Tài liệu Luận văn thạc sĩ giải mã vùng gen barcoding (cytochrome c oxidase 1 – co1) cho một số mẫu bướm ngày thu tại hà giang, việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TÔ VĂN QUANG Tô Văn Quang SINH HỌC THỰC NGHIỆM GIẢI MÃ VÙNG GEN BARCODING (CYTOCHROME C OXIDASE 1 – CO1) CHO MỘT SỐ MẪU BƯỚM NGÀY THU TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tô Văn Quang GIẢI MÃ VÙNG GEN BARCODING (CYTOCHROME C OXIDASE 1 – CO1) CHO MỘT SỐ MẪU BƯỚM NGÀY THU TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trần Thị Việt Thanh Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Tô Văn Quang Lời cảm ơn Tôi xin gởi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô Học viện Khoa học và Công nghệ và Khoa Công nghệ Sinh học vì những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi trong suốt thời gian học tập. Tôi xin cảm ơn dự án VIETBIO, đặc biệt cảm ơn Tiến sĩ Christoph Häuser, Thomas von Rintelen, Théo Léger và tất cả mọi người ở Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Berlin đã nhiệt tình hỗ trợ tập huấn và tài trợ nghiên cứu để tôi thực hiện luận văn tốt nhất có thể. Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Tiến sĩ Trần Thị Việt Thanh, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam vì đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi trân trọng gởi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Lưu Hồng Trường, Viện trưởng Viện Sinh thái học Miền Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè lớp 2019A và 2019B, anh chị em đồng nghiệp, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm gióng cột cục bộ cơ bản BOLD : Barcode of Life Data System Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống bp : base pair cặp ba-zơ CO1 : Cytochrome c oxidase 1 DNA : Deoxyribonucleic Acid GenBank : Genetic Sequence Data Bank Ngân hàng dữ liệu trình tự di truyền ITS : Internal Transcribed Spacer matK : maturase K PCR : Polemerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen rbcL : ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase large subunit VN-HG : Việt Nam – Hà Giang Danh mục các bảng Trang Bảng 1.1. Một số cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu mã vạch DNA ở bướm . 8 Bảng 1.2. Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm trên BOLD ........................ 9 Bảng 1.3. Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm ở Việt Nam trên BOLD .. 12 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu bướm được dùng trong nghiên cứu ................ 17 Bảng 2.2. Danh sách các mẫu được lựa chọn trên BOLD có trình tự vùng gen CO1 tương ứng với mẫu nghiên cứu............................................................... 20 Bảng 3.1. Danh sách các mẫu nghiên cứu được cấp mã số trên GenBank ..... 23 Bảng 3.2. Tổng hợp mức độ tương đồng (%) và vị trí sai khác của các mẫu nghiên cứu với các mẫu tương đồng nhất trên BOLD .................................... 39 Bảng 3.3. Các loài bướm có trình tự vùng gen CO1 lần đầu tiên ghi nhận cho Việt Nam ......................................................................................................... 44 Danh mục các hình ảnh Trang Hình 1.1. Số lượng mã vạch DNA và số lượng loài đại diện thuộc các họ bướm khác nhau được ghi nhận ở Việt Nam đã có trên BOLD ..................... 12 Hình 1.2. Vị trí cao nguyên đá Đồng Văn trên bản đồ Việt Nam................... 13 Hình 2.1. Vị trí thu mẫu (chấm tròn ) thuộc xã Lũng Cú, huyện Đồng Văn 16 Hình 2.2. Bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau trên phần mềm ChromasPro 2.1.10 ................................................................................. 19 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu vật ............................ 22 Hình 3.2. Kết quả giải trình tự hai chiều của mẫu Hes9 thể hiện trên phần mềm ChromasPro 2.1.10 ................................................................................. 22 Hình 3.3. Thông tin, dữ liệu mẫu OK342239 của loài Carterocephalus alcina thể hiện trên trang web của GenBank ............................................................. 24 Hình 3.4. Thông tin, dữ liệu mẫu OK340917 của loài Dodona ouida thể hiện trên trang web của GenBank ........................................................................... 25 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342239 và OK342240 với các loài thuộc giống Carterocephalus .......................................................................... 26 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342222 và OK342223 với các loài thuộc giống Sebastonyma ................................................................................ 27 Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342114 và OK342115 với các loài thuộc giống Catochrysops ............................................................................... 28 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342112 và OK342113 với các loài thuộc giống Cigaritis (Spindasis) ................................................................... 29 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342117 và OK342118 với các loài thuộc giống Curetis ......................................................................................... 30 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại mẫu Nym-A09 và Nym-B09 với các loài thuộc giống Dilipa........................................................................................... 31 Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342273 và OK342274 với các loài thuộc giống Symbrenthia.......................................................................... 32 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342127 và OK342128 với các loài thuộc giống Vanessa ................................................................................ 33 Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342129 và OK342130 với các loài thuộc giống Colias ................................................................................... 34 Hình 3.14. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342226 và OK342227 với các loài thuộc giống Gonepteryx ........................................................................... 35 Hình 3.15. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK342235 và OK342236 với các loài thuộc giống Pieris .................................................................................... 36 Hình 3.16. Cây phát sinh chủng loại mẫu OK340914, OK340915, OK340916, OK340917, OK340918 và OK340919 với các loài thuộc giống Dodona ...... 38 Hình 3.17. Cây phát sinh chủng lọai của các mẫu nghiên cứu với các mẫu có độ tương đồng cao nhất tham khảo trên BOLD .............................................. 40 Hình 3.18. Tình trạng phân loại của loài Curetis bulis. .................................. 41 Hình 3.19. Tình trạng phân loại của loài Dodona eugenes............................. 42 Hình 3.20. Mẫu OK342127 (bên trái) và OK342128 (bên phải) của loài Vanessa indica thu được tại tỉnh Hà Giang .................................................... 43 Hình 3.21. Mẫu OK340918 (bên trái) và OK340919 (bên phải) của loài Dodona dipoea thu được tại tỉnh Hà Giang .................................................... 44 Hình 3.22. Mẫu OK340914 (bên trái) và OK340915 (bên phải) của loài Dodona eugenes thu được tại tỉnh Hà Giang .................................................. 45 Hình 3.23. Mẫu OK340916 (bên trái) và OK340917 (bên phải) của loài Dodona ouida thu được tại tỉnh Hà Giang ...................................................... 45 Hình 3.24. Mẫu OK342222 (bên trái) và OK342223 (bên phải) của loài Sebastonyma dolopia thu được tại tỉnh Hà Giang .......................................... 45 Hình 3.25. Mẫu OK342114 (bên trái) và OK342115 (bên phải) của loài Catochrysops strabo thu được tại tỉnh Hà Giang............................................ 46 Hình 3.26. Mẫu OK342236 (bên trái) và OK342235 (bên phải) của loài Pieris canidia thu được tại tỉnh Hà Giang ...................................................... 46 Hình 3.27. Mẫu OK342125 (bên trái) và OK342126 (bên phải) của loài Dilipa morgiana thu được tại tỉnh Hà Giang .................................................. 47 Hình 3.28. Mẫu OK342226 (bên trái) và OK342227 (bên phải) của loài Gonepteryx amintha thu được tại tỉnh Hà Giang ............................................ 47 1 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5 1.1. MÃ VẠCH DNA ....................................................................................... 5 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DNA CỦA BƯỚM NGÀY .... 7 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới.................................................................. 7 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ................................................................ 11 1.2.3. Nghiên cứu ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang ............. 13 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16 2.1. VẬT LIỆU................................................................................................ 16 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 18 2.2.1. Định loại mẫu vật .......................................................................... 18 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số................................................................ 18 2.2.3. Phản ứng khuếch đại gen và giải trình tự...................................... 18 2.2.4. Phân tích dữ liệu............................................................................ 19 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 22 3.1. KẾT QUẢ ................................................................................................ 22 3.1.1. Giải trình tự vùng gen CO1 của các mẫu bướm ........................... 22 3.1.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho từng loài bướm .............. 26 3.1.2.1. Giống Carterocephalus .......................................................... 26 3.1.2.2. Giống Sebastonyma................................................................ 27 3.1.2.3. Giống Catochrysops ............................................................... 28 3.1.2.4. Giống Cigaritis (Spindasis) ................................................... 29 3.1.2.5. Giống Curetis ......................................................................... 30 3.1.2.6. Giống Dilipa........................................................................... 31 3.1.2.7. Giống Symbrenthia ................................................................ 32 3.1.2.8. Giống Vanessa ....................................................................... 33 3.1.2.9. Giống Colias .......................................................................... 34 3.1.2.10. Giống Gonepteryx ................................................................ 35 2 3.1.2.11. Giống Pieris ......................................................................... 36 3.1.2.12. Giống Dodona ...................................................................... 37 3.1.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho tất cả mẫu nghiên cứu .... 38 3.2. THẢO LUẬN ........................................................................................... 41 3.2.1. Phân tích tình trạng phân loại một số loài bướm .......................... 41 3.2.2. Một số ghi nhận mới cho Việt Nam .............................................. 43 3.2.3. Một số ghi nhận mới cho GenBank .............................................. 46 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 48 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 48 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Hình ảnh 28 mẫu vật đại diện cho 14 loài bướm ngày sử dụng trong luận văn. Phụ lục 2. Trình tự vùng gen CO1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu so sánh tương đồng nhất. Phụ lục 3. Dẫn chứng 28 trình tự của 14 loài bướm ngày trong luận văn được công bố trên GenBank. Công trình của tác giả "Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bướm" 3 MỞ ĐẦU Mã vạch DNA trong những năm gần đây được xem như một công cụ hữu hiệu hỗ trợ nghiên cứu phân loại học truyền thống với ưu điểm nhanh, chi phí thấp, độ chính xác cao. Việc sử dụng mã vạch DNA xác định tên loài được thực hiện thành công trên nhiều đối tượng động vật khác nhau, từ động vật bậc thấp như động vật thân mềm, côn trùng cho tới các loài động vật bậc cao như lưỡng cư, bò sát, chim và thú. Vùng gen CO1 (Cytochrome c oxidase subunit 1) trong gen ti thể có độ dài 658 bp (base pair) được các nhà khoa học công nhận là vùng gen chuẩn để nhận dạng loài trên Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (BOLD). Bướm ngày là nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu, và ngày càng mở rộng ở khắp nơi trên thế giới, hỗ trợ các nhà khoa học trong quá trình định danh bằng hình thái thông thường, góp phần giải quyết những vấn đề phức tạp trong mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các loài với nhau. Việt Nam là quốc gia có sự đa dạng về bướm ngày cao, với gần 1.200 loài đã được ghi nhận, trong đó có rất nhiều loài đặc hữu và quý hiếm, có ý nghĩa bảo tồn. Tuy nhiên, các dữ liệu công bố về mã vạch DNA ở Việt Nam còn rất hạn chế, cho thấy tiềm năng nghiên cứu mã vạch DNA trên bướm ở Việt Nam là rất lớn. Đặc biệt, khu hệ bướm ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang có thành phần loài đa dạng và có tính đặc hữu cao ở Việt Nam, nhưng dữ liệu về mã vạch DNA thì rất ít. Chính vì thế, đề tài luận văn “Giải mã vùng gen Barcoding (Cytochrome c oxidase 1 - CO1) cho một số mẫu bướm ngày thu tại Hà Giang, Việt Nam” được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau: (1) Giải trình tự vùng gen CO1 cho 20-30 mẫu vật của 10-15 loài và đăng ký thành công các trình tự nghiên cứu với GenBank. (2) So sánh trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự các mẫu tương tự đã công bố trên BOLD nhằm kiểm tra tính chính xác của quá trình định tên loài. (3) Phân tích sự sai khác về hình thái đối sánh với kết quả đọc trình tự của một số loài có hình thái tương đồng. 4 Nghiên cứu di truyền các loài sinh vật là hướng đi giàu tiềm năng, phù hợp với xu thế chung trên thế giới. Kết quả của luận văn không những góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu mã vạch DNA các loài sinh vật trong nước và quốc tế, mà còn là thông tin cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm hoàn thiện bức tranh đa dạng sinh học, giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến phân loại học, sinh thái học và tiến hóa trong tương lai. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MÃ VẠCH DNA Phân loại học đã có nhiều sự thay đổi đáng kể trong gần ba thế kỉ qua. Trước đây, các mẫu vật được thu thập và xử lý cẩn thận để bảo toàn những đặc điểm phân biệt, và đòi hỏi sự đánh giá của các chuyên gia phân loại nhằm so sánh những khác biệt về giải phẫu giữa các loài có quan hệ họ hàng gần nhau. Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, đặc biệt với mẫu không nguyên vẹn, hoặc mẫu vật có hình thái tương đồng, hoặc biến đổi hình thái (do yếu tố khí hậu, địa lý) trong cùng một loài, dẫn đến việc có rất nhiều tên đồng danh hoặc định danh sai. Sự phát triển vượt trội của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ máy tính và công nghệ gen đã tạo ra những biến đổi lớn trong phân loại học, trong đó yếu tố di truyền đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc xác định mối quan hệ và quá trình tiến hóa giữa các loài với nhau. Mã vạch DNA (DNA barcodes hoặc DNA barcoding) được xem như là một công cụ hữu hiệu cho phép nhận dạng chính xác loài với lượng mẫu rất nhỏ thông qua mẫu vật còn nguyên hoặc không nguyên vẹn, có thể bị hư hỏng (tiêu bản sấy khô, mẫu lâu năm) hoặc đã bị xử lý công nghiệp [1]. Nguyên lý của phương pháp mã vạch DNA là dựa trên việc so sánh các trình tự DNA ngắn giữa mẫu chưa biết với nguồn cơ sở dự liệu gen sẵn có, từ đó xác định tên loài cho mẫu nghiên cứu. Về lý thuyết và thực nghiệm, phương pháp mã vạch DNA đã được chứng minh trên nhiều đối tượng khác nhau, bao gồm virus, vi khẩn, nấm, tảo, thực vật và động vật [1, 2]. Trải qua gần ba thập kỉ, các nhà khoa học đã thu thập được một nguồn cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide khổng lồ ở khắp nơi trên thế giới, và được lưu trữ trên Ngân hàng dữ liệu trình tự di truyền (Genetic Sequence Data Bank – GenBank) tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.nih.gov. GenBank được xây dựng và chia sẻ bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information – NCBI) trực thuộc Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ (National Institutes of Health – NIH). Đây là một kho dữ liệu toàn diện chứa 2,1 tỷ trình tự nucleotide có sẵn công khai cho khoảng 478.000 loài, và thường xuyên được cập nhật theo các quy tắc thống nhất với Cơ quan lưu trữ 6 Nucleotide Châu Âu (European Nucleotide Archive – ENA) và Ngân hàng Dữ liệu DNA Nhật Bản (DNA Data Bank of Japan – DDBJ), đảm bảo phạm vi phủ sóng trên toàn cầu [3]. Đồng thời, một Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (Barcode of Life Data System – BOLD) có địa chỉ www.barcodinglife.org cũng đã được xây dựng để quản lý, giới hạn các trình tự được chọn làm mã vạch DNA có chất lượng và độ tin cậy cao dựa vào các trình tự đã có trên GenBank [4]. Đi kèm với đó là Công cụ tìm kiếm gióng cột cục bộ cơ bản (Basic local alignment search tool – BLAST), là một phương pháp sử dụng thuật toán heuristics để truy vấn các vùng tương đồng ở bên trong các chuỗi trình tự (nucleotide hoặc protein) với nhau, nhằm xác định trình tự đang thao tác giống hoặc gần giống với trình tự nào có trong GenBank. BLAST và trang web https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi lần đầu tiên được giới thiệu vào khoảng năm 1990, có cập nhật sửa đổi vào năm 1997 [5, 6]. Sau đó, với sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, đặc biệt là công nghệ thông tin và công nghệ sinh học, vào cuối năm 2009, NCBI đã thay thế các bộ công cụ cũ, cung cấp phiên bản BLAST mới hơn (được gọi là BLAST+) dựa trên bộ công cụ NCBI C++ làm nền tảng phát triển trở về sau [7]. Đây là một công cụ quan trọng thiết yếu hỗ trợ các nhà khoa học có thể dễ dàng kiểm tra, đối chiếu dữ liệu nghiên cứu với các dữ liệu đã có sẵn một cách nhanh chóng và chính xác. Khái niệm mã vạch DNA được đề xuất dựa trên vùng gen Cytochrome c oxidase 1 (viết tắt là CO1) của gen ti thể (mitochondrial), có độ dài 658 bp [2]. Sau này, các kết quả nghiên cứu trên nhiều nhóm sinh vật cho thấy có những vùng gen khác cũng có thể được lựa chọn làm mã vạch DNA, bên cạnh vùng gen CO1 được sử dụng rộng rãi trên động vật, thì các vùng gen rbcL, matK, ITS, … thường được sử dụng trên thực vật, nấm và các loài sinh vật khác [1]. Do đó, chưa có đoạn gen chuẩn nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài trên thế giới. Việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và kết hợp các đoạn mã vạch DNA với nhau là rất cần thiết, giúp phân biệt các loài tốt hơn, đặc biệt là các loài quan hệ họ hàng gần gũi với nhau [1]. Do có tính bảo thủ cao, vùng gen CO1 đã đạt được nhiều thành công lớn và được lựa chọn là gen mã vạch chuẩn cho nhiều nhóm trong giới động vật, 7 điển hình như là côn trùng, cá, chim [1]. Đặc biệt, bướm ngày là một trong những nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu đến nay. Cách tiếp cận này đã giúp giải quyết mối quan hệ phức tạp giữa các loài bướm với nhau, hỗ trợ rất nhiều trong nghiên cứu sinh thái học, tiến hóa và phân loại học với những thông tin chi tiết được trình bày trong phần nội dung tiếp theo. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DNA CỦA BƯỚM NGÀY 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới Bướm ngày (sau đây gọi tắt là bướm) là một trong những nhóm côn trùng đẹp, có màu sắc sặc sỡ và nhận được nhiều sự quan tâm tìm hiểu của các nhà khoa học từ những thế kỉ trước. Chúng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc nghiên cứu sự hình thành loài, sinh thái học quần xã, địa lí sinh học, biến đổi khí hậu, tương tác giữa côn trùng và thực vật, bao gồm cả loài chỉ thị và loài dịch hại [8]. Bướm thuộc bộ Lepidoptera, siêu họ Papilionoidea và có sự sắp xếp về mặt phân loại học khá phức tạp. Các nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền gần đây đã khẳng định rằng, siêu họ này với khoảng 18.800 loài được chia làm 07 họ chính là Papilionidae, Hesperiidae, Hedylidae, Pieridae, Lycaenidae, Riodinidae và Nymphalidae [8, 9, 10]. Các họ này phân bố ở khắp nơi trên thế giới, ngoại trừ họ Hedylidae phân bố chủ yếu ở khu vực Trung và Nam Mỹ, có số lượng ít nhất với 36 loài; Nymphalidae, Lycaenidae, Hesperiidae là những họ có số lượng nhiều nhất với khoảng 6.000, 5.200 và 4.000 loài tương ứng; trong khi đó, Riodinidae, Pieridae và Papilionidae có số lượng loài không nhiều với khoảng 1.500, 1.100, 1.000 loài đã được mô tả [8, 9, 10]. Cùng với sự phát triển của xu hướng nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử, nghiên cứu mã vạch DNA, đặc biệt là trình tự vùng gen CO1 của nhóm bướm đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong thời gian qua. Đồng thời, một số cặp mồi cũng đã được phát triển để có thể thu nhận tốt nhất trình tự vùng gen CO1 trong nghiên cứu mã vạch ở bướm (xem Bảng 1.1). 6 5 4 3 2 1 Stt ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG CTCCWCCAGCAGGATCAAAA ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG CCTGTTCCAGCTCCATTTTC GCTTTCCCACGAATAAATAATA TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA LepF LepR LepF Enh_LepR LepF MH-MR1 MH-MF1 LepR LepR TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA AAACTAATARCCTTCAAAG TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA HCO2198 tRWF1 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Trình tự từ 5’đến 3’ LCO1490 Cặp mồi 700 407 307 609 658 658 (bp) Độ dài Cặp mồi cải tiến [15, 16] chỉnh [13, 14] được nối lại với nhau hoàn hỏng. Hai đoạn ngắn này sau đó mẫu lâu năm hoặc mẫu bị hư Cặp mồi đoạn ngắn dùng cho [12, 13] Cặp mồi đặc hiệu cho côn trùng Cặp mồi phổ quát [2, 11] Ghi chú Bảng 1.1 . Một số cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu mã vạch DNA ở bướm. 8 Theo thống kê của BOLD, tính đến tháng 07 năm 2021, ước tính có khoảng 151.656 mẫu vật đã được giải trình tự với 146.944 mã vạch DNA được 9 định danh, đại diện cho 9.855 loài, chiếm hơn 50% tổng số loài bướm trên thế giới (xem Bảng 1.2). Bảng 1.2. Dữ liệu mã vạch DNA của nhóm bướm trên BOLD. Họ Số lượng mẫu vật Số lượng mã vạch DNA Số lượng loài đại diện % tổng số loài Nymphalidae 59.820 57.287 4.342 72,37 Lycaenidae 25.674 24.888 1.837 35,33 Hesperiidae 38.586 38.144 1.957 48,93 Riodinidae 4.959 4.659 502 33,47 14.684 14.055 741 67,36 7.333 7.313 442 44,20 600 598 34 94,44 151.656 146.944 9.855 52,32 Pieridae Papilionidae Hedylidae Tổng Ở khu vực Nam Mỹ, vào năm 2017, các nhà khoa học đã phân tích và tập hợp được một thư viện mã vạch DNA cho 417 loài, chủ yếu ở khu vực rừng Đại Tây Dương (Atlantic forest), đông bắc Argentina [17]. Sau đó, các nhà khoa học tiếp tục điều tra bổ sung, mở rộng khảo sát trọng tâm ở vùng rừng Andes (Andean forest), tây bắc Argentina, qua đó xây dựng được ngân hàng dữ liệu vùng gen CO1 với tỉ lệ phân loại trên 98% cho gần 500 loài, chiếm khoảng 40% tổng số loài đã được biết ở Argentina [18]. Trong khi đó, ở khu vực Bắc Mỹ gồm Mỹ và Canada, 814 trong tổng số 846 loài đã được cập nhật dữ liệu mã vạch DNA với tỉ lệ phân biệt các loài đơn lẻ là hơn 80% [19]. Một nghiên cứu mã vạch DNA mới đây đã tổng hợp được dữ liệu trình tự vùng gen CO1 của 459 loài bướm, chiếm 97% tổng số loài ở Châu Âu [20], trong đó Romania có 180 loài với tỉ lệ nhận biết các loài riêng biệt là 90% [21], và vùng bán đảo Iberia có 228 loài với gần 94% là các loài tách biệt [22]. Trình tự vùng gen CO1 cũng mới được thực hiện nghiên cứu trên các loài bướm ở châu Phi trong thời gian gần đây. Cụ thể, các nhà khoa học đã xác 10 định được mã vạch DNA của 116 loài, qua đó nâng tổng số lượng mã vạch DNA lên 147 loài và 16 loài định danh đến giống trên tổng số hơn 1.300 loài ở Nigeria, với khả năng phân tách các loài riêng biệt đạt 90,2% [23]. Mặc dù số lượng bướm không nhiều, chỉ khoảng 500 loài, nhưng Trung Á là khu vực điểm nóng về độ phong phú với nhiều chi, loài phụ và nhóm loài đặc hữu đa dạng [13]. Bằng cách nghiên cứu mã vạch DNA ở Kazakhstan, Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan, Uzbekistan và một phần tây nam nước Nga (phần Châu Á), các nhà khoa học đã khuếch đại thành công đoạn gen CO1 của 353 loài bướm, trong đó tỉ lệ các loài phân biệt rõ ràng chiếm 90% [13]. Cách đó không xa, mã vạch DNA của 81 trên tổng số 320 loài bướm ở Pakistan cũng đã được thu thập với 100% là các loài khác nhau [24]. Qua phân tích và so sánh dữ liệu với khu hệ bướm ở Trung Á, các nhà khoa học nhận định khu hệ bướm ở Pakistan phản ánh khả năng cách ly di truyền hiệu quả với các nước láng giềng qua dãy núi Pamir (cao tới hơn 5.000 mét), tạo nên sự hiện diện của nhiều vùng đặc hữu ở khu vực này [24]. Ở khu vực Đông Nam Á, đã có 233 loài bướm ở Malaysia được giải trình tự vùng gen CO1 nhưng tỉ lệ phân biệt các loài không cao, chiếm khoảng 78% [25]. Trong khi ở Thái Lan, một khảo sát mới đây nhất đã ghi nhận được trình tự vùng gen CO1 cho 51 loài bướm từ 10 công viên đô thị ở thủ đô Bangkok, trong đó có 05 loài định danh đến giống [26]. Có thể thấy, các nghiên cứu mã vạch DNA, đặc biệt là tính đặc hiệu cao của vùng gen CO1, đã hỗ trợ rất nhiều cho việc phân loại và định danh các loài bướm ở khắp nơi trên thế giới. Từ đó, nhiều nghiên cứu chuyên sâu trên từng nhóm cụ thể hơn đã được thực hiện liên quan đến hệ thống phân loại họ, giống hoặc chi tiết hơn tới các loài phụ. Dựa trên dữ liệu di truyền của 304 loài đại diện cho 80% các giống khác nhau, các nhà khoa học đã đánh giá lại những nghiên cứu trước đó và đề xuất hệ thống phân loại họ Riodinidae với một số tộc (tribe) và tộc phụ (subtribe) mới được bổ sung thêm [27]. Qua phân tích trình tự vùng gen CO1 của 165 mẫu vật thuộc giống Ypthima ở Malaysia, các nhà khoa học đề xuất loài Y. newboldi, trước đây được 11 xem là loài phụ của Y. baldus, nên là một loài riêng biệt; đồng thời ủng hộ một quan điểm khác cho rằng Y. nebulosa nên là tên đồng danh của loài Y. horsfieldii humei [28]. Khi nghiên cứu trên vùng gen CO1 của 10 loài phụ Losaria coon, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng, chúng bao gồm hai loài riêng biệt với 04 loài phụ của L. coon và 06 loài phụ của L. doubledayi [29]. Trong khi các loài phụ của L. coon chỉ giới hạn ở nam Sumatra, đảo Java và Bawean không quá tách biệt về mặt di truyền, thì các loài phụ của L. doubledayi xuất hiện rộng rãi ở các vùng từ bắc Ấn Độ đến bắc Sumatra, có khoảng cách di truyền tương đối tách biệt nhau do tác động bởi các yếu tố địa hình và cây chủ [29]. Bằng cách nghiên cứu trên vùng gen CO1 kết hợp cùng CO2, các nhà khoa học đã chứng minh, hai loài phụ Dodona eugenes formosana và D. e. esakii đặc hữu ở Đài Loan là cùng một loài, và loài này được chứng minh là một loài mới D. formosana tách biệt hoàn toàn với loài D. eugenes trước đó [30]. 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Nghiên cứu mã vạch DNA ở Việt Nam mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Một số khảo sát trên vùng gen CO1 của cá, chim, bò sát đã được thực hiện thành công, giúp xác định tên loài cho các mẫu vật bảo tàng [31, 32, 33] và sản phẩm từ động vật [34, 35, 36], đặc biệt là hỗ trợ xác định mối quan hệ di truyền, qua đó phát hiện các loài mới và ghi nhận mới cho khu hệ động vật Việt Nam [37, 38, 39]. Tuy nhiên, đến nay chỉ mới có duy nhất một nghiên cứu trên nhóm bướm ở nước ta được công bố, và nghiên cứu này đã giúp phát hiện một loài mới cho khoa học, đặc hữu tại khu vực cao nguyên Kon Tum [40]. Việt Nam là quốc gia có sự đa dạng về bướm rất cao, với 1.181 loài thuộc 06 họ đã được ghi nhận, trong đó Nymphalidae (418 loài), Lycaenidae (318 loài) và Hesperiidae (288 loài) là những họ có số lượng phong phú nhất, còn Papilionidae (69 loài), Pieridae (57 loài) và Riodinidae (31 loài) có số lượng tương đối ít [41]. Thống kê trên BOLD hiện có 80 trình tự của 45 loài bướm ngày đã được ghi nhận, chiếm 3,81% tổng số loài đã được mô tả ở Việt Nam (xem Bảng 1.3). Họ Nymphalidae có nhiều loài nhất với 41 trình tự