Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo

  • Số trang: 109 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 53 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG ĐỨC AN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG TRONG CHĂN NUÔI HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NG ÀNH: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH MÃ SỐ: 60.54.10 NHA TRANG, 8/2008 2 MỤC LỤC MỤC LỤC 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5 DANH MỤC CÁC BẢNG 6 DANH MỤC CÁC HÌNH 7 MỞ ĐẦU 9 PHẦNI.TỔNGQUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC ...........................................................10 1.1.1. Chế phẩm sinh học là gì ? ............................................................................10 1.1.2. Thành phần của chế phẩm sinh học ............................................................11 1.1.3. Tác dụng của chế phẩm sinh học ................................................................40 1.2. VI SINH VẬT HỌC ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT .....................47 PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................50 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................50 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................50 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học ..................................................................50 2.2.1.1. Phương pháp xác định amoniac (đạm thối) bằng cách cất kéo hơi nước. ....................................................................................................................................50 2.2.1.2. Phương pháp phân tích hàm lượng H2S .............................................51 2.2.2. Phương pháp phân tích vi sinh ....................................................................52 2.2.2.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn..........................................52 2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật tổng số ..........................................53 2.2.2.3. Phương pháp kiểm tra tổng số Coliform ............................................56 2.2.2.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ......................58 2.2.2.5. Phương pháp phân lập ..........................................................................59 2.2.2.6. Phương pháp giữ giống và cấy chuyền...............................................60 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa..............60 2.2.3.1. Xác định mật độ quang.........................................................................60 3 2.2.3.2. Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn lactic ..............................60 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram ..................................................................61 2.2.3.4. Xác đinh khả năng phân hủy tinh bột và protein của vi khuẩn Bacillus ...............................................................................................................................61 2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ....................................................................62 2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm tổng quan để sản xuất chế phẩm vi sinh ..............62 2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm chế phẩm trên heo..............................62 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................64 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................65 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ..........................................................................................................65 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ tự nhiên ........................ 65 3.1.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng lactic phân lập được 66 3.1.3. Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính amylase và protease 70 3.1.4. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus phân lập và được lựa chọn.....72 3.1.5. Quan sát hình thái khuẩn lạc nhóm vi khuẩn quang dưỡng.....................74 3.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA CÁC CHỦNG ĐÃ LỰA CHỌN ......76 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới khả năng sinh trưởng của các vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng...........................................76 3.2.2. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng. .....................................................79 3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 79 3.2.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus 83 3.2.2.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng.......................................................................................................................85 3.2.2.4. Ảnh hưởng tỷ lệ giống tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng...........................................86 3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH................................................................................87 4 3.3.1. Chọn phương pháp thu hồi sinh khối của các chủng vi khuẩn................87 3.3.2. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh vật và đánh giá khả năng bảo quản của chế phẩm ............................................................................................................88 3.3.3. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng vi khuẩn đã lựa chọn và phân lập..........................................................................................................90 3.4. SƠ BỘ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG CHO CHĂN NUÔI HEO ...........................................................................................................92 3.4.1. Đánh giá mức độ ô nhiễm của phân heo ....................................................92 3.4.2. Kết quả sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi heo..................... 932 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .......................................................................... 987 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................1001 PHỤ LỤC ......................................................................................................................1032 PHỤ LỤC 1. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CÁC VI KHUẨN..........................1032 PHỤ LỤC 2. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................1054 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VSV: Vi sinh vật CFU: Colony forming units BOD (Biochemical Oxygen Demand): nhu cầu oxy sinh hóa. TSA: Tryptone Soya Agar VRB: Violet Red Bile Agar BGBL: Brilliant Green Lactose Borth SPW: Saline Pepton Water OD (Optical Density): mật độ quang TM: Cacbonat agar LA: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ND1, ND2, ND3, ND4, ND5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập nước dưa chua SC1, SC2, SC3, SC4, SC5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ sữa chua D1, D2, D3, D4, D5: Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất 6 DANH MỤC CÁC BẢNG STT 1 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Nhu cầu vitamine cần cho sự phát triển của một số loài vi khuẩn lactic Bảng 3.1. Sự thay đổi giá trị pH của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa chua và nước dưa chua theo thời gian nuôi cấy TRANG 17 64 3 Bảng 3.2. Hoạt tính enzyme protease, amylase và đường kính vòng phân giải của 5 chủng Bacillus phân lập được 70 4 Bảng 3.3. Kết quả thu hồi sinh khối của các chủng nghiên cứu (CFU/ml) 87 5 Bảng 3.4. Số lượng vi sinh vật sống của chế phẩm theo 88 6 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phân heo 91 7 Bảng 3.6. Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo mẹ 92 8 Bảng 3.7. Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo 3 tháng tuổi 92 9 Bảng 3.8. Hiệu quả tăng trọng khi sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn nuôi heo 3 tháng tuổi 95 7 DANH MỤC CÁC HÌNH STT DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG 1 Hình 1.1. Hình ảnh giống heo Landrace 55 2 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Lactobacillus acidophillus trên môi trường MRS 65 3 Hình 3.2. Hình dạng của chủng Lactobacillus acidophillus khi nhuộm tiêu bản tươi 66 4 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng ND2 trên môi trường MRS 87 5 Hình 3.4. Hình dạng của chủng ND2 khi nhuộm tiêu bản cố định 88 6 Hình 3.5. Hình dạng của chủng ND2 khi nhuộm tiêu bản tươi 91 7 Hình 3.6. Hình dạng thái khuẩn lạc của chủng SC4 trên môi trường MRS 67 8 Hình 3.7. Hình dạng của chủng SC4 khi nhuộm tiêu cố định 67 9 Hình 3.8. Hình dạng của chủng SC4 khi nhuộm tiêu bản tươi 68 10 Hình 3.9. Hình ảnh về tế bào Bacillus subtilis nuôi trên môi trường NB 71 11 Hình 3.10. Hình ảnh về tế bào vi khuẩn D3 nuôi trên môi trường NB 71 12 Hình 3.11. Hình dạng của chủng Bacillus subtilis dưới kính hiển vi quang học 72 13 Hình 3.12. Hình dạng của chủng D3 dưới kính hiển vi quang học 72 14 Hình 3.13. Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn quang hợp xanh lục và vi khuẩn tía trong ống thạch nghiêng 73 15 Hình 3.14. Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn tía khi nhuộm tiêu bản cố định 74 16 Hình 3.15. Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn xanh lục khi nhuộm tiêu bản cố định 76 8 17 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 76 18 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus 77 19 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng 79 20 Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus acidophilus 79 21 Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp1 80 22 Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp2 80 23 Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 82 24 Hình 3.23. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus sp 83 25 Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn quang dưỡng 84 26 Hình 3.25. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 85 27 Hình 3.28. Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm lượng H2S và NH3 của heo mẹ 94 28 Hình 3.29. Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm lượng H2S và NH3 của heo 3 tháng tuổi 94 9 MỞ ĐẦU Việt Nam là một đất nước với trên 75% dân số sống bằng nghề nông nghiệp. Trong sản xuất của Nông nghiệp, chăn nuôi là một lĩnh vực đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho người tiêu dùng. Trong lĩnh vực chăn nuôi ở nông thôn Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề có tỷ trọng lớn. Ngày nay do yêu cầu của thị trường nên nghề chăn nuôi heo có xu thế chuyển từ quy mô nuôi phân tán sang nuôi tập trung - nuôi công nghiệp. Do việc nuôi tập trung và nghề nuôi lại chưa được quy họach và đầu tư một cách đầy đủ dẫn tới nguy cơ ô nhiễm do các phế thải của chăn nuôi heo như: nước tiểu, phân, các vi sinh vậy gây bệnh,… Do vậy việc nghiên cứu nhằm có một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát nguồn ô nhiễm này rất cần thiết. Trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo” với mục đích sản xuất ra một chế phẩm vi sinh dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi heo dưới dạng dịch với mục đích hạn chế mùi hôi thối và làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh trong phân heo thải ra môi trường. * NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN 1) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus có hoạt tính sinh học cao từ môi trường tự nhiên. 2) Nghiên cứu các điều kiện thích hợp nuôi cấy để thu nhận sinh khối của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 3) Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh dưới dạng dịch lỏng. 4) Bước đầu thử nghiệm sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn nuôi heo để giảm thiểu ô nhiễm từ phân heo. * Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Các số liệu khoa học thu được sẽ làm phong phú thêm hiểu biết về ứng dụng của vi sinh vật trong chăn nuôi. Mặt khác kết quả nghiên của luận văn sẽ là các số liệu thực tế để bổ sung vào lĩnh vực giảng dạy môn học vi sinh vật của Trường Đại học Nha Trang. * Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Thành công của đề tài là cơ sở để ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong chăn nuôi động vật và xử lý môi trường. 10 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 1.1.1. Chế phẩm sinh học là gì ? Chế phẩm sinh học là một tập hợp các chủng vi sinh vật có ích. Đó là các tế bào sống của các chủng vi sinh vật, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi và cải thiện môi trường, đồng thời cũng có thể tác dụng dương tính đối với cơ thể con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [2]. * Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm sinh học Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là sinh trưởng nhanh. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn phụ thuộc đáng kể vào điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ hiếu khí và các yếu tố khác. Trong điều kiện thuận lợi, tế bào có thể phân chia sau 20-30 phút. Như vậy, sau 24 giờ có tới 48-72 vòng tăng đôi số lượng và từ 1 tế bào có thể đạt được khối lượng hàng ngàn tấn. Tuy nhiên, trong thực tế không thể có điều kiện lý tưởng để tăng sinh khối như vậy. Trong điều kiện nuôi cấy bình thường, vi khuẩn cần có thời gian để làm quen với môi trường mà chưa thể sinh trưởng ngay. Ở giai đoạn này, thường được gọi là pha lag. Khi đã qua giai đoạn làm quen, thì vi khuẩn bắt đầu sinh sản bằng cách nhân đôi theo cấp số nhân. Ở giai đoạn này, sinh khối tăng mạnh, các chất dinh dưỡng trong môi trường được sử dụng mạnh. Khi môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng, sự tăng trưởng dừng lại và cuối cùng tế bào già đi và chết. Tùy theo từng loại vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy mà có thể thu hồi lượng sinh khối tối đa trong khoảng thời gian thích hợp. Một trong những đặc điểm thuận lợi cơ bản khi sử dụng vi khuẩn để sản xuất chế phẩm sinh học là tốc độ sinh trưởng. Có thể nuôi cấy vi khuẩn trên cơ chất rẻ tiền và sinh ra lượng lớn sinh khối một cách ổn định. Mặt khác, vi sinh vật cũng là nguồn cung cấp những enzyme cần thiết, thực hiện quá trình sinh học trong những điều kiện đơn giản, không đòi hỏi phương pháp phức tạp. Những vi sinh vật sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học phải được lựa chọn trên cơ sở bảo toàn những đặc tính sinh học theo thời gian, không có nguy cơ biến đổi về di truyền học [14]. 11 Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học hoàn toàn có cơ sở khoa học và đáp ứng với nhu cầu thực tiễn bởi vi sinh vật trong chế phẩm sinh học có những ưu điểm cơ bản. Trước hết là diện tích nuôi cấy nhỏ, tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể thu được lượng sinh khối lớn trong vòng 20-30 giờ. Mặt khác, các enzyme sinh ra có hoạt lực cao, nguồn nguyên liệu sử dụng dễ kiếm, phong phú và rẻ tiền. Có thể thay đổi một cách dễ dàng môi trường nuôi cấy để đạt hiệu quả như mong muốn. Đặc biệt, việc sản xuất không phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết vì diện tích nhỏ nên có thể khống chế được nhiệt độ cần thiết [5]. Nói chung các vi sinh vật dùng làm chế phẩm sinh học thường phải có các đặc điểm sau đây [2]: - Có khả năng bám dính vào niêm mạc tiêu hóa của vật chủ. - Dễ nuôi cây. - Không sinh ra chất độc và không gây bệnh cho vật chủ. - Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài. - Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng. - Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non. - Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ. Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật trong chế phẩm sinh học đã được giải thích: - Cạnh tranh thức ăn và vị trí bám với các vi sinh vật gây bệnh. - Làm bất hoạt các độc tố hoặc các sản phẩm trao đổi chất có hại do các vi sinh vật gây bệnh sinh ra. - Tạo ra các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ chất kháng sinh, hydroperoxit. 1.1.2. Thành phần của chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học thường có những nhóm vi sinh vật sau: Các nhóm vi sinh vật cơ bản: - Vi khuẩn lactic. - Vi khuẩn Bacillus. 12 - Vi khuẩn quang dưỡng khử H2S-vi khuẩn tía có lưu huỳnh, vi khuẩn tía không lưu huỳnh và vi khuẩn xanh khử H2 S. - Nấm men (Saccharomyces). Các nhóm vi sinh vật phụ: - Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và Nitrobacter). - Nhóm xạ khuẩn. - Nhóm nấm mốc. Trong số này nhóm xạ khuẩn, nấm mốc thường chỉ dùng khi chế phẩm bổ sung vào phân hủy rác thải hoặc nuôi cấy chủng sinh ra một lượng enzyme đáng kể dùng bổ sung vào chế phẩm để hổ trợ sự phân hủy hợp chật hữu cơ [8]. * Vi khuẩn lactic Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, ...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Ngay từ năm 1780 nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua là kết quả của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococus lactic) và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic phân bố rộng rãi đặc biệt hay gặp trong các sản phẩm muối chua: dưa chua, cà muối, mắm chua, tôm chua, nem chua, sữa chua... Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae và chia thành hai nhóm là Streptoccaceae và Lactobacteriaceae. Mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái, gồm cả vi khuẩn hình que và hình sợi song về mặt sinh lý thì tương đối đồng nhất. Tất cả đều là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, không có enzymee oxydase, catalase và nitratreductase. Chúng có khả năng lên men, sử dụng carbohydrate là nguồn năng lượng và tạo thành acid lactic là sản phẩm cuối cùng chủ yếu hoặc duy nhất. Vi khuẩn lactic sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí [8]. 13 Vi khuẩn lactic được chia làm các giống chủ yếu sau đây [18]: * Giống Lactobacillus hình que, thường có kích thước (0,5-1,2)x(1-10)µm. Đây là loại vi khuẩn sinh acid lactic phổ biến và điển hình nhất. Kích thước của chúng thay đổi tùy loài, chẳng hạn Lactobacillus plantarum có dạng hình que xếp chuỗi hoặc đứng riêng lẽ (Pederson, 1936), Lactobacillus casei có dạng hình que ngắn hoặc dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong, xếp thành cặp hay chuỗi. Giống Lactobacillus là loài trực khuẩn, có thể sống ở pH=3,8 hoặc thấp hơn, hoạt động hô hấp thấp. Nhiệt độ tối thích là 30-400C. Lactobacillus phân bố rộng rãi trong môi trường, đặc biệt trên những thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật, thường sống trong ruột chim và động vật hữu nhũ. * Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình oval, đường kính từ 0,5÷0,8µm, chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1÷3µm, xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám tập trung. Lên men dị hình sản phẩm là acid lactic cùng với CO2, etanol, các acid bay hơi. Chúng phát triển được ở 100C, nhưng không mọc được ở 450C. Chỉ lên men được mono- và disaccharide, sống hiếu khí tùy ý. Phân bố rộng rãi trên thực vật, sản phẩm sữa và các sản phẩm khác. * Giống Streptococus gồm Enterococci, Lactis streptoccoci và Streptococci, có tế bào hình tròn hoặc oval, đường kính khoảng 0,5÷1µm, xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi dài. Một số chủng có dạng hơi giống trực khuẩn vì chiều dài lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn Streptococus lactis là trực khuẩn rất ngắn, nhỏ 1,0÷1,5µmx0,5÷1,0µm gây chua sữa tự nhiên. Sống hiếu khí tùy ý. Nhiệt độ phát triển 25-450C, tối thích ở 37 0C. Ký sinh trên động vật có xương sống, đặc biệt vùng miệng và ruột. * Giống Pediococcus có dạng hình cầu, đường kính 0,5÷1,2µm, đứng riêng lẻ, kết đôi hay tạo đám tứ cầu hay bát cầu khuẩn. Chúng là các thể kỵ khí hoặc vi hiếu khí, thường yêu cầu có CO2 cho sự phát triển, lên men đồng hình. Một số chủng có thể tạo thành màng nhầy từ saccharose. Nhiệt độ thích hợp là 25-400C. Thường xuất hiện trên rau quả và các loại thực phẩm khác. 14 * Giống Enterococcus có dạng tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,6-2,0)x(0,6-2,5)µm, thường xuất hiện ở dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng. Hiếu khí tùy ý, lên men nhiều loại đường khác nhau tạo thành sản phẩm chính là acid lactic nhưng không sinh gas, pH cuối cùng là 4,2÷4,6. Môi trường dinh dưỡng phức tạp. Có thể phát triển ở 10-450C (tối thích 370C), pH= 9,6; 6,5% NaCl. Thường lên men lactic lactose. Hiện diện rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt trong phân động vật có xương sống. * Giống Lactococus có dạng tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,51,2)x(0,5-1,5)µm, thường xuất hiện dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng. Hiếu khí tùy ý, lên men nhiều loại carbohydrate với sản phẩm chủ yếu là acid lactic nhưng không sinh gas. Phát triển được ở 10-450C, tối thích ở 30 0C. Được tìm thấy phổ biến nhất trong các sản phẩm sữa và ở thực vật. - Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamine và nitơ. Chẳng hạn, loài Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có đòi hỏi về dinh dưỡng cao nhất. Chúng đòi hỏi không chỉ các chất hữu cơ phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn nhu cầu lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamine, muối vô cơ [8]. - Nhu cầu dinh dưỡng Cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucosese, fructose, mantoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit. Nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid malic, pyruvic, fumaric, axetic... (Krasilnikov, 1965; Wittenbyry, 1965; Flesch, 1968; Bottazzi, 1971). Một vài loại vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các acid glucosenic và glactorunic tạo thành CO2, acid axetic và acid lactic. 15 Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các loại acid amine như acid glutamic, acginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khí đó xảy ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Ví dụ Lactobacillus delbrueckii có thể sử dụng các đường maltoza, glucosese, galactoza, saccaroza, dextrin và không sử dụng được lactoza, raffinoza trong khi đó Lactobacillus bulgaricus có thể sử dụng được đường lactoza nhưng lại không sử dụng được maltoza và saccaroza. Một số vi khuẩn lactic lại có thể sử dụng được dextrin và tinh bột [8]. - Nhu cầu về nitơ: Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Đôi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic, như Lactobacillus helviticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường Theo Orla-Jensen dựa vào nhu cầu nitơ có thể chia vi khuẩn lactic ra làm ba nhóm: - Các vi khuẩn lactic cần hỗn hợp phức tạp các acid amine trong môi trường (chi phụ Thermobacterium). - Các vi khuẩn có thể phát triển tốt trên môi trường chỉ có sistein và muối amoni (chi phụ Streptobacterium). - Các vi khuẩn có thể phát triển trên môi trường có nguồn nitơ duy nhất là muối amoni (giống Streptococcus) Như đã nói trên, để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amine, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, lactanbumin, casein, pepton, peptid [8]. - Nhu cầu Vitamine: Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là loài Lactobacillus rất cần vitamine cho sự phát triển. Thường thì phải bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamine như nước 16 khoai tây, ngô, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác. Các vitamine đóng vai trò là các coenzymee trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp được vitamine. Rogosa và cộng sự (1961) đã chỉ ra rằng acid nicotinic (vitamine B5) và acid pantotenic (vitamine B3 ) rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các loài vi khuẩn lactic. Trong khi đó vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamine (vitamine B1), nhưng acid folic và acid p-amineobenzoic không ảnh hưởng đến sự phát triển của loài Lactobacillus. Có thể tích tụ các vitamine trong tế bào vi khuẩn lactic đang được nghiên cứu. Người ta cho rằng tế bào của loài Lactobacillus leichmanii và Lactobacillus delbrueckii có chứa vitamine B12 hấp thụ từ môi trường với tỷ lệ khoảng 0,5µg/g chất khô. Khi đó hầu như toàn bộ lượng vitamine này được phát hiện thấy ở trong thành tế bào liên kết chặt chẽ với các chuỗi polypetid ở đó (Sasaki, 1972). Tế bào vi khuẩn lactic có thể hấp thụ một lượng vitamine như: vitamine B6, thiamine, lớn hơn nhu cầu của chúng để tạo ra một số lượng lớn trong tế bào (còn gọi là sự tiêu thụ thừa vitamine). Nhu cầu vitamine còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường. Chẳng hạn khi thay đổi nhiệt độ khoảng 3-40C thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên ngoài của Lactobacillus helveticus thay đổi khoảng 25%. Nhu cầu vitamine cũng vị ảnh hưởng bởi thành phần môi trường nuôi cấy. Điều này có liên quan chặt chẽ tới sự có mặt của các acid amine, acid hữu cơ, dezoxyribozit... Chẳng hạn vi khuẩn lactic sẽ không cần vitamine B12 nếu trong môi trường đã có dezoxyribozit. Tương tự như vậy bazơ purin cũng ảnh hưởng tới nhu cầu acid p-amineobenzoic của vi khuẩn lactic [8]. 17 - Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic Ngoài các acid amine và vitamine ra vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng. Dưới đây là một số hợp chất hữu cơ ảnh hưởng đến sựu phát triển hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic: - Các bazơ nitơ: Adenin, hypoxantin, guanin, uraxin, thimin, thimidin. - Acid hữu cơ: acid axetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác. - Acid amine: L-asparagin, L-glutamine. Trong môi trường có chứa các acid amine tự do, vitamine và nhiều cấu tử cần thiết khác, protein chưa thủy phân hoàn toàn sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn lactic. Có khả năng là các peptid thực hiện vai trò cung cấp các acid amine cần thiết cho quá trình đồng hóa. Chúng kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các acid amine tự do (Raines, Haskell, 1986). Một loạt chất thuộc về nhóm các yếu tố phát triển hữu cơ là acid axetic và acid xitric. Có sự ảnh hưởng thuận lợi của xitrat đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic đã được chứng minh đó là lý do tại sao hiện nay người ta lại sử dụng rộng rãi xitrat làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự xitrat, acetate hay acid axetic có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Acetate được dùng làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều vi khuẩn lactic. Một loại acid hữu cơ quan trọng khác có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic là acid oleic (có thể thay thế bằng linoleic và acid linolenic). Đó chính là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween-80, một dẫn xuất của acid oleic (polyoxythlen sorbitol monolat), trong thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn lactic. Một vài loài vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophillus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần các acid béo không no cho sự phát triển. Các acid béo không no ở đây có tác dụng chuyển hóa thành biotin (vitamine H) chất sinh trưởng rất cần thiết cho vi khuẩn lactic [8]. 18 Bảng 1.1. Nhu cầu vitamine cần cho sự phát triển của một số loài vi khuẩn lactic (Theo Títtler và cộng sự 1952; Snell, 1954) [8] Vitamine Acid P-amimobenoic Loại vi khuẩn Nhu cầu (µg/ml) Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus Lactobacillus plantarum Biotin (B7,H) Lactobacillus arabinosus 0-02 Streptococcus faecalis Acid folic Acid nicitinic (B5) (Vitamine PP) Lactobacillus casei Lactobacillus faecalis 0-0,15 Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides 0,400 Streptococcus faecalis Acid pantotenic (Vitamine B3) Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Riboflavin Lactobacillus casei (Vitamine B2) Streptococcus lactis Thiamine (Vitamine B1) 0-0,20 Lactobacillus fermenti 0-1 0-5 Streptococcus lactis Lactobacillus casei Pyridoxin Lactobacillus faecalis 0-0,7 (Vitamine B6) Lactobacillus acidophilus 0-0,4 Lactobacillus delbrueckii Vitamine B12 Lactobacillus lactis 0-0,05 Lactobacillus leichmanmii 0-0,05 - Nhu cầu các muối vô cơ Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, mangan, natri, kali, lưu huỳnh, magie... đặc biệt là 19 mangan. Chính mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+ , Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh sản acid amine (Ledesma, 1976). Một vài enzyme có sự tham gia của các ion kim loại này trong cấu trúc trung tâm hoạt động (Krischke, 1991), chẳng hạn như trường hợp của photphoructokinaza. Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng vai trò chủ yếu sau: - Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme. - Giải độc tế bào khỏi sự có mặt của oxy. Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza để thải các gốc O2-. - Ổn định cấu trúc tế bào. Mn2+ tham gia vào việc làm ổn định riboxom. - Mg2+ là chất hoạt động trong các quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn sử dụng tốt hơn các loại đường [8]. Hoạt tính enzyme protease, lipase và nuclease của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteolitic để tác dụng lên protein và peptid là các enzyme proteinase và peptidase. Hoạt tính proteolitic có ở các dạng cầu khuẩn cũng như ở các dạng trực khuẩn hoặc liên cầu khuẩn chịu nhiệt. Trong quá trình phân giải protein của sữa, đặc biệt là trong thời gian đầu nuôi cấy chủng (vi khuẩn vào sữa, sẽ xuất hiện sự tạo thành các acid amine bao gồm asparagin, glycine, serin, acid glutamic, threonin, tyrosin, valine, phenylalanine, isoleucine) cũng như các peptid. Trực khuẩn lactic có hoạt lực proteolitic cao hơn cầu khuẩn. Chẳng hạn như: L.Bulgaricus, L.casei có khả năng phân giải casein sang dạng hòa tan tới 25-30%, còn Str.cremoris và Str.lactis chỉ chuyển hóa được 15-17%. Hoạt lực proteolitic của vi khuẩn lactic được đánh giá bằng hàm lượng N-amine tự do hòa tan trong môi trường. Cần lưu ý, khi xác định hàm lượng Namine tự do phi protein đã có trong môi trường trước khi vi khuẩn hoạt động. Thủy phân protein của vi khuẩn lactic là do sự tác động của enzyme protease nội bào cũng như ngoại bào. Các dịch chiết từ tế bào (sau khi nuôi vi khuẩn 24 giờ, rồi phá vỡ vỏ tế bào, ly tâm lấy dịch) ta đều thấy có hoạt tính enzyme này. Tại đây ta thấy có 20 mặt của 2 enzyme liên kết với màng tế bào, một enzyme khác liên kết với tế bào chất. Protease màng tế bào bị phá hủy ở nhiệt độ từ 3 đến 200C, còn protease ở tế bào chất ổn định ở 30C, nhưng bất hoạt ở - 200C. Một số kim loại (Mg2+ , Mn2+ ; Co2+...) có tác dụng kích thích peptidase ở vùng pH 5,5-6,0. Ngày nay người ta dùng một số tác nhân đột biến (tia cực tím, tia X, etylenimin...) có thể thu được một số thể đột biến của vi khuẩn chọn được những giống có hoạt tính để đưa vào sản xuất sinh khôi vi khuẩn lactic - làm giống ban đầu (hay khởi động) - stalet kullter hay zakvas, cho sản xuất hàng loạt các sản phẩm sữa. Một trong những quá trình chế biến để thu sản phẩm này là quá trình chín của phomat có chất lượng cao: hương vị và hàm lượng acid amine tự do được tạo thành nhờ hoạt tính protease của giống ban đầu. Quá trình tạo thành các acid amine làm cải thiện hương vị của phomat sẽ tốt hơn. Leucine và valine có thể là tiền chất của 3-metybutanal và 2-metylpropanat là hai hợp chất tạo ra vị đặc biệt của phomat. Vi khuẩn lactic nói chung là không có hoạt tính lipase (enzyme phân hủy chất béo). Có một số nhà nghiên cứu cho rằng, các trực khuẩn và cầu khuẩn lactic có khả năng sử dụng triglyxerit để tạo nên một số chất béo mới ở dạng tự do cũng như dạng liên kết. Một số chủng Lactobacillus (L.fermenti, L.casei, L.salivarius, L.viridescens) có khả năng sinh enzyme nuclease ngoại bào chứa ADN hoặc ARN. Thỉnh thoảng có những chủng sinh đồng thời 2 enzyme ngoại bào ADNaza và ARNaza. Như chúng ta đã biết, vi khuẩn lactic không có khả năng tạo thành catalaza. Song, vài chục năm trở lại đây hàng loạt các tác giả đã thông báo tìm thấy hoạt tính catalaza ở những vi khuẩn lactic khác nhau. Thật vậy, một vài loài vi khuẩn lactic có khả năng phân giải H2O2 được tạo thành trong việc sử dụng các cơ chất xác định, sự có mặt hoạt tính này ở các loài vi khuẩn lactic được gọi theo tên khác là Pseudocatalaza (Whittenbery, 1964). Pseudocatalaza tìm thấy ở các loài Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides và Lactobacillus plantarum khi nuôi ở môi trường dinh dưỡng với 0,05% thạch, nhưng không có đường glucosese. Hoạt tính Pseudocatalaza giảm đáng kể khi pH môi trường giảm từ 7 xuống 4,5 [8].
- Xem thêm -