra theo hàm lượng đường .............65 3.3.3. Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo thời gian ....................67 3.3.4. Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo nhiệt độ môi trường ..68 3.3.5. Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo pH môi trường ..........69 3.3.6. Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp acid bởi L.casei .................................................................................................................70 3.4. Kết quả định danh B.amyloliquefaciens và L.casei ...........................................72 3.4.1. Kết quả định danh B.amyloliquefaciens ...................................................72 3.4.2. Kết quả định danh L.casei ........................................................................72 3.5. Kết quả chế biến sản phẩm.................................................................................73 3.5.1. Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu ...............................................73 3.5.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ cua xay: nước ........................................................73 3.5.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.amyloliquefaciens cho vào hỗn hợp cua đồng xay ..................................................................................................74 3.5.4. Kết quả phân tích hàm lượng N tổng số, N formol, N amoniac sinh ra trong quá trình thủy phân hỗn hợp cua đồng xay bởi B.amyloliquefaciens ............77 3.5.5. Kết quả khảo sát tỉ lệ dịch lên men bởi L.casei cho vào vỏ cua xay .......78 3.5.6. Kết quả khảo sát hàm lượng khoáng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian...................................................................................................80 3.5.7. Kết quả khảo sát hàm lượng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian sau khi bổ sung thêm đường ...........................................................82 3.5.8. Kết quả khảo sát tỉ lệ sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường cho vào phần vỏ cua xay (chitin) đã được loại khoáng...........................85 3.5.9. Kết quả cảm quan sản phẩm, phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm .................................................................89 3.5.9.1. Cảm quan sản phẩm....................................................................................89 3.5.9.2. Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm ...............................................90 3.5.9.3. Phân tích chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm ......................................91 3.6. Quy trình chế biến sản phẩm..............................................................................91 3.6.1. Sơ đồ quy trình .........................................................................................92 3.6.2. Thuyết minh quy trình ..............................................................................93 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................95 4.1. Kết luận ..............................................................................................................95 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................96 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................97 PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT CP Môi trường cá pepton CFU/ml Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml mẫu ĐC Đối chứng ĐVHT Đơn vị hoạt tính EDTA Acid etylen diamin teraaxetic MRS de Man, Rogosa and Sharpe MT Môi trường OD Trị số mật độ quang VK Vi khuẩn TCA Trichloroacetic DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Nguồn cung cấp protein ...........................................................................9 Bảng 1.2. Hàm lượng acid amin trong một số protein động vật và thực vật ...........9 Bảng1.3. Thành phần dinh dưỡng của cua đồng ...................................................12 Bảng 1.4. Một số nguyên liệu được dùng để lên men acid lactic ..........................23 Bảng 1.5. Thành phần hóa học của dịch tương đậu nành và sữa đậu nành ...........24 Bảng 2.1. Đường chuẩn glucosamine ....................................................................37 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm với enzyme ................................................................39 Bảng 2.3. Đường chuẩn tyrosin..............................................................................40 Bảng 2.4. Thành phần các chất bổ sung vào môi trường .......................................42 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái B.amyloliquefaciens ...............................................50 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái L.casei ....................................................................51 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái A.niger ....................................................................52 Bảng 3.4. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian .........................................53 Bảng 3.5. Hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường .......................54 Bảng 3.6. Hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường ..............................56 Bảng 3.7. Hoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng ...................57 Bảng 3.8. Hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy ......58 Bảng 3.9. Hoạt độ protease theo nhiệt độ môi trường ...........................................60 Bảng 3.10. Hoạt độ protease của B. amyloliquefaciens theo pH môi trường ..........61 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hàm lượng acid tổng ........63 Bảng 3.12. Hàm lượng acid tổng sinh ra theo hàm lượng đường ............................65 Bảng 3.13. Hàmlượng acid tổng tạo ra theo thời gian .............................................67 Bảng 3.14. Hàm lượng acid tổng tạo ra theo nhiệt độ môi trường ..........................68 Bảng 3.15. Hàm lượng acid tổng tạo ra theo pH môi trường...................................69 Bảng 3.16. Hàm lượng acid tổng tạo ra theo tỉ lệ giống ..........................................71 Bảng 3.17. Thành phần nguyên liệu cua xay ...........................................................73 Bảng 3.18. Tỉ lệ nước cho vào hỗn hợp cua xay .......................................................74 Bảng 3.19. Tỉ lệ giống B.amyloliquefaciens sử dụng thủy phân hỗn hợp cua đồng xay..........................................................................................................75 Bảng 3.20. Chỉ số N tổng số, N formol, N amoniac ................................................................77 Bảng 3.21. Tỉ lệ vỏ cua xay: dịch lên men bởi L.casei ............................................79 Bảng 3.22. Hàm lượng khoáng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian ......81 Bảng 3.23. Hàm lượng đường bổ sung vào hỗn hợp vỏ cua xay và dịch lên men bởi L.casei ....................................................................................................83 Bảng 3.24. Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường=1:1 .......................................................86 Bảng 3.25. Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường=1:5 .......................................................86 Bảng 3.26. Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường=1:10 .....................................................87 Bảng 3.27. Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường=1:15 .....................................................87 Bảng 3.28. Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường=1:20 .....................................................88 Bảng 3.29. Các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm bột cua đồng xay .....................90 Bảng 3.30. Các chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm trong 100g bột cua xay ...........91 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử glucosamine .....................................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử và hệ thống sợi chitin ......................................................4 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử acid amin và mạch polypeptide .......................................7 Hình 1.4. Bốn bậc cấu trúc của protein .......................................................................8 Hình 1.5. Hình thái cua đồng ....................................................................................11 Hình 1.6. Cấu tạo bộ vỏ của cua đồng ......................................................................11 Hình 1.7. Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết ...................................14 Hình 1.8. Sơ đồ chuyển hóa lên men lactic đồng hình và dị hình ............................21 Hình 3.1a. Hình thái đại thể B.amyloliquefaciens.........................50 Hình 3.1b. Hình thái vi thể B.amyloliquefaciens .....................................................50 Hình 3.2. Vòng phân giải casein của B.amyloliquefaciens ......................................50 Hình 3.3a. Hình thái đại thể L.casei .......................................................................51 Hình 3.3b. Hình thái vi thể L.casei ..........................................................................51 Hình 3.4. Khả năng làm đông tụ sữa của L.casei....................................................51 Hình 3.5. Khả năng làm đổi màu thuốc thử Ufermen của L.casei ..........................52 Hình 3.6a. Hình thái đại thể A.niger ............................................52 Hình 3.6b. Hình thái vi thể A.niger .........................................................................52 Hình 3.7. Vòng phân giải huyền phù chitin ............................................................52 Hình 3.8. Sản phẩm bột cua xay được xử lý bằng phức hệ vi sinh vật. .................90 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Sơ đồ 2.1. Quy trình bố trí thí nghiệm ......................................................................30 Đồ thị 3.1. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy ...........................53 Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nhiệt độ môi trường ......................55 Đồ thị 3.3. Biến thiên hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường...............56 Đồ thị 3.4. Biến thiênhoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng .....57 Đồ thị 3.5. Biến thiên hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian .....59 Đồ thị 3.6. Biến thiên hoạt độ protease theo nhiệt độ môi trường ............................60 Đồ thị 3.7. Biến thiên hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo pH môi trường ...............................................................................................................62 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hàm lượng acid tổng .......64 Biểu đồ 3.9. Sự biến thiên lượng acid tổng theo hàm lượng đường .........................66 Biểu đồ 3.10. Sự biến thiên lượng acid tổng theo thời gian .....................................67 Biểu đồ 3.11. Sự biến thiên lượng acid tổng theo nhiệt độ môi trường ....................68 Biểu đồ 3.12. Sự biến thiên lượng acid tổng theo pH môi trường ............................70 Biểu đồ 3.13. Sự biến thiên lượng acid tổng theo tỉ lệ giống ...................................71 Biểu đồ 3.14. Sự biến thiên N formol khi bổ sung các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian thủy phân ...................................................................................76 Đồ thị 3.15. Sự biến thiên N tổng số , N formol và N amoniac theo thời gian thủy phân ......78 Biểu đồ 3.16. Sự biến thiên hàm lượng Ca2+ hòa tan vào môi trường dịch lên men 80 Biểu đồ 3.17. Sự biến thiên hàm lượng Ca2+ hòa tan theo thời gian ........................81 Biểu đồ 3.18. Sự biến thiên lượng acid tổng và pH môi trường trong thời gian trích ly calci................................................................................................82 Biểu đồ 3.19. Hàm lượng Ca2+ hòa tan khi bổ sung các lượng đường khác nhau ...84 Đồ thị 3.20. Hàm lượng acid tổng tạo ra khi bổ sung các lượng đường khác nhau ...........................................................................................................84 Biểu đồ 3.21. Sự biến đổi hàm lượng glucosamine theo các tỉ lệ chitin: dịch sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường.................................88 Sơ đồ 3.1. Quy trình chế biến cua đồng xay thành nguyên liệu thực phẩm giàu các thành phần được thủy phân (protein, chitin và calci hòa tan) ...........92 1 MỞ ĐẦU Cua đồng là loại thủy sản có trữ lượng lớn và giá trị dinh dưỡng cao, được nhân dân ta sử dụng làm thực phẩm phổ biến từ lâu đời. Bởi thịt cua đồng rất thơm ngon với hàm lượng protein chiếm đến 12,3%, đồng thời lượng khoáng chất chủ yếu là calci rất dồi dào. Tuy nhiên, bộ vỏ của chúng chiếm hơn 50% trọng lượng cơ thể hầu như là phế thải. Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất glucosamine – một hợp chất tự nhiên quý, được dùng trong y học để cải thiện các bệnh về khớp như: thoái hóa khớp, tăng lượng dịch bôi trơn khớp, tăng độ bền của dây chằng khớp... Trong nhiều trường hợp, để sản xuất glucosamine, người ta phải dùng vỏ tôm đã bóc khỏi thịt và dùng hóa chất để xử lý. Nhưng việc đó không thể thực hiện đối với cua đồng, ghẹ, ba khía... Để có thể sử dụng nguyên liệu cua đồng một cách dễ dàng, chúng tôi tiến hành xử lý cả con (cả vỏ lẫn thịt), bằng phức hệ vi sinh vật tạo được nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine cùng toàn bộ protein và khoáng (chủ yếu là calci) giàu giá trị dinh dưỡng. Thông qua đó, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm từ thủy sản vỏ cứng,tăng giá trị sử dụng của nguyên liệu, cải thiện được tình trạng ô nhiễm môi trường. Chúng tôi chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine và protein từ cua đồng.” Mục đích của đề tài Tạo được nguyên liệu thực phẩm mới cho con người từ cua đồng, hạn chế phế thải ở mức tối thiểu. Nhiệm vụ của đề tài  Phân tích thành phần nguyên liệu ban đầu và nguyên liệu sau khi đã xử lý.  Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh proteaseB.amyloliquefaciens, acid- L.casei, chitinase –A.niger .  Sử dụng VSV để chế biến cua đồng thành nguyên liệu thực phẩm. 2  Đánh giá chất lượng dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm của nguyên liệu thực phẩm đã được chế biến.  Đưa ra được quy trình chế biến cua đồng thành nguyên liệu thực phẩm Nét mới của đề tài  Sử dụng sinh khối B.amyloliquefaciens thủy phân protein trong thịt và vỏ cua đồng xay để chế biến nguyên liệu thực phẩm là tác nhân thứ nhất  Sử dụng phụ phẩm của quá trình sản xuất đậu phụ chính là dịch tương đậu nành làm môi trường lên men tạo acid bởi L.casei, để trích ly calci trong vỏ cua, đồng thời bảo quản thực phẩm là tác nhân thứ hai  Sử dụng dịch sinh khối A.niger và enzyme chitinase thô để thủy phân chitin làm mềm vỏ cua là tác nhân thứ ba  Bước đầu tạo được một nguyên liệu thực phẩm mới (bột cua xay) từ những phương pháp đơn giản nhất. Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài  Thời gian: Từ tháng 1/2012 đến tháng 8/2012  Địa điểm: Phòng Công nghệ biến đổi sinh học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về glucosamine 1.1.1. Khái quát về glucosamine  Cấu trúc Glucosamine là một aminomonosaccharide, là đơn vị cấu trúc của nhiều loại polysaccharide và một số nhóm chất khác (như glycoprotein) trong các cơ thể sống. Bản chất của glucosamine là đường có chứa gốc amin được gọi là đường amino. Các loại đường amino bao gồm D- glucosamine, D- galactosamine và Dmannosamine.[65] Công thức phân tử của glucosamine: C 6 H 13 O 5 N Phân tử lượng: M phân tử glucosamine = 179,17đvC Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Tên gọi thông dụng: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine. [16] Hình 1.1. Cấu trúc phân tử glucosamine [42]  Tính chất lý hóa Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong ethanol, không tan trong ether và chloroform. [28] [42] 1.1.2. Nguồn thu nhận glucosamine trong tự nhiên Glucosamine được điều chế từ chitin, một polymer của các gốc Nacetylglucosamine nối với nhau bằng các liên kết 1,4- glycoside. Chitin là một 4 polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, một polymer sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất trên thế giới hàng năm chỉ đứng sau cellulose, trung bình một năm là 20g/m2. [51] Trong tự nhiên, chúng hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà hầu như liên kết dưới dạng chitin- protein. Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các men thủy phân gây khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng. Chitin thường thấy trong động vật không xương sống như giun tròn, chân khớp, trong thành tế bào nấm và một số loài tảo Chlorophiceae. Đối với động vật thủy hải sản, đặc biệt trong vỏ tôm, cua, mai mực… hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14%- 35% so với trọng lượng khô. Là nguồn nguyên liệu dồi dào để cung cấp chitin để chiết xuất chitosan, glucosamine phục vụ cuộc sống con người (Yildiz Bolat và cộng sự, 2010). [54][72] Hình 1.2. Cấu trúc phân tử và hệ thống sợi chitin[59], [72] Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi. [39] Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đậm đặc (HCl, H 2 SO 4 , H 3 PO 4 …). [67] Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO 4 ); oxy già (H 2 O 2 ); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin. [67] Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%) thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan. [67] 5 Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặcthì chitin bị cắt mạch thu được glucosamine. Chitin còn bị thủy giải bởi enzyme chitinase. [67] 1.1.3. Tác dụng dược lý của glucosamine Glucosamine đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp glucosaminoglycan (hay mucopolysaccharide) – một hợp chất tham gia cấu tạo nên proteoglycan. Proteoglycan là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp (chiếm 15-40% so với trọng lượng khô của sụn) cùng với collagen (60-80% so với trọng lượng khô của sụn) và nước (chiếm 70-85% tổng trọng lượng của sụn). [50] Glucosamine được hấp thu vào trong cơ thể chủ yếu ở dạng dẫn xuất của nó. Các dẫn xuất glucosamine thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: glucosamine hydrochlorua, glucosamine sulfat, acetyl glucosamine. [47] Glucosamine được sản sinh trong cơ thể người từ 4- 20g/ngày từ sự chuyển hóa glucose (Vosseller et al.2002) [47] Liều lượng glucosamine cho phép bổ sung vào cơ thể từ 0,5- 1,5g/ngày (Glaza. 2002). [43] Các bệnh liên quan đến thiếu glucosamine Đối với khớp: glucosamine đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase và giảm các gốc tự do superoxide phá hủy các tế bào sụn. [47] Khi thiếu glucosamine thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển. Và viêm khớp là bệnh khá phổ biến thường dẫn đến sự lão hóa sụn, làm khô và sưng tấy khớp xương. Hiện vẫn chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu. Thông thường nhất là sử dụng aspirin hoặc dẫn xuất ibprofan. Những thuốc chống viêm không có steroid (NSAID) có thể rất nguy hiểm. Có những chứng minh rằng sau thời gian dài sử dụng NSAIDS có thể thúc đẩy sự hủy hoại khớp xương, hơn nữa, những thuốc này có tác hại cho gan và thận. [ 23], [65] Glucosamine có thể giúp phục hồi khớp của người bệnh nhờ sự đổi chỗ glucose cho glucosamine tương tự con đường chuyển hóa glucose vào trong tế bào. 6 Glucosamine có tác dụng kích thích tạo mô liên kết, giúp điều chỉnh khớp xương, hạn chế sự thoái hóa proteoglycan và khôi phục lại sụn. [47], [66] Đối với hệ bài tiết: sự phân hủy albumin hơn mức bình thường là đặc điểm sinh hoá lên quan đến bệnh tiểu đường. Glucosamine có khả năng làm giảm tốc độ bài tiết albumin để bảo vệ chức năng thận, nên đã được thử nghiệm để chữa trị bệnh tiểu đường. Theo Skaha và cộng sự (1996), bệnh nhân bị tiểu đường sau khi uống glucosamine từ 3- 6 tuần cho kết quả tốc độ bài tiết albumin đều giảm và hiệu quả này kéo dài 3-6 tuần sau khi sử dụng thuốc. [65] Glucosamine với các tác dụng khác: glucosamine còn là thành phần cấu tạo màng tế bào và protein màng, chúng ảnh hưởng đến sự hình thành các cơ quan như: móng, tóc, da, chất hoạt dịch, màng nhầy của hệ tiêu hóa, hô hấp. [65] 1.1.4. Tình hình sản xuất và sử dụng glucosamine hiện nay Ở Đức, glucosamine được dùng hỗ trợ điều trị viêm khớp từ năm 1969. Hiện nay các nước Anh, Mỹ, Nhật, các sản phẩm là dẫn xuất của glucosamine, trong đó glucosamine sulfate và glucosamine hychlorua chiếm hơn 70% được sử dụng phổ biến để chữa bệnh viêm khớp. Ở Việt Nam sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamine, nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài, với các tên biệt dược như Gosamil (Hàn Quốc), Bosamin (Mỹ), Viatril (Ý)…[9], [75] 1.2. Tổng quan về protein 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Protein được phát hiện lần đầu tiên ở thế kỷ XVIII bởi Beccari (1745), được gọi là albumin (lòng trắng trứng). Mãi đến năm 1838, Mulder lần đầu tiên đưa ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là “đầu tiên”, “quan trọng nhất”). Biết được tầm quan trọng và nhu cầu xã hội về protein, đến nay nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất hợp chất này đã được công bố, đã đem lại nhiều ý nghĩa hết sức to lớn phục vụ cho nhân loại. [48] 7 1.2.2. Cấu trúc protein Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide gọi là chuỗi polypeptide. Hình 1.3. Cấu trúc phân tử acid amin và mạch polypeptide[48] Protein có cấu trúc rất phức tạp. Trong thành phần hóa học của protein chứa: carbon (50-55%); oxy (22-26%); nitơ (12-19%); hydro (6-8%); và lưu huỳnh (02%). Mặc dù chúng rất khác nhau về cấu trúc, chức năng, thành phần hóa học, kích thước...nhưng khi bị thủy phân chúng đều phân giải thành các axit amin. [48] Khối lượng phân tử được tính bằng dalton, thông thường từ hàng trăm đến hàng triệu dalton. Các chuỗi polypeptide có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein Cấu trúc bậc 1: là trình tự sắp xếp các acid amin trong 1 chuỗi polypeptide. Đây là bậc cấu trúc đơn giản và là cơ sở quan trọng nhất của tất cả các protein. Cấu trúc bậc 2: xảy ra khi trình tự các acid amin trong 1 chuỗi polypeptide nối với nhau bằng các liên kết hydro. Cấu trúc này có 2 kiểu cơ bản là xoắn alpha và gấp nếp beta (tấm beta) Cấu trúc bậc 3: xảy ra khi có lực hấp dẫn có mặt giữa các vùng xoắn alpha và tấm beta trong 1 chuỗi polypeptide. Hình thành cấu trúc cuộn gập hình khối cầu Cấu trúc bậc 4: protein gồm 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptide cùng loại hay khác loại kết hợp với nhau. Đây là mức cấu trúc cao nhất của protein, thường chứa vùng cấu trúc cuộn chặt gọi là các domain. [48]