BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Liên
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: SINH HỌC
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC
TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
(Taxus chinensis)
Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Liên
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC
TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
(Taxus chinensis)
Chuyên ngành:
Mã số:
Sinh học thực nghiệm
842 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Phí Quyết Tiến
Hà Nội – 2021
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây
độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” là do
tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phí Quyết Tiến. Số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực.
Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng
tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2021
Học viên
Bùi Thị Liên
ii
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Phí Quyết Tiến – Phó Viện Trưởng Viện Công
nghệ sinh học; Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam,
là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên
cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong
suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Vũ Thị Hạnh
Nguyên, TS. Quách Ngọc Tùng và các cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn
nguồn gen vi sinh vật đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em thực hiện các thí
nghiệm trong phạm vi luận án và đồng thời truyền đạt nhiều kinh nghiệm
thực tiễn quý giá trong hoạt động nghiên cứu khoa học ở lĩnh vực vi sinh vật
học.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa
Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế
của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều
kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, là
hậu phương vững chắc giúp em có động lực học tập.
Luận văn được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: “Nghiên
cứu khai thác nấm nội sinh trên cây dược liệu bản địa nhằm thu nhận một số
hợp chất (paclitaxel hoặc một số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp
bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/2022.
iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tên đầy đủ
A-549
Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma)
bapt
baccatin III:3-amino-3 phenylpropanoyltransferase
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
bp
Base pair
CMV
Virus cytomegalo
dbat
taxane 10b-hydroxylase
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic Acid
FDA
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ
HGT
Horizontal gene transfer – Chuyển gen ngang
IC50
Nồng độ ức chế 50%
ITS
Internal transcribed spacer
kDa
kiloDalton
MCF7
Ung thư vú ở người (human breast carcinoma)
MIC
Minimun inhibitory concentrations – Nồng độ ức chế tối thiểu
NCBI
National Center for Biotechnology Information
OD
Optical Density – Mật độ quang
PCR
Polymerase chain reaction
SRB
Sulforhodamine B
TCA
Trichloracetic acid
TLTK
Tài liệu tham khảo
ts
taxadiene synthase
VSV
Vi sinh vật
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm
nội sinh trên thực vật ......................................................................................... 7
Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu........................ 20
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch
đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch
đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24
Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội
sinh trên cây thông đỏ Bắc .............................................................................. 30
Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với
các chủng tham chiếu ...................................................................................... 41
Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với
các chủng tham chiếu ...................................................................................... 42
Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với
các chủng tham chiếu ...................................................................................... 43
Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với
các chủng tham chiếu ...................................................................................... 44
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ .................................... 4
Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh ........................... 8
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh .............. 10
Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) ............................................... 12
Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel ............................................... 16
Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE
ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh ..................................... 27
Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng
VSV kiểm định................................................................................................ 28
Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm
nội sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C.
albicans ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC
35984; 5. P. aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E.
faecalis ATCC 29212. .................................................................................... 29
Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội
sinh tuyển chọn ............................................................................................... 32
Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên
gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific,
Mỹ). ................................................................................................................. 34
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh
tổng hợp paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%.
Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là
đối chứng âm. .................................................................................................. 35
Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6
(a, b, c) và TQF25 (d, e, f) .............................................................................. 38
Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6
(a, b, c) và TDF7 (d, e, f) ................................................................................ 38
vi
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel
agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ);
ĐC: là đối chứng âm ....................................................................................... 39
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25,
TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2
với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628)............................................ 45
vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH......................................................................................... v
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU .............................. 3
1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh ...................................................... 3
1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội
sinh 5
1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm ................................... 5
1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư ............................................ 8
1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus .............................................................. 9
1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.) ......................................................... 11
1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội
sinh trên cây thông đỏ ............................................................................ 15
1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh
paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel .................................................... 16
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI
SINH ............................................................................................................ 17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG ....................................................................................... 19
2.1.1. Chủng giống .................................................................................. 19
2.1.2. Hóa chất, thiết bị........................................................................... 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 20
2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....................... 20
2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh ......... 21
viii
2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................ 21
2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng
tuyển chọn ............................................................................................... 23
2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các
gen chỉ thị ................................................................................................ 23
2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm
nội sinh tuyển chọn ................................................................................. 24
2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải
và phân tích trình tự vùng ITS.............................................................. 25
2.2.8. Xử lý thống kê số liệu ................................................................... 26
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27
3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ............................................ 27
3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH ......................................................... 29
3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH
CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ........................................... 31
3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG
SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ............................. 33
3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 ....................................... 37
3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống
sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn ............. 37
3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và
phân tích trình tự ITS ............................................................................ 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47
KẾT LUẬN.................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 56
1
MỞ ĐẦU
Trong những thập kỷ qua, cây dược liệu luôn đóng vai trò quan trọng
trong bảo vệ và nâng cao sức khoẻ con người. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh vai trò của các hợp chất tách chiết từ cây dược liệu trong phòng và điều
trị bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật, kích thích hệ thống miễn dịch và ngăn
ngừa ung thư. Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc kháng sinh và nạn chặt phá
rừng bừa bãi đang là vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người
và đa dạng sinh học của quốc gia. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất mới mà
không cần khai thác cây dược liệu đang là hướng đi mới được các nhà khoa
học đặc biệt quan tâm.
Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật cư trú bên trong các mô tế bào
thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Trong các
nhóm vi sinh vật nội sinh, nấm nội sinh được chú ý hơn cả và đang được ứng
dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y-dược học. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh tiềm năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội
sinh như: kháng khuẩn, kháng virus, ức chế tế bào ung thư, trị tiểu đường,
chống viêm,.... Nhờ khả năng chuyển gen ngang, nấm nội sinh có thể sinh
tổng hợp các hoạt chất như cây chủ. Nhiều chất kháng sinh và kháng tế bào
ung thư mới đã được phát hiện gần đây từ nấm nội sinh bao gồm pestacin,
paclitaxel,
camptothecin, ergoflavin,
podophyllotoxin,
benzopyran,
isopestacin, phloroglucinol, tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside,
borneol, dibenzofurane, methyl peniphenone, lipopeptide, peniphenone,…
Gần đây, nấm nội sinh được đánh giá là nguồn nguyên liệu quan trọng của
ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay, chỉ có khoảng 0,75–1,5% các loài
thực vật được nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh. Vì vậy, tiềm năng khai thác
nấm nội sinh nhằm tìm kiếm các hoạt chất mới là rất triển vọng
Cây thông đỏ (Taxus chinensis), thuộc họ Thủy tùng (Taxaceae), là cây
dược liệu quý được liệt vào sách đỏ của Việt Nam và thế giới. Trong y học
dân gian, cây thông đỏ được sử dụng trong điều trị bệnh truyền nhiễm và
hiểm nghèo. Đặc biệt, lá và vỏ cây là nguồn nguyên liệu để tách chiết
paclitaxel (paclitaxel), loại thuốc điều trị ung thư buồng trứng, vú và phổi
được thông qua bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) vào
năm 1992. Tuy nhiên, sản xuất chất này vẫn là một thách thức trong ngành
dược phẩm vì 1 kg vỏ cây chỉ sản xuất được 10 g paclitaxel. Xuất phát từ thực
2
tiễn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng vi nấm nội sinh trên cây
thông đỏ là nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất paclitaxel và chất kháng
sinh mới. Đã có khoảng 60 chủng vi nấm nội sinh được công bố là có khả
năng sinh paclitaxel cao. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề
cập đến nấm nội sinh trên cây dược liệu nói chung và cây thông đỏ nói riêng
tại Việt Nam, cũng như mối tương quan giữa các nấm này với các sản phẩm
chuyển hóa của cây dược liệu. Với tiềm năng và thách thức trên, đề tài
“Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh
trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” được thực hiện nhằm tìm kiếm chủng
vi nấm nội sinh có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng sinh và kháng
tế bào ung thư mới nhằm tạo nguyên liệu mới với giá thành thấp cho ngành
dược, ứng dụng trong điều trị lâm sàng và đồng thời bảo tồn loài thông đỏ
Taxus chinensis quý hiếm.
Mục tiêu của đề tài :
Tuyển chọn và đánh giá được tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh
và gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T.
chinensis).
Nội dung nghiên cứu:
- Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây
bệnh cao.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm tuyển
chọn.
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ cao chiết tổng của các chủng vi
nấm tuyển chọn
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp paclitaxel của các chủng nấm bằng chỉ
thị phân tử.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi nấm nội sinh
tuyển chọn.
3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU
1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các
mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ.
Vi nấm nội sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây
chủ chống lại tác nhân gây bệnh đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật
[1]. Trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại vi nấm
nội sinh trên thực vật. Trong đó, các chi nấm phổ biến có thể được kể đến như
Altenaria,
Aspergillus,
Colletrotrichum,
Guignardia,
Nigrospora,
Penicillium, Phomopsis, Rhizoctonia và Xylaria [2].
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế nội sinh của
vi nấm trên thực vật. Giả thuyết về sự xâm chiếm không triệu chứng khẳng
định cơ chế nội sinh là sự cân bằng đối kháng giữa vật chủ và nội sinh vật
(Hình 1.1) [3]. Vi sinh vật nội sinh và gây bệnh đều mang các gen độc tính,
giúp vi sinh vật xâm nhiễm cây chủ. Nếu độc tính lây nhiễm của vi nấm và
khả năng bảo vệ của cây chủ cân bằng, thì quá trình nội sinh sẽ diễn ra theo
và không gây tác động xấu tới cây chủ. Ở trạng thái cân bằng này, các yếu tố
môi trường đóng vai trò chính. Nếu quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra quá
mạnh mẽ ở cây chủ thì nấm sẽ bị tiêu diệt bởi các chất và protein bảo vệ.
Ngược lại, hiện tượng cây nhiễm bệnh nấm xảy ra khi cơ chế miễn dịch bảo
vệ của cây không đủ để cân bằng hay tiêu diệt độc tính từ vi nấm (Hình 1.1).
Hiện tượng này thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chủ quan và khách
quan như bản thân cây chủ và môi trường [4].
Tương tác giữa vi nấm và cây chủ có thể không chỉ là trạng thái cân
bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà là tương
tác cộng sinh. Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ các cây chủ khỏi các tác nhân
gây bệnh bằng việc sản sinh các bằng cách bài tiết các chất đặc thù theo
thuyết “hiệu ứng khảm”. Theo một giả thuyết khác, vi nấm có thể hỗ trợ và
tăng cường khả năng miễn dịch của cây chủ [4]. Howitz và Sinclair đề xuất
giả thuyết “xenohormesis” cho rằng ở trạng thái phòng vệ, cây chủ sản sinh
các chất có khối lượng phân tử thấp truyền tín hiệu tới cộng đồng vi sinh vật
dị dưỡng nội sinh. Nhờ đó, các vi sinh vật nội dinh có thể cảm nhận sự thay
4
đổi trong quá trình trao đổi chất của cây chủ và sản xuất các chất chuyển hóa
thứ cấp hữu ích cho cây chủ. Dưới áp lực tiến hoá chọn lọc, nhiều vi sinh vật
đã mất các gen mã hoá protein tham gia sinh tổng hợp các chất này. Một số
cụm gen không bị ảnh hưởng bởi quá trình thích nghi và tiến hoá vì cần thiết
cho tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật nội sinh hoặc giữa các vi sinh vật
nội sinh với nhau. Ở giả thiết khác, các chất truyền tín hiệu từ thực vật cũng
có thể là sản phẩm trao đổi chất của các vi sinh vật nội sinh được kích thích
sinh tổng hợp bằng nhiều cơ chế điều hoà khác nhau của cây chủ [5].
Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ [4]
Ước tính đã có khoảng 7% trong số 1,5 triệu loài nấm đã được công bố.
Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu về vi
sinh vật góp phần củng cố lập luận mới cho rằng: hiện có khoảng 3,5 - 5,1
triệu loài nấm tồn tại trên trái đất [6]. Nhận định này trái ngược với báo cáo
trước đó vào năm 2017 của Hawksworth và Lücking cho rằng có khoảng 2,2
đến 3,1 triệu loài nấm [7]. Trong đó, vi nấm nội sinh trên cây dược liệu chiếu
1 phần khá khiêm tốn. Chính vì vậy, vi nấm nội sinh có nhiều tiềm năng khai
thác và không chỉ đa dạng loài mà còn đa dạng về khả năng sinh tổng hợp các
chất có hoạt tính sinh học.
5
1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên
sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực
dược phẩm và nông nghiệp [8]. Tuy nhiên, vi nấm nội sinh vẫn chưa được
khai thác nhiều [9]. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi các loại vi nấm này có
hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alcaloid, flavonoid, steroid,
terpenoid, peptide, polyketone, quinol và phenol. Cho đến năm 2003, khoảng
4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được thu nhận từ vi
nấm [10]. Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các
chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ vi nấm nội sinh đã được nghiên cứu
trong ba thập kỷ qua.
1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm
Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh được sinh tổng hợp từ
vi nấm nội sinh, hoặc là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa
nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và bảo vệ cây chủ
khỏi những tác nhân gây bệnh. Đối với con người, các hợp chất kháng vi sinh
vật không chỉ có thể được sử dụng làm trong lĩnh vực y-dược mà còn được sử
dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và thực phẩm.
Trong những năm gần đây, số lượng các chất có hoạt tính kháng vi sinh
vật đã từ vi nấm nội sinh ngày càng nhiều (Bảng 1.1). Chủng vi nấm nội sinh
Penicillium cataractum phân lập từ cây bạch quả (Ginkgo biloba) sản xuất
penicimenolidyu AB, pasfonin có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây
bệnh như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumonia, Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
trong khoảng 23–361 μM [6]. Nhiều chất kháng khuẩn từ chủng vi nấm nội
sinh Armillaria mellea từ cây thiên ma (Gastrodia elata) đã được phân lập,
thuộc một số lớp cấu trúc như alkaloid, peptit, steroid, terpenoit, phenol,
quinin và flavonoid cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram
(+), nấm men và nấm sợi. Ba hoạt chất mới gồm phomoenamide,
phomonitroester và peacetylphomoxanthone B tách chiết từ dịch lên men nấm
nội sinh Phomopsis sp. PSU-D15 có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh
mạnh [11]. Đặc biệt, phomoenamide đã thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
6
Hợp chất fusaripeptide A được phát hiện từ chủng Fusarium sp. phân
lập từ rễ cây ngựa bạc hà (Mentha longifolia) có khả năng sinh kháng nấm
men gây bệnh ngoài da (Candida albicans, Candida glabrata, Candida
krusei) và nấm sợi (Aspergillus fumigates) [12]. Nấm nội sinh Phomopsis sp.
YM 311483 từ cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica) sinh tổng hợp bốn loại
lactone mới, có hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger, Botrytis cinere và
Fusarium sp. [9]. Chủng Fusarium nội sinh trên cây dương xỉ (Selaginella
pollescens) được thu thập trong khu bảo tồn Guanacaste của Costa Rica được
chứng minh có khả năng ức chế mạnh C. albicans [13]. Jesterone là hợp chất
kháng nấm mới ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp được phân lập từ nấm
Pestalotiopsis jester nội sinh trên cây gỗ trai (Fagraea bordenii Wernham)
[14].
Chi Epichloë nội sinh trong các loài cỏ khác nhau có khả năng sản sinh
nhiều alkaloid gây độc cho một số loài côn trùng gây hại và thậm chí cả động
vật có xương sống [15]. Acid nodulisporic được sản xuất bởi nấm nội sinh
Nodulisporium sp. cũng được báo cáo tác dụng kiểm soát côn trùng ăn cỏ vì
với cơ chế kích hoạt glutamate trong các kênh clo của cơ và tế bào thần kinh
côn trùng dẫn đến dòng chảy của các ion clo qua các kênh, dẫn đến tê liệt cơ
thể [16].
Epicoccum nigrum cũng được biết đến với khả năng chống lại vi khuẩn
và nấm gây bệnh trên thực vật [15]. E. nigrum đã cho thấy hoạt tính ức chế
Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi (Psv) trên nốt sần cây ô liu lên đến
96% [17]. Các E. nigrum phân lập từ mía đã cho thấy khả năng chống lại nấm
bệnh Sclerotinia sclerotiorum trên cây hướng dương và chống lại nấm
Pythium sp. trên cây bông; kháng lại Phytoplasma và Monilinia sp. trên quả
đào và quả xuân đào.
7
Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật
Chủng vi nấm
nội sinh
Cây chủ
Chất kháng sinh
Fusarium solani
Thông đỏ
(Taxus baccata)
1-tetradecene, 8-octadecanone,
8-pentadecanone,
Octylcyclohexane, 10nonadecanone
Phomopsis
liquidambaris
Dây càng cua
(Cryptolepis buchanani)
Oblongolide Y
Chaetomium sp.
Cây dưa muối
(Senecio stapeliiformis)
p-hydroxybenzaldehyde, Uracil,
5 effectively
Hoạt tính kháng VSV
gây bệnh
S. aureus
S. epidermidis
B. subtilis
Klebsiella pneumonia
E. coli
Shigella flexneri
E. coli
B. subtilis
P. aeruginosa
E. coli
S. aureus
S. aureus
B. subtilis
P. aeruginosa
K. pneumonia
E. coli
C. albicans
C. glabrata
C. krusei
A. fumigates
TLTK
[18]
[19]
[20]
Penicillium
cataractum
Cây bạch quả
(Ginkgo biloba)
Penicimenolidyu A ,
Penicimenolidyu B, Rasfonin
Fusarium sp.
Ngựa bạc hà
(Mentha longifolia)
Fusaripeptide A
Penicillium sp.
Trúc đào thơm
(Nerium indicum)
3-O-methylviridicatin,
Viridicatol
F. graminearum
[21]
Rhizopycnis
vagum
Thuốc lá
(Nicotiana tabacum)
Rhizopycnin D, TMC-264
Magnaporthe oryzae
[22]
Pestalotiopsis sp.
Thạch hộc tía
(Dendrobium officinale)
LL-P880γ, LL-P880α, Ergosta5,7,22-trien-3β-ol
A. fumigatus
[23]
[6]
[12]
8
1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư
Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai thu được từ vi nấm nội sinh đã được
chứng minh là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư mới. Năm
2000, Demain và Vaishnav, ước tính rằng khoảng 57% các hợp chất trong thử
nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư là các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất
từ vi nấm [16]. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng
loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao
gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon,
steroid, terpenoid, tetralon. Các báo cáo cho thấy rằng các hợp chất hoạt tính
sinh học tự nhiên được phân lập từ vi nấm nội sinh có thể đóng vai trò là
nguồn thay thế cho việc khám phá ra các loại thuốc chống ung thư mới [24].
Ergoflavin
P
Phaeosphoramide
A (R=αC6H11) và B (R=βC6H11)
Camptothecin
Chaetominine
Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh [24, 25]
Chất ergoflavin (Hình 1.2) được minh chứng là hoạt chất ức chế tế bào
ung thư mới, được phân lập từ nấm nội sinh Claviceps purpurea phát triển
trên lá của cây thuốc sến xanh (một loài thuộc họ hồng xiêm). Chủng nấm nội
9
sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy ở vỏ rễ cây xoan, thúc đẩy sự sinh
tổng hợp các amit phenylpropanoid (nhóm chất phenylpropanoid) hiệu quả
trong điều trị ung thư. Chủng nấm Entrophospora infrequens SW116 được
phân lập từ cây họ thụ đào (Nothapodytes foetida) - một cây thuốc có nguồn
gốc từ Ghats, Ấn Độ, được phát hiện với khả năng sinh camptothecin (Hình
1.2) [25]. Camptothecin là một chất ức chế topoisomerase được biết đến với
khả năng điều trị một loạt các ung thư: ung thư dạ dày, ung thư trực tràng,
ung thư ruột kết, ung thư bàng quang,…
Hoạt tính gây độc tế bào liên quan đến bệnh bạch cầu ở người K562 và
dòng tế bào SW1116 ung thư ruột kết được ghi nhận bởi một alkaloid
chaetominine (Hình 2) thu được từ chủng vi nấm nội sinh Chaetomium sp.
IFB-E015, phân lập trên cây sa sâm (Adenophora axiliflora) [26]. Nấm nội
sinh Phaeosphaeri avenari sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học gồm:
phaeosphoramides A và B, hiệu quả trong ức chế chất dẫn truyền tín hiệu và
chất kích hoạt phiên mã (STAT) -3 của tế ung thư [27]. Chủng vi nấm nội
sinh mới Trametes hirsuta đã được phát hiện với khả năng sản xuất
podophyllotoxin và các lignans aryl tetralin liên quan khác có đặc tính chống
ung thư mạnh [25].
Do như cầu sử dụng paclitaxel trong điều trị ung thư cao nên từ năm
1995, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội
sinh từ các cây thông đỏ quý hiếm ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Những
chủng nấm phổ biến được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp.,
Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp.. Các loại nấm này có khả
năng sinh paclitaxel hoặc các dẫn xuất từ paclitaxel thấp nhưng việc áp dụng
công nghệ giải trình tự gen và chỉnh sửa hứa hẹn triển vọng khai thác
paclitaxel từ vi nấm ở quy mô công nghiệp trong tương lai. Các nghiên cứu về
các chất có hoạt tính sinh học khác từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ vẫn
còn bỏ ngỏ.
1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus
Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh còn là ứng cử viên
tiềm năng trong nghiên cứu và tạo các thuốc kháng virus. Việc khảo sát sàng
lọc các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp các chất kháng virus cũng là
hướng đi có nhiều hứa hẹn, mặc dù có rất ít nghiên cứu được ghi nhận. Hai
10
hợp chất mới, acid cytonic A và B được phân lập từ Cytonaema spp. có khả
năng ức chế virus cytomegalovirus (CMV) ở người [28]. Hợp chất kháng
virus hinnuliquinone được sinh tổng hợp bởi vi nấm Nodulisporium
hinnuleum cư trú ở lá cây sồi (Quercus coccifera) thể hiện hoạt tính ức chế
HIV-1 [29]. Các hoạt chất pullularins AD (cyclo hexadepsi-peptides) được
sản xuất bởi Pullularia spp. BCC 8613 được phát hiện có hoạt tính kháng
virus herpes simplex (HSV) [29]. Nấm nội sinh Alternaria tenuissima
QUE1Se sản sinh ra altertoxins, một hợp chất hiệu quả chống lại virus HIV-1.
Một số hợp chất được sản xuất từ Emericella spp. (HK-ZJ), bao gồm
emerimidine, dehydroaustin, austinol, bao gồm aspernidine, austin,
emeriphenolicins và acetoxy dehydroaustin đã được báo cáo là có hoạt tính
kháng virus cúm A (H1N1) [30].
pullularins AD
cytonic A
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh [29]
1.1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học khác
Chất chống oxi hóa (antioxidant) là những chất có thể ngăn ngừa hoặc
làm giảm tổn thương cho các tế bào gây ra bởi sự mất cân bằng phản ứng oxy
hóa khử (reactive oxygen species). Nếu tế bào không thể trung hòa và loại bỏ
- Xem thêm -
.PDF 
67 
1 
126 
